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Abbau von Phenylalkanen und weiteren alkylsubstituierten Aromaten durch Hefen und filamentöse Pilze
(2009)
Gegenstand der vorliegenden Arbeit war es, den Abbau von Phenylalkanen durch eukaryotische Mikroorganismen, insbesondere Pilze, zu untersuchen. Im Focus der Dissertation lagen dabei Untersuchungen mit der Hefe Trichosporon asahii SBUG-Y 833. Des Weiteren erfolgten Analysen mit Candida maltosa SBUG Y 700, Trichosporon mucoides SBUG Y 801 und neun filamentösen Pilzen der Gattungen Cunninghamella, Fusarium, Lecanicillium, Mucor, Penicillium, Sporothrix und Umbelopsis. Als Substrate wurden Phenylalkane mit fünf bis zehn und zwölf Kohlenstoff-Atomen in der Alkylseitenkette eingesetzt. Zur Charakterisierung der Abbau- und Transformationsleistungen der Hefen, insbesondere von T. asahii, erfolgten darüber hinaus Biotransformationsexperimente mit Phenylalkan-Derivaten und aromatischen Säuren. Candida maltosa 1. Mit der Hefe C. maltosa, die zur Assimilation von n Alkanen befähigt ist, konnte ein Wachstum mit Phenylalkanen (0,5 % [v/v]), deren Alkylseitenkette mindestens 8 Kohlenstoff-Atome aufwiesen, ermittelt werden. 2. In Biotransformationsexperimenten mit ungeradzahligen Phenylalkanen (Phenylheptan und Phenylnonan) konnte eine kontinuierliche extrazelluläre Akkumulation von Benzoesäure nachgewiesen werden. Phenylalkane mit einer geraden Anzahl von Kohlenstoff-Atomen in der Alkylseitenkette (Phenylhexan, Phenyloctan, Phenyldecan und Phenyldodecan) werden via Phenylbuttersäure und 4 Phenyl 3-butensäure zu Phenylessigsäure abgebaut, die ebenso wie Benzoesäure extrazellulär angereichert wird. 3. C. maltosa ist nicht zur weiteren Oxidation von Benzoesäure und Phenylessigsäure befähigt und akkumuliert daher diese Säuren während des Phenylalkan-Abbaus als dead-end-Produkte. Trichosporon asahii 1. In Wachstumsexperimenten mit T. asahii konnte gezeigt werden, dass die Hefe n Alkane (n Dodecan, n Tetradecan, n Hexadecan) und Phenylalkane mit mindestens sieben Kohlenstoff-Atomen in der Alkylseitenkette assimilieren kann. 2. In Biotransformationsexperimenten mit ruhenden Zellen und Phenylheptan konnten anhand von HPLC-, GC-MS- und z. T. NMR-Analysen neun Produkte identifiziert werden: 7 Phenylheptansäure, 7-(2 Hydroxyphenyl)-heptansäure, 3 (2 Hydroxyphenyl) propionsäure, Benzoesäure, 3,4 Dihydroxybenzoesäure, Cumarin, 4 Hydroxycumarin, 4,6 Dihydroxycumarin und 4,8 Dihydroxy-cumarin. 3. Die Bildung der Metaboliten 2 Hydroxyphenylheptansäure und 2 Hydroxyphenylpropionsäure sowie der Cumarine konnte erstmals durch die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit für den mikrobiellen Abbau von Phenylalkanen beschrieben werden. Die hydroxylierten Cumarine 4 Hydroxy-, 4,6 Dihydroxy- und 4,8 Dihydroxycumarin wurden bis Versuchende kontinuierlich im Inkubationsmedium akkumuliert, während die übrigen sechs Produkte nur zwischenzeitlich durch die Hefe ausgeschieden wurden. Die Inkubation von T. asahii mit Phenyloctan führte dagegen nur zum Nachweis der hydroxylierten Cumarine. In Biotransformationsexperimenten mit Phenylnonan, Phenyldecan und Phenyldodecan konnte als einziger Metabolit 4 Hydroxy-cumarin detektiert werden. Die für andere Hefen typischen Abbauprodukte wie Benzoesäure und Phenylessigsäure wurden durch diese Aromaten verwertende Hefe nicht akkumuliert. 4. Die Bildung von 4 Hydroxycumarin konnte auch in Biotransformationsexperimenten mit Phenylheptansäure, 2 Hydroxyphenyl-propionsäure, trans 2 Hydroxyzimtsäure sowie Cumarin nachgewiesen werden. Während die Transformation der zwei ortho-hydroxylierten Säuren in Ausbeuten von über 70 % 4 Hydroxycumarin innerhalb von 24 h resultierte, wurden nur 9,4 % der Phenylheptansäure und ca. 13 % des Cumarins in 4 Hydroxycumarin transformiert. 6. Im Hinblick auf die medizinische Bedeutung der Cumarine wurde die Bildung von Cumarinen aus den Präkursor-Stoffen 2,4 Dihydroxyphenylpropionsäure und 7 Hydroxycumarin durch T. asahii geprüft. Dabei konnte 4,7 Dihydroxycumarin während der Inkubation mit 2,4 Dihydroxyphenyl-propionsäure und 7 Hydroxycumarin nachgewiesen werden und zusätzlich 6,7 Dihydroxycumarin mit 7 Hydroxycumarin als Substrat. Eine 20-fache Steigerung der 6,7 Dihydroxycumarin-Konzentration wurde mit Zellen einer Phenol-Kultur im Vergleich zu Zellen, die mit Hefeextrakt kultiviert wurden, erreicht, was auf die Beteiligung einer induzierbaren Phenolhydroxylase hindeutet. 7. Unter Verwendung des Cytochrom P450-Inhibitors 1 Aminobenzotriazol konnte eine Beteiligung von Cytochrom-P450-Enzymen an der ortho-Hydroxylierung des Benzenrings von Phenylalkanen bzw. alkylsubstituierten aromatischen Säuren ermittelt werden. Diese Reaktion ist neben der Einführung einer Doppel-bindung in der Alkylseitenkette eine wesentliche Voraussetzung für die Bildung von Cumarinen. 8. Während der Inkubation von T. asahii mit dem Phenylheptan-Derivat Heptanophenon wurden primär Metaboliten detektiert, die am C1-Atom der Alkylseitenkette eine Hydroxy-Gruppe aufweisen und/oder subterminal am C4-, C5- und C6-Atom oxidiert sind. Aufgrund der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit konnte für Hefen erstmals eine subterminale Oxidation von gesättigten Alkylketten nachgewiesen werden. Trichosporon mucoides 1. In den Untersuchungen mit T. mucoides konnte gezeigt werden, dass die Hefe nicht zur Assimilation von n Alkanen (n Dodecan, n Tetradecan, n Hexadecan) befähigt ist. Die Kultivierung mit Phenylnonan und Phenyldecan führte zwar nur zu einer geringen, dennoch signifikanten Zunahme der Biomasse. 2. Obwohl T. mucoides keine n Alkane verwerten kann, wurden in Biotransformationsexperimenten mit Phenylalkanen Metaboliten detektiert, die nicht nur aus terminalen und ß Oxidationsreaktionen an der Alkylseitenkette hervorgegangen sind, sondern auch subterminalen und am Ring stattfindenden Reaktionen zugeschrieben werden konnten. Das Metabolitenspektrum, das in den Untersuchungen mit Phenylalkanen und aromatischen Säuren ermittelt wurde, glich im Allgemeinen dem von T. asahii. Filamentöse Pilze 1. Mit Ausnahme von Penicillium chrysogenum zeigten alle Stämme der getesteten filamentösen Pilze die Fähigkeit zum Wachstum mit Phenyldodecan. Eine besonders starke Zunahme der Biomasse war dabei mit Sporothrix nivea SBUG M 35 und Umbelopsis isabellina SBUG M 1145 zu verzeichnen. Phenylalkane mit kürzeren Alkylseitenketten konnten von den meisten der untersuchten Pilze kaum bzw. nicht als Wachstumssubstrate genutzt werden. 2. In Biotransformationsexperimenten mit C. elegans, M. hiemalis und U. isabellina konnten 5 neuartige Metaboliten identifiziert werden: Zimtaldehyd, Zimtalkohol, Phenylpropanol und Benzylalkohol (deren Bildung wird auf reduktive Reaktionen der entsprechenden Carbonsäuren zurückgeführt) sowie ein Glycinamid der Zimtsäure, das eine Art Konjugat darstellt. 4. Während der Inkubation der filamentösen Pilze Sp. nivea SBUG-M 25 und SBUG M 242 sowie C. elegans und U. isabellina mit Phenylheptan wurde – analog zu Versuchen mit T. asahii - auch 4 Hydroxycumarin als Metabolit nachgewiesen.
Kunststoffähnliche Polymere wie Polyhydroxyalkanoate (PHA) fanden in den letzten Jahren immer größere Berücksichtigung zur Substitution von Kunststoffen. Die attraktivsten Vertreter dieser Biopolymere sind dabei das Poly-3-hydroxybutyrat (PHB),das Poly-3-hydroxyvalerat (PHV) und das Poly-3-hydroxybutyrat-co-3-hydroxyvalerat(PHBV). Für eine kostengünstige Herstellung von PHA sind allerdings biotechnologisch etablierte Erzeuger notwendig. Für eine umweltfreundliche Produktion bieten sich Hefen an. Viele Hefen sind im Gegensatz zu den PHA-synthetisierenden Prokaryoten weder virulent noch pathogen. Allerdings verfügen sie nicht über die notwendige genetische Ausstattung zur PHA-Synthese. In der vorliegenden Arbeit wurden die Gene der PHB- bzw. PHBV-Synthese aus Cupriavidus necator und Methylobacterium extorquens in das Hefegenom von Arxula adeninivorans integriert. Es wurden die Gene phbA (kodiert für eine ß-Ketothiolase), phbB (kodiert für eine Acetoacetyl-CoA-Reduktase) und phbC aus C. necator sowie phaC aus M. extorquens genutzt, wobei die beiden letzteren für PHA-Synthasen kodieren. Für die Integration dieser PHA-Gene wurden sog. YIEC (Yeast Integration Expression Cassettes) konstruiert, mit welchen die Gene in die 25S-rDNA von A. adeninivorans integriert werden konnten. Es wurden jeweils die PHA-Synthasegene phaC oder phbC mit phbA und phbB aus Cupriavidus necator integriert. Dadurch entstanden die sog. 3-fach-Transformanten (3-fach/phaC und 3-fach/phbC). Ebenso wurden die PHA-Synthasegene einzeln integriert, wodurch die sog. 1-fach-Transformanten (1-fach/phaC und 1-fach/phbC) entstanden. Im Mittelpunkt der durchgeführten Arbeiten standen die Bestimmungen der Enzymaktivitäten der rekombinanten PHA-Synthasen, die Determinierung von PHA sowie die Untersuchungen der Veränderungen der Stoffwechselintermediate durch die Integration der PHA-Gene. Bevor die vier PHA-Transformanten generiert worden waren, waren in einer Machbarkeitsstudie die PHA-Gene phbA und phbB integriert und die Expression der rekombinanten Enzyme mit Enzymaktivitätsassays nachgewiesen worden. In den vier verwendeten PHA-Transformanten (1-fach/phaC, 1-fach/phbC sowie 3-fach/phaC und 3-fach/phbC) wurden phbAp und phbBp mittels spezifischer Antikörper nachgewiesen. Die Expression der PHA-Synthasegene wurde in den PHA-Transformanten durch Enzymaktivitätsassays vorgenommen. Die PHA-Transformanten wurden mit Glukose, Acetat, Ethanol, Propion- und Buttersäure alleinig und im Shift von Glukose auf eine andere Kohlenstoffquelle kultiviert. Dabei wurde festgestellt, dass Ethanol generell von den PHA-Transformanten nicht verwertet werden kann. Parallel zu den Analysen des Wachstumsverhaltens wurden die Enzymaktivitätsassays durchgeführt. Dabei konnten neben der Glukosekultivierung erstmals auch bei Acetatkultivierung Aktivitäten der rekombinanten PHA-Synthasen nachgewiesen werden. Sowohl bei der Glukose- als auch der Acetatkultivierung zeigten die vier PHA-Transformanten verschiedene Verläufe der Aktivitäten. Für die Transformante, in welche das PHA-Synthasegen phaC aus Methylobacterium extorquens integriert worden war (1-fach/phaC), wurden sowohl für die Glukose- als auch die Acetatkultivierung die Aktivitätswerte für die PHA-Synthasen bestimmt. Für die Transformante, welche das PHA-Synthasegen phbC aus Cupriavidus necator trägt (1-fach/phbC), konnten nur bei Glukosekultivierung PHA-Synthaseaktivitäten bestimmt werden. Diese wurden während der Kultivierung geringer. Für die 3-fach-Transformante 3-fach/phaC konnten PHA-Synthaseaktivitäten sowohl für die Glukose- als auch die Acetatkultivierung bestimmt werden, die während der beiden Kultivierungen geringer wurden. Für die Transformante, welche alle drei PHA-Gene inklusive des PHA-Synthasegens phbC (3-fach/phbC) trägt, wurden während der Glukosekultivierung gleich bleibende und während der Kultivierung mit Acetat stark steigende PHA-Synthaseaktivitäten ermittelt. Mit einer Färbemethode sollte in den 1-fach-Transformanten PHB nachgewiesen werden. Dazu wurden die Farbstoffe BODIPY 493/503 und Nilrot, die speziell intrazelluläres PHB bzw. Neutrallipide färben, verwendet. Es konnte mit BODIPY 493/503 kein intrazellulär eingelagertes PHB detektiert werden. Daher handelt es sich bei den Einlagerungen um Lipide. Für eine genauere Analyse der die durch die Integration der PHA-Gene entstehenden Stoffwechselprodukte wurde eine GC/MS-Methode entwickelt. In ersten Messungen zeigte sich für die PHA-Transformanten ein Peak, der die gleiche Retentionszeit wie 3-Hydroxyvalerat (3HV), das Monomer von PHV hatte. Dieser Peak wurde auch im Kontrollstamm G1212k detektiert. Da Cupriavidus necator mit der Kohlenstoffquelle Lävulinsäure (LäS) das PHA Poly-4-hydroxyvalerat produziert, wurde Lävulinsäure in der gaschromatographischen Methode als Referenzsubstanz eingesetzt. Dabei zeigte sich, dass LäS die gleiche Retentionszeit hat wie 3HV. Anschließend wurden die Massenspektren von 3-Hydroxybutyrat (3HB), dem Monomer von PHB, sowie 3HV und LäS verglichen. Dabei erwies sich, dass der Peak gleicher Retentionszeit nicht für 3HB oder 3HV steht, sondern für LäS. Es konnten somit in keiner der PHA-Transformanten 3HB oder 3HV nachgewiesen werden. Anhand der GC/MS-Daten wurde allerdings ersichtlich, dass die Integration aller drei PHA-Gene den Stoffwechsel der Hefe A. adeninivorans stärker beeinflusst als die alleinige Integration der PHA-Synthasegene. Daher wurden Citrat, Succinat, Malat und Fumarat (als Summenparameter für Maleinsäure und Fumarsäure) sowie die Fettsäuren Palmitin-, Stearin- und Linolensäure als weitere Referenzsubstanzen eingesetzt. Es zeigten sich je nach Wahl der Kohlenstoffquelle und der Kultivierungsbedingungen Unterschiede zwischen 3-fach-Transformanten und Kontrollstamm G1212k. In der Glukosekultivierung als auch der Co-Kultivierung von Glukose und Acetat (1:2) konnten die meisten Unterschiede zwischen PHA-Transformanten und G1212k festgestellt werden. Es wurden z. B. für die Glukosekultivierung in den 3-fach-Transformanten höhere Gehalte an Fettsäuren detektiert. Daraus lässt sich eine unterstützende Wirkung der rekombinanten Proteine der PHA-Synthese zur Fettsäurebiosynthese ableiten. Bei der Acetatkultivierung wird neben der PHA-Synthese und der Fettsäurebiosynthese das zentrale Zellintermediat Acetyl-CoA auch im Glyoxylatweg genutzt. Der Glyoxylatweg findet zwar in den Peroxisomen und nicht wie PHA- und Fettsäuresynthese im Zytosol statt, wird aber in Abhängigkeit von der Kohlenstoffquelle und durch die Aktivitäten des Zitronensäurezyklus geregelt. Die höheren Gehalte an Citrat bei der Co-Kultivierung von Glukose und Acetat (1:2) geben daher einen Anhaltspunkt zur Nutzung des Glyoxylatweges. Aufgrund der erhöhten Fettsäuregehalte während der Glukosekultivierungen und der Nutzung des Glyoxylatweges bei Kultivierung mit Acetat wird ersichtlich, dass die Integration aller drei PHA-Gene dazu führt, dass vermehrt Acetyl-CoA genutzt und Acetoacetyl-CoA, das erste Zwischenprodukt der PHA-Synthese, gebildet wird. Im Zytosol der Zellen findet aber auch der Mevalonatweg für die Isoprensynthese statt. Daher liegt sowohl eine Konkurrenz um Acetyl-CoA als auch um Acetoacetyl-CoA vor. Diese Konkurrenzen führen dazu, dass keine PHA-Synthese in den PHA-Transformanten stattfindet. Deswegen wird postuliert, dass stattdessen die Fettsäuresynthese, der Glyoxylatweg und der Mevalonatweg unterstützt werden. Intensivere Untersuchungen der Stoffwechselwege in A. adeninivorans müssen noch klären wie Zitronensäurezyklus und Glyoxylatweg sowie Fettsäure- und Isoprensynthese in dieser Hefe gesteuert werden können, um ein „metabolic engineering“ zur PHB-Synthese, wie es in S. cerevisiae bereits möglich ist, auch in A. adeninivorans zu realisieren. Dazu müssen nach der Expression der rekombinanten Proteine der PHA-Synthese auch die Intermediate der Stoffwechselwege gezielter nutzbar und konkurrierende Enzymaktivitäten inhibiert werden.