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Kaltes Atmosphärendruckplasma (CAP) hat in der Therapie an Bedeutung gewonnen und wird zurzeit in verschiedenen Bereichen der Medizin eingesetzt. CAP hat antiproliferative, antimikrobielle und zellstimulierende Wirkungen. Eine therapeutisch vielversprechende Einsatzmöglichkeit vom CAP ist die Behandlung maligner Tumoren. Weiterhin wird CAP klinisch in der Behandlung chronischer Wundheilungsstörungen der Haut eingesetzt.
In dieser Arbeit wurde die antiproliferative Wirkung von CAP auf zwei Haut-assoziierte Zelllinien (HaCaT und B16) untersucht. Anhand der CAP-Exposition und der Analyse der Wachstumskinetiken konnten wir bestätigen, dass die antiproliferative Wirkung von CAP von der Behandlungszeit abhängt. Ferner bestätigten die Ergebnisse, dass die antiproliferative Wirkung in der malignen Zelllinie B16 stärker ausgeprägt ist.
Weiterhin wurde die genotoxische Wirkung von CAP in einem 3D-Epidermismodell, dem epiCS® untersucht. Das Epidermismodell wurde 30s, 60s und 120s mit CAP behandelt (Plasmagerät kINPen MED). Zum Nachweis von DNA- Doppelstrangbrüchen und Apoptose wurden γ-H2AX und Caspase-3 herangezogen. Die fluoreszenzmikroskopische Analyse der Epidermis zeigte keinen höheren Anteil an γ-H2AX oder Capspase-3 positiven Zellen durch die CAP-Exposition. Lediglich waren γ-H2AX und Caspase-3 in beiden Behandlungsgruppen (Argon/CAP) nachweisbar. Ein direkter Zusammenhang zur CAP-Behandlung bzw. zur Behandlungszeit wurde jedoch nicht nachgewiesen.
Insgesamt kann man feststellen, dass die CAP-Exposition nicht zur vermehrten Apoptose in gesunden Epidermiszellen führt. Außerdem kann die CAP-Exposition gesunder Epidermis Zellen bis 120s ohne genotoxische oder zellschädigende Wirkung erfolgen.
Ziel der Arbeit war es Richtwerte für die Hautelastizität sowie die Hauthärte mittels Cutometer® und Reviscometer® (Courage & Khazaka Electronic GmbH, Cologne, Germany) für hautgesunde Patienten zu erstellen. Desweiteren sollte die Einsatzfähigkeit der genannten Geräte im klinischen Alltag zur Beurteilung eines Heilungsverlaufes bei Hauterkrankungen geprüft werden. Dafür wurden 80 Probanden in 6 Altersgruppen an acht verschiedenen Hautstellen untersucht, von denen für 69 die Richtwerte, entsprechend den Untersuchungskriterien (hautgesund, Nichtraucher), ermittelt werden konnten. Dabei zeigten sich die beiden genutzten Geräte von unterschiedlicher Aussagekraft. Mittels Cutometer® ist es möglich die Veränderungen der Haut einfach zu dokumentieren. Bei den erhobenen Werten konnte an einigen Körperstellen eine erwartungsgemäß signifikante Veränderung der Hautelastizität im Alter nachgewiesen werden. Hier ist der Vergleich mit der entsprechenden Altersgruppe notwendig, um eine sinnvolle Aussage über das gemessene Hautareal zu treffen. Ferner ließ sich im Vergleich mit pathologisch veränderter Haut, eine deutliche Veränderung der Elastizität feststellen, so dass die Einschätzung einer Pathologie gut möglich ist. Letztlich ist besonders eine Veränderung des viskoelastischen Verhältnisses zu beobachten gewesen. Dieser Parameter scheint am günstigsten für Untersuchungen zu sein, da er bei den meisten Patholgien deutlich verändert war und im Rahmen der Therapie die größte Veränderung zeigte. Insgesamt lässt sich das Gerät, nach einer entsprechenden Einweisung, sinnvoll im klinischen Alltag nutzen um den Verlauf von Heilungsprozessen darzustellen. Die Richtwerte für die Hauthärte, die mittels Reviscometer® bestimmt wurden, lassen sich ebenfalls nutzen um sie mit pathologisch veränderter Haut zu vergleichen. Der Therapieverlauf ließ sich jedoch nur bedingt sinnvoll darstellen. Zudem lassen sich die Werte schlecht reproduzieren. Ein Einsatz im klinischen Alltag müsste sicher weiter ausgetestet werde, um eine endgültige Aussage über die Anwendbarkeit zu treffen. Die unsichere Handhabung, der kompliziertere Messvorgang sowie die Aussage zu lediglich einem Hautparameter sind definitiv nachteilig. Für eine sinnvolle Arbeit mit dem Reviscometer® scheinen die Erhebung von weiteren Daten und Verbesserung der Handhabbarkeit der Sonde durch den Hersteller notwendig zu sein.
Experimentelle Untersuchungen zur Verkürzung der Einwirkzeit der Hautantiseptik vor Lumbalpunktionen Hintergrund: Eine Einwirkzeit für ein alkoholisches Hautantiseptikum von 10 min auf talgdrüsenreicher Haut ist praxisfremd. Kürzere Einwirkzeiten mit vergleichbarer Wirksamkeit sind daher wünschenswert, wurden bislang jedoch nicht systematisch untersucht. Ziel: Es soll untersucht werden, ob mit geeigneten Hautantiseptika eine Reduktion der Einwirkzeit bei gleicher oder besserer Koloniezahlreduktion möglich ist. Methode: Testung von 5 Prüfpräparaten auf ihre Koloniezahlreduktion an Stirn und Rücken nach 3, 4 bzw. 5 min Einwirkzeit im Doppelblindversuch unter Laborbedingungen an 20 Probanden in Anlehnung an prEN DIN 1500 und DGHM 2001. Nach Vergleich der Wirksamkeit mit dem mitgetesteten Referenzverfahren Auswahl von 2 Mitteln und Testung an 20 Klinikpatienten im Doppelblindversuch unter Praxisbedingungen am Rücken, erneute Mittestung des Referenzverfahrens als Vergleich. Ergebnis: Die Vorwerte am Rücken waren signifikant geringer als an der Stirn. In allen Fällen konnte eine signifikante Koloniezahlreduktion erzielt werden. Im Versuch unter Laborbedingungen waren alle Mittel nach 5 min am Rücken mindestens so effektiv wie die Referenz. An der Stirn waren 4 von 5 getesteten Mitteln nach 5 min mindestens so wirkungsvoll wie die Referenz. Im Praxisversuch ergaben alle Mittel nach 4 min eine der Referenz vergleichbare Reduktion. Schlussfolgerung: Am Rücken findet sich eine geringere Bakteriendichte als an der Stirn. Das sollte in künftigen Überlegungen für die Testung von Hautantiseptika berücksichtigt werden. Mit geeigneten Mitteln ist es möglich, bereits nach 4 min eine sichere, der Referenz entsprechende Hautantiseptik am Rücken vorzunehmen. Das zeigt, dass die momentan praxisfernen Empfehlungen an die gängige Praxis der Antiseptik vor Lumbalpunktionen ohne Verlust von Wirksamkeit oder Sicherheit angepasst werden können.
Einfluss der Plasmabehandlung auf das transepidermale Penetrationsverhalten von Arzneistoffen
(2021)
Zusammenfassung und Ausblick
Die Forschungshypothese, dass eine Plasmabehandlung der Haut mit kaltem
Atmosphärendruckplasma zu einer lokalen Änderung der physikochemischen Eigenschaften des
Stratum corneum und dessen Struktur und (Barriere-)Funktion führt, konnte bestätigt werden.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden morphologisch sichtbare Hautveränderungen, die
Penetrationseigenschaften verschiedener Substanzen vor und nach Plasmabehandlung sowie
Veränderungen der Lipidzusammensetzung des Stratum corneum auf molekularer Ebene analysiert.
Der wesentliche Erkenntnisgewinn der Arbeit besteht im qualitativen und quantitativen Nachweis der
gefahrlosen durch kaltes Atmosphärendruckplasma vermittelten Penetrationssteigerung von
Substanzen in die Haut mit speziellem Fokus auf das Stratum corneum.
Die Plasmabehandlung der Haut mit einem Plasmajet lockert abhängig von der
Plasmabehandlungszeit das aus Corneozyten und einer interzellulären Lipidmatrix bestehende
Stratum corneum auf. Die aufgelockerte Struktur des Stratum corneum ermöglicht eine beschleunigte
Penetration verschiedener, nach Plasmabehandlung applizierter Substanzen durch die Haut (Kapitel
4.2.). Die Penetrationssteigerung variiert dabei abhängig von den Stoffeigenschaften der
penetrierenden Substanz (zum Beispiel Molekülgröße und Lipophilie).
Die morphologische Auflockerung des Stratum corneum spiegelt sich im nach der Plasmabehandlung
veränderten Ceramid-Profil wieder. Die veränderten Barriereeigenschaften in den obersten Schichten
des Stratum corneum nach einer einminütigen Plasmabehandlung lassen sich über die Interaktion von
plasma-produzierten reaktiven Spezies mit Lipiden der Haut (insbesondere Triacylglycerolen) und
die dadurch vermittelte Bildung von Triacylglycerol-Oxidationsprodukten erklären (Kapitel 4.4.).
Eine Plasmabehandlung hat im Bereich der in der Dermatologie für den kINPen MED empfohlenen
Anwendungsdauer von 15 s/cm² bis 1 min/cm² keine negativen Auswirkungen auf die Haut (keine
gesteigerte Anzahl an Apoptosen im Stratum basale, Möglichkeit der Regeneration des
aufgelockerten Stratum corneum von basal, (Kapitel 4.3.)). Längere Behandlungszeiten von 2
min/cm² bis 5 min/cm² können jedoch zu Apoptosen in für die Zellregeneration bedeutenden
Schichten führen.
Im Gegensatz zu anderen Methoden zur transdermalen Penetrationssteigerung besteht bei der Plasma-
vermittelten Penetrationssteigerung auf Grund der antibakteriellen Plasmaeigenschaften und der
Penetrationsbeschleunigung von ausschließlich kleinen Stoffen (Größe unter 689 nm) ein geringeres
Risiko der Infektion der behandelten Hautbereiche durch die Einwanderung von Bakterien und
Pilzen. Die Plasmabehandlung stellt demnach eine zukunftsträchtige Möglichkeit zur gefahrlosen
Penetrationssteigerung von Arzneistoffen durch die Hautbarriere dar.
Da die in dieser Arbeit gewonnenen Daten in vitro mit Hilfe eines Schweineohrmodells ermittelt
wurden, ermöglichen sie einen ersten Einblick in die Reaktion der gesunden menschlichen Haut auf
die Plasmabehandlung, lassen sich jedoch nicht eins zu eins auf die in vivo-Situation am menschlichen
Körper übertragen. Zudem sollte bei der Plasmabehandlung in vivo beachtet werden, dass es am
menschlichen Körper große intra- und interindividuelle Unterschiede in der Beschaffenheit der
Hautbarriere gibt, welche zu unterschiedlich starken Effekten der Plasmabehandlung führen könnten.
Ein Vergleich der Penetrationseigenschaften weiterer Stoffe mit unterschiedlichen hydro- und
lipophilen Stoffeigenschaften sowie unterschiedlichen Molekülgrößen vor und nach
Plasmabehandlung wäre für weitere Forschungsarbeiten empfehlenswert. Auf diese Weise könnte
erforscht werden, auf welche Substanzen die Plasmabehandlung der Haut den größten Einfluss hat
und es wären weitere Rückschlüsse auf die Form der aufgelockerten Bindungen, sowie auf eine
eventuelle Interaktion modifizierter Stratum corneum-Bestandteile mit der penetrierenden Substanz
möglich. Gleichzeitig könnten die Versuche mit längeren Penetrationszeiten wiederholt werden, um
zu überprüfen, ob tatsächlich eine Rechtsverschiebung des Peaks der Konzentration der penetrierten
Substanzen (siehe Kapitel 3.4. und Kapitel 3.5.) in tiefere Hautbereiche stattfindet.
Ein direkter Vergleich penetrationssteigernder Methoden (beispielsweise Mikronadeln und
Plasmajet) wäre interessant, um die verschiedenen Systeme auch quantitativ vergleichen zu können
und zu analysieren, ob die Vorteile der plasmavermittelten Penetrationssteigerung gegenüber der
Mikronadelmethode durch die Menge an penetrierter Substanz ausgeglichen werden können.
Neben den Lipiden könnte auch die Modifikation weiterer Stratum-corneum-Bestandteile ursächlich
für die veränderten Barriereeigenschaften der Haut nach Plasmabehandlung sein. Interessant wäre
deshalb auch die Untersuchung der Stratum-corneum-Peptide und -Proteine vor und nach
Plasmabehandlung.
Um die Reaktion der Haut in vivo auf die Plasmabehandlung besser vorhersagen zu können und damit
die im Rahmen dieser Arbeit erlangten Erkenntnisse in die klinische Praxis übertragen zu können,
sind weitere Studien nötig. Diese könnten die in vitro-Experimente am Schweineohr beispielsweise
auf ein in vivo-Mäusehautmodell übertragen. An einem frischen Mäusehautmodell wäre auch die
Untersuchung längerer Penetrationszeiten sowie die Geschwindigkeit der Hautregeneration und dem
damit Verbundenen Wiederaufbau der Hautbarriere nach Plasmabehandlung möglich.
Nach einer Verifizierung der Ergebnisse in vivo könnten die im Rahmen dieses Projekts gewonnenen
Erkenntnisse in Zukunft auf den klinischen Alltag übertragen werden. Für Langzeittherapien bei
speziellen Patientengruppen mit Problemen bei der oralen Medikamentenaufnahme (beispielsweise
in Form von Resorptionsstörungen im Magen-Darm-Trakt) oder bei einem starken First-Pass-Effekt
des Medikaments in der Leber ist die transdermale Medikamentenapplikation eine
Ausweichmöglichkeit, welche durch eine vorherige Plasmabehandlung der Haut noch verbessert
werden würde.
Im Rahmen des bereits etablierten medizinischen Anwendungsfelds von kaltem
Atmosphärendruckplasma bei der Behandlung chronischer Wunden könnte eine Plasmabehandlung
der Wundränder und angrenzender gesunder Hautbereiche die Penetration von nach der Behandlung
applizierten wundheilungsfördernden Cremes und Gels im betroffenen Gebiet beschleunigen und so
die Heilungsaussichten noch weiter verbessern.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Reaktion primärer dermaler Fibroblasten, die für die Versuche aus SKH1-Mäusen isoliert wurden, auf eine Kaltplasma-Behandlung mittels des Argon-betriebenen Plasmajets „kINPen MED“ hinsichtlich ihrer Reaktion auf oxidativen Stress, ihrer interzellulären Kommunikation über Gap Junctions (GJ) und der Organisation ihres Aktin-Zytoskeletts untersucht werden. Die Plasmabehandlung erfolgte dabei stets indirekt, also durch die Behandlung von Zellkulturmedium, in dem die Zellen anschließend inkubiert wurden. Es ergab sich für die angewendeten Versuchsmodalitäten keine signifikante Induktion von Apoptose durch die indirekte Plasmabehandlung von 20 s bis 180 s, wohingegen die metabolische Aktivität der Zellen bei längeren Behandlungszeiten bis 72 h nach der Plasmabehandlung signifikant reduziert wurde. Dies zeigt die von der Behandlungszeit abhängige Beanspruchung der Fibroblasten durch die Plasmabehandlung und gleichzeitig ihre Kompensationsfähigkeit, die die Zellen auch bei 180 s Behandlungszeit vor dem vermehrten Auftreten von Apoptose schützen konnte.
Nach einer Plasmabehandlung konnte die Aktivierung des Nrf2-Signalwegs nachgewiesen werden, der als zellulärer Schutzmechanismus gegen oxidativen Stress fungiert. So wurde sowohl in den Fibroblasten als auch im Primärgewebe eine Translozierung des Nrf2 in den Zellkern gezeigt. Hierbei wurde auch die Aktivierung des Redox-Sensors Keap1 nachgewiesen, der unter physiologischen Bedingungen Nrf2 bindet und dessen Abbau im Proteasom vermittelt.
Ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit lag in der Untersuchung der Zell-Zell-Kommunikation, die vor allem über funktionale GJ-Kanäle erfolgt. Dabei wurde in einem SLDT Assay die Zunahme funktionaler GJ-Kanäle in plasmabehandelten Fibroblasten festgestellt. Außerdem ergab sich eine Tendenz zum Anstieg der Gen- und Proteinexpression von Connexin 43, was unter physiologischen Bedingungen in dermalen Fibroblasten während der Frühphase der Wundheilung beschrieben wurde.
Die Plasmabehandlungen induzierten außerdem strukturelle Veränderungen am Aktin-Zytoskelett in den dermalen Fibroblasten. Solche dynamischen Veränderungen des Zytoskeletts sind während der Wundheilung ebenfalls von entscheidender Bedeutung, da sie die interzelluläre Adhäsion und damit die Migration von Fibroblasten ermöglichen.
Die hier beobachteten Veränderungen zeigten sich vor allem bei kürzeren Behandlungs- und Inkubationszeiten, während gleichzeitig keine signifikante Zunahme apoptotischer Zellen festgestellt wurde. Dies legt nahe, dass durch kurze Plasmabehandlungszeiten in primären Fibroblasten ein Hormesis-Effekt induziert wird, also dass die zeitlich begrenzte Aktivierung zellulärer Schutzmechanismen als Reaktion auf den Stress einer Plasmabehandlung (Radikalbildung, UV-Strahlung) günstige, die Wundheilung fördernde Effekte bewirkt.