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Hantaviren gehören zu den „Emerging Viruses“ mit einer weltweiten Verbreitung. Sie sind Erreger von Zooanthroponosen und werden von Nagetieren auf den Menschen übertragen. Humane Hantavirusinfektionen können je nach Erreger schwerwiegende Erkrankungen mit einer Letalitätsrate von bis zu 50 % hervorrufen. In den Jahren 2004/2005, 2007 und auch in diesem Jahr wurde in einer Reihe europäischer Staaten, einschließlich Deutschland, ein deutlicher Anstieg der Zahl der humanen Hantavirusinfektionen beobachtet. In Deutschland waren hauptsächlich Baden-Württemberg, Bayern, Niedersachsen und Nordrhein-Westfalen betroffen. Zu den Risikogruppen zählen Personen, welche aufgrund ihres Berufes in engen Kontakt zu dem Reservoirwirt und dessen Ausscheidungs¬produkten kommen und somit auch gegenüber den Viren besonders exponiert sind. Die Hanta¬virus¬diagnostik basiert größtenteils auf serologischen Nachweismethoden wie Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) und Western Blot-Tests. Um humane Hantavirusinfektionen in Deutschland mit hoher Sensitivität und Spezifität zu diagnostizieren, wurden in dieser Arbeit serologische Testverfahren für die in Europa vorkommenden Hantaviren Dobrava-Belgrad-Virus (DOBV), Puumalavirus (PUUV) und Tulavirus (TULV) etabliert und validiert. Weiterhin wurden Protokolle zur Durchführung seroepidemiologischer Studien und für den Einsatz der neuen Testsysteme in der Diagnostik entwickelt. Gemäß dieser Protokolle wurden die Tests bei seroepidemiologischen Untersuchungen eingesetzt und lieferten Auf¬schluss über die Hantavirusprävalenz in verschiedenen Bevölkerungsgruppen in unter¬schiedlichen Gebieten Deutschlands. Auf der Basis Hefe exprimierter Nukleokapsidproteine (N-Proteine) von PUUV, Stamm Vranica-Hällnäs (PUUV-Vra) und Stamm Niederbayern (PUUV-Bava), DOBV, Stamm Slovenia (DOBV-Slo), und TULV, Stamm Moravia wurden ELISA und Western Blot-Tests zum Nachweis von humanen IgM- und IgG-Antikörpern entwickelt. Die Validierung mit deutschen und internationalen Seren ergab für die neuen Tests eine Sensitivität zwischen 94 % und 100 % und eine Spezifität von 96-100 %. Bei der Validierung der Tests mit Seren aus Finnland erreichte die Sensitivität 89-100 % und die Spezifität 95-100 %. Der Anteil an Seren, bei denen keine eindeutige Einteilung in „reaktiv“ oder „nicht reaktiv“ erfolgen konnte, lag bei maximal 2,7 %. Die indirekten DOBV-Slo- und PUUV-Vra-IgG/IgM-ELISA und Western Blot-Tests wurden durch INSTAND e.V. im März, September 2009 und April, September 2010 zertifiziert. Die TULV spezifischen Tests konnten aus Mangel an Referenztests und damit fehlender Referenzseren nicht validiert werden. Für die epidemiologischen Studien wurde das indirekte ELISA-Format eingesetzt, da das capture ELISA-Format in seiner diagnostischen Sensitivität schlechter als das indirekte Format abgeschnitten hatte. Die jeweiligen Western Blot-Tests und Immunfluoreszenztests dienten als Bestätigungstest. Die seroepidemiologische Studie bei 484 humanen Serumproben aus einem PUUV-Endemiegebiet in Niedersachsen zeigte eine Hanta-virusprävalenz von 7 %. Dieser Wert entspricht etwa dem Vierfachen der durchschnitt¬lichen Prävalenz des gesamten Bundesgebietes (1-2 %). Die Untersuchung von 178 Personen aus einem PUUV-Ausbruchsgebiet in Bayern ergab eine Hantavirusseroprävalenz von etwa 11 %. Interessanterweise waren 40 % der positiv getesteten Seren aus¬schließlich mit dem TULV-Antigen reaktiv. Es wurden auch die Seren von 208 in Bayern statio¬nierten Soldaten untersucht. Obwohl diese zu einer der Risikogruppen gehören, lag die Hantavirusprävalenz lediglich bei 2 %. Dagegen ergab eine Studie bei Wald¬arbeitern aus Branden¬burg dass 9 % der 563 ge¬testeten Personen Hantavirus spezifische Antikörper besaßen. Von diesen waren 43 % aus¬schließlich in den TULV-Tests reaktiv und 33 % reagierten exklusiv mit dem DOBV-Slo-Antigen. Eine ¬epidemiologische Studie bei Primaten aus dem deutschen Primatenzentrum in Göttingen zeigte, dass 12 % von den 251 getesteten Tieren mit mindestens einem der verwen¬deten Antigene reagierten. Dies stellt den ersten Nachweis von natürlichen Hantavirusinfektionen bei Primaten dar. Die Ergebnisse der epidemiologischen Studien zeigen die Bedeutung der Verwendung „homologer“ Antigene für eine hochsensitive serologische Diagnostik. Aus diesem Grund sollte zukünftig das PUUV-Bava Antigen für den serologischen Nachweis von Hantavirusinfektionen in Deutschland eingesetzt werden. Die epidemiologische Bedeutung des TULV muss weiter erforscht werden. Daher sollten bei zukünftigen epidemiologischen Studien die jeweiligen Serumproben auch auf TULV reaktive Antikörper untersucht werden. Mit den hier entwickelten serologischen Testverfahren wird es zukünftig möglich sein, Hantavirusinfek¬tionen mit hoher Sensitivität und Spezifität zu diagnostizieren.
Phospholipide wie Phosphatidylinositol und Phosphatidylcholin sind essenzielle Bestandteile aller biologischen Membranen und für deren Integrität und Funktion unerlässlich. Sind Inositol und Cholin (IC) im Medium vorhanden, ist die Hefe Saccharomyces cerevisiae in der Lage, diese aufzunehmen und zu verarbeiten. Unter Mangelbedingungen können diese Stoffe von der Zelle selbst synthetisiert werden. Daher ist es sinnvoll, die Phospholipid¬biosynthese-Gene differenziell zu exprimieren, was auf der Ebene der Transkriptions¬initiation geschieht. Bei IC-Mangel werden die Gene (z. B. das Inositol-3-Phosphat Synthase Gen INO1) durch Bindung des heterodimeren Aktivatorkomplexes Ino2/Ino4 an das Promotorelement ICRE („inositol/ choline responsive element“) aktiviert, um die Biosynthese zu gewährleisten. Sowohl Ino2 als auch Ino4 sind für die ICRE-Bindung nötig, während die transkriptionale Aktivierung nur durch Ino2 mit Hilfe zweier Transkriptionsaktivierungsdomänen TAD1 und TAD2 vermittelt wird. Ist dagegen ausreichend IC vorhanden, werden die Gene reprimiert, indem der Repressor Opi1 an den Aktivator Ino2 bindet, sodass es zu einer Konformationsänderung kommt und eine Dimerisierung mit Ino4 nicht mehr möglich ist.
Um eine erfolgreiche Transkriptionsinitiation zu gewährleisten, bilden neben der RNA-Polymerase II eine Reihe genereller Transkriptionsfaktoren (A, B, D, E, F und H) sowie der Mediatorkomplex im Promotorbereich der Zielgene den sog. Präinitiationskomplex (PIC). Die von diesen basalen Faktoren gewährleistete geringe Grundexpression kann von Aktivatorproteinen, die an positiv-regulatorische Elemente („upstream activation site“, UAS) binden, deutlich verstärkt werden. Hierzu nutzen Aktivatorproteine verschiedene Mechanismen, zu denen die Auflockerung der Chromatinstruktur durch Histonmodifikationskomplexe wie SAGA oder Chromatinremodellierungskomplexe wie SWI/SNF, die bessere Bindung der Transkriptionsfaktoren am Basalpromotorbereich oder die Beschleunigung des Übergangs vom geschlossenen zum offenen PIC gehören.
Im Verlauf dieser Arbeit konnten zahlreiche Interaktionen zwischen dem Aktivator Ino2 und Faktoren der Transkriptionsmaschinerie nachgewiesen werden, die vermutlich die Häufigkeit der Trans¬kriptions-initiation beeinflussen. Einige der Untereinheiten des Transkriptionsfaktors TFIID interagie¬ren mit Ino2. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Charakterisierung der Interaktion der Ino2-TAD1 mit Taf1 und Taf12. Der Austausch der Aminosäuren Asparaginsäure-20 und Phenyl¬alanin-21 in Ino2 führte zu einem Interaktionsausfall mit beiden Tafs. In Taf1 konnten zwei basisch-hydro¬phobe Aminosäure-Bereiche (K206 Y207 und L208 L209 K210) innerhalb der minimalen Aktivator¬binde¬domäne 2 (ABD2) identifiziert werden, die kritisch für den Kontakt zum Aktivator sind. Es konnte ferner gezeigt werden, dass basische und hydrophobe Aminosäuren in Kombination für die Bindung an den Aktivator verantwortlich sind und dass der Austausch gegen Alanin (KY-AA) zu einem Abfall der Expression des INO1-Gens auf 44% führt. Darüber hinaus konnte der Bromo¬domänen¬faktor Bdf1 als Interaktionspartner von Ino2 identifiziert werden. Bdf1 vervollständigt Hefe-Taf1, während Säuger-Taf1 selbst Bromodomänen zur Erkennung von Histonacetylierungen beinhaltet. Innerhalb der Taf12-Minimaldomäne sind die Aminosäuren K150 L151 R175 und L176 wesentlich für die Bindung an Ino2. Eine Teildeletion von Taf12, die unter anderem den Verlust dieser Aminosäuren zur Folge hat, führt zu einer auf 76% reduzierten INO1-Expression.
Ein weiterer Transkriptions¬faktor, der von Ino2 kontaktiert wird, ist TFIIA mit seinen Untereinheiten Toa1 und Toa2. Die Proteine kontaktieren beide TADs des Aktivators, allerdings konnten innerhalb der minimalen Interaktionsdomänen der Toa-Proteine keine für diese Interaktion verantwortliche Aminosäuren identifiziert werden. Veränderungen der Toa1-Sequenz hatten keinen phänotypischen Einfluss auf die Phospholipidbiosynthese, allerdings führten einige Veränderungen (RKRK-Motiv im AS-Bereich 253-259) zu letalen Folgen für das Wachstum der Zellen, weil die Bildung des TFIIA-TBP-TATA-Komplexes beeinträchtigt ist. Wahrscheinlich hat die Interaktion zwischen Ino2 und TFIIA eine verstärkende Wirkung auf die Transkriptionsinitiation der Phospholipidbiosynthese-Gene, indem die Interaktion zwischen TFIIA und TFIID stabilisiert wird und TFIIA die interaktive Oberfläche am Promotor für Interaktionen mit anderen Proteinen vergrößert.
Die Verschiebung der Nucleosomen in Promotorbereichen durch Chromatinremodellierungs¬kompexe wie SWI/SNF ist ein weiterer Mechanismus der Transkriptionsaktivierung. In früheren Arbeiten wurde bereits die Interaktion zwischen Ino2, Aro80 bzw. Gal4 und der SWI/SNF ATPase-Untereinheit Swi2 beschrieben. Im Zuge dieser Arbeit konnte eine minimale Interaktionsdomäne im AS-Bereich 238-307 kartiert werden. Essenzielle Aminosäuren für die Bindung an Ino2 und andere Aktivatoren konnten nicht identifiziert werden.
Sug1 und Sug2 sind ATPasen der regulatorischen 19S-Untereinheit des 26S Proteasoms. Neben der Degradation fehlgefalteter polyubiquitinierter Proteine haben sie auch eine nicht-proteolytische Bedeutung für die Transkriptionsinitiation. Bekannt ist, dass proteasomale ATPasen an aktiven Promotoren zu finden sind und mit Aktivator¬proteinen (z. B. Gal4) interagieren können. Die vorlie¬gende Arbeit zeigt, dass auch Ino2 von Sug1 und Sug2 kontaktiert wird. Möglicherweise dienen sie am INO1-Promotor als Stabilisatoren und Vermittler zwischen Ino2 und der Transkriptionsmaschi¬nerie und erleichtern den Übergang des Präinitiationskomplexes in den Elongationskomplex.
Unter reprimierenden Bedingungen bindet Opi1 an Ino2 und rekrutiert die Corepressorkomplexe Sin3 und Cyc8/Tup1, die ihrerseits Histondeacetylasen in Promotornähe bringen und die Transkrip¬tion durch lokale Chromatinverfestigung reprimieren. Frühere Arbeiten hatten gezeigt, dass die Corepressoren auch mit Ino2 und weiteren Aktivatoren (Hac1 und Pho4) interagieren und dass sie in Abhängigkeit von Ino2, nicht aber von Opi1, am INO1-Promotor vorliegen. In dieser Arbeit wurde die Interaktion zwischen Ino2 und Sin3 bzw. Cyc8 charakterisiert. Sin3 und Cyc8 kontaktieren einen Bereich des Aktivators, der die TAD2 und die RID (Repressorinteraktionsdomäne) enthält. Es war bekannt, dass die Aminosäuren Phenylalanin-130, Leucin-131 und Asparaginsäure-132 essenziell für die Interaktion mit Opi1 sind. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass deren Austausch gegen Alanin auch einen Interaktionsverlust mit Cyc8 und Sin3 bewirkt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass diese FLD-AAA-Mutation zu einer praktisch konstitutiven Expression des INO1-Gens führt, allerdings auf niedrigerem Niveau als im Fall dereprimierter Zellen mit einem Wildtyp Ino2. In Hac1 und Pho4 konnten Aminosäuren mit vergleichbarer Bedeutung für die Corepressorbindung nicht identifiziert werden. Offenbar können die Corepressoren je nach physiologischer Situation in der Zelle positiv oder negativ auf die Transkriptionsinitiation wirken.