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Reduction and oxidation reactions are essential for biochemical processes. They are part of metabolic pathways and signal transduction. Reactive oxygen species (ROS) as second messengers and oxidative modifications of cysteinyl (Cys) residues are key to transduce and translate intracellular and intercellular signals. Dysregulation of cellular redox signaling is known as oxidative distress, which has been linked to various pathologies, including neurodegeneration. Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative pathology linked to both, abnormal amyloid precursor protein (APP) processing, generating Aβ peptide, and Tau hyperphosphorylation and aggregation. Signs of oxidative distress in AD include: increase of ROS (H2O2, O2•−), decrease of the levels or activities of antioxidant enzymes, abnormal oxidation of macromolecules related to elevated Aβ production, and changes in mitochondrial homeostasis linked to Tau phosphorylation. Interestingly, Cys residues present in APP form disulfide bonds that are important for intermolecular interactions and might be involved in the aggregation of Aβ. Moreover, two Cys residues in some Tau isoforms have been shown to be essential for Tau stabilization and its interaction with microtubules. Future research will show the complexities of Tau, its interactome, and the role that Cys residues play in the progression of AD. The specific modification of cysteinyl residues in redox signaling is also tightly connected to the regulation of various metabolic pathways. Many of these pathways have been found to be altered in AD, even at very early stages. In order to analyze the complex changes and underlying mechanisms, several AD models have been developed, including animal models, 2D and 3D cell culture, and ex-vivo studies of patient samples. The use of these models along with innovative, new redox analysis techniques are key to further understand the importance of the redox component in Alzheimer's disease and the identification of new therapeutic targets in the future.
The systemic renin-angiotensin system (RAS) is an endocrine system that is mainly known to regulate blood pressure, fluid and electrolyte balance as well as volume homeostasis in the body through different active metabolites, the angiotensin (Ang) peptides. In addition, local renin-angiotensin systems have been discovered in various tissues, including the islet of Langerhans. Starting with angiotensinogen, the precursor of all angiotensin peptides which is cleaved into the decapeptide Ang I by renin, the RAS is divided into three axes. The main classical RAS axis is composed of angiotensin converting enzyme (ACE), angiotensin (Ang) II, and the Ang II type 1 receptor (AT1R), whereas the two alternative RAS axes comprise either ACE2, Ang-(1-7) and the receptor Mas or the aminopeptidase N (APN), Ang IV and the insulin-regulated aminopeptidase (IRAP). The activation of the main ACE/Ang II/AT1R RAS axis has been associated with metabolic syndrome, type 2 diabetes mellitus, and islet dysfunction. The detrimental effects resulting from the pathological activation of this axis have been shown to be attenuated or even abolished by the pharmacological inhibition of components of the main RAS axis. However, the impact of the two alternative ACE2/Ang-(1-7)/Mas and APN/Ang IV/IRAP RAS axes on islet function is less well understood. Previous studies mainly focused on the possible protective actions of Ang-(1-7) via the receptor Mas in insulin-sensitive tissues and on well known risk factors of metabolic syndrome (insulin resistance, hyperglycemia, obesity, hypertension and dyslipidemia). Thus, the impact of this axis on β-cell function and, in particular, insulin production and release was examined in the present study. Glucose and fatty acids have been subjects of diabetic research because they are established pathophysiologically relevant features of the metabolic syndrome and are known to harm β cells, phenomena which are referred to as gluco- or lipotoxicity, respectively. The pathophysiologically relevant factors glucose, saturated fatty acid (FA) palmitic acid (PA), and the methyl ester of the omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid (DHA-ME) were used in the present study to characterize the local β-cell RAS as well as β-cell function under pathophysiological conditions. Results of the present work demonstrate the expression of selected components of the RAS in isolated murine islets of Langerhans and the rat insulinoma cell line BRIN-BD11 under basal conditions. The alternative ACE2/Ang-(1-7)/Mas and APN/Ang IV/IRAP RAS axes were activated by high glucose in BRIN-BD11 cells after 24 h. Coincidently with these findings insulin production was found to be increased. In contrast, the expression of components of the main ACE/Ang II/AT1R RAS axis and the Ang II type 2 receptor (AT2R) were not affected under the same conditions (Härdtner et al., 2013). Both FAs, PA and DHA-ME were shown to alter the expression of components of the renin-angiotensin system in BRIN-BD11 cells. PA increased the expression of AT1R, the receptor of the main RAS axis, and of AT2R, whereas that of the receptor of the alternative ACE2/Ang-(1-7)/Mas RAS axis, Mas, appeared to be down-regulated at basal low glucose concentrations (5.5 mM). These effects were accompanied by a dose-dependent reduction of the insulin production and secretion. In contrast, DHA-ME augmented the expression of components of the ACE2/Ang-(1-7)/Mas axis and IRAP at low glucose concentrations, an effect which could be partially enhanced under high glucose conditions (25 mM). At basal glucose concentrations DHA-ME reduced the insulin secretion, whereas it was increased under high glucose conditions. However, the insulin mRNA amount remained unaffected by DHA-ME. Additionally, in contrast to glucose and palmitic acid, DHA-ME significantly increased the production of reactive oxygen species, at least hydrogen peroxide after 30 min. Expression alterations of components of the alternative ACE2/Ang-(1-7)/Mas RAS axis by glucose and PA correlated strongly with the corresponding insulin secretion and production. Therefore, an involvement of the ACE2/Ang-(1-7)/Mas RAS axis in the regulation of insulin secretion and production was hypothesized and validated in primary islets of Langerhans of both Mas-deficient and wild-type mice. Islets were exposed to the preferred natural ligand for Mas, Ang-(1-7), or to its pharmacological agonists or antagonists, respectively....
Abstract
G‐quadruplexes have attracted growing interest in recent years due to their occurrence in vivo and their possible biological functions. In addition to being promising targets for drug design, these four‐stranded nucleic acid structures have also been recognized as versatile tools for various technological applications. Whereas a large number of studies have yielded insight into their remarkable structural diversity, our current knowledge on G‐quadruplex stabilities as a function of sequence and environmental factors only gradually emerges with an expanding collection of thermodynamic data. This minireview provides an overview of general rules that may be used to better evaluate quadruplex thermodynamic stabilities but also discusses present challenges in predicting most stable folds for a given sequence and environment.
Abstract
Aims
Treating patients with acute decompensated heart failure (ADHF) presenting with volume overload is a common task. However, optimal guidance of decongesting therapy and treatment targets are not well defined. The inferior vena cava (IVC) diameter and its collapsibility can be used to estimate right atrial pressure, which is a measure of right‐sided haemodynamic congestion. The CAVA‐ADHF‐DZHK10 trial is designed to test the hypothesis that ultrasound assessment of the IVC in addition to clinical assessment improves decongestion as compared with clinical assessment alone.
Methods and results
CAVA‐ADHF‐DZHK10 is a randomized, controlled, patient‐blinded, multicentre, parallel‐group trial randomly assigning 388 patients with ADHF to either decongesting therapy guided by ultrasound assessment of the IVC in addition to clinical assessment or clinical assessment alone. IVC ultrasound will be performed daily between baseline and hospital discharge in all patients. However, ultrasound results will only be reported to treating physicians in the intervention group. Treatment target is relief of congestion‐related signs and symptoms in both groups with the additional goal to reduce the IVC diameter ≤21 mm and increase IVC collapsibility >50% in the intervention group. The primary endpoint is change in N‐terminal pro‐brain natriuretic peptide from baseline to hospital discharge. Secondary endpoints evaluate feasibility, efficacy of decongestion on other scales, and the impact of the intervention on clinical endpoints.
Conclusions
CAVA‐ADHF‐DZHK10 will investigate whether IVC ultrasound supplementing clinical assessment improves decongestion in patients admitted for ADHF.
In den pankreatischen α-Zellen ist Pax6 als Aktivator der Glucagon-Genexpression bekannt, während dessen Einfluss auf die Insulinsynthese kontrovers diskutiert wird. Ziel dieser Arbeit war es, zu untersuchen, wie der Transkriptionsfaktor Pax6 und dessen co-exprimierte Isoform Pax6(5a) in den Insulin-produzierenden β-Zellen agieren, um so auf ihre Funktion in diesen Zellen schließen zu können. Mittels Luciferase-Assays, Northern Blots und Radioimmunoassays wurde gezeigt, dass Pax6 sowohl die Insulinsynthese als und auch die sezernierte Insulinmenge reduzieren kann, wobei die TAAT-Motiv-bindende Homöodomäne als essenziell für diesen Pax6-Effekt identifiziert wurde. Mit Hilfe fluoreszierender Fusionsproteine und der indirekten Immunfluoreszenz konnte beobachtet werden, dass der intrazelluläre Transport von Pax6 Glucose-abhängig erfolgt und zwar gegensätzlich zu dem von PDX-1, einem Aktivator des Insulingens. So befand sich Pax6 bei Glucose-Mangel vor allem im Zellkern, bei hohen Glucose-Konzentrationen hingegen vorwiegend im Cytoplasma. BETA2, das synergistisch mit PDX-1 die Insulin-Genexpression induzieren kann, war Glucose-unabhängig stets im Zellkern lokalisiert. Die physiologische Relevanz der Translokation von Pax6 konnte in vivo durch die immunhistochemische Untersuchung von Pankreasschnitten normo- und hypoglycämischer C57BL/6 Mäuse bestätigt werden. GST-Capture-Assays zeigten die Interaktion von Pax6 und BETA2. Darüber hinaus demonstrierten CHIP-Assays in vivo eine gegensätzliche Glucose-abhängige Bindung von Pax6 und PDX-1 an der ein TAAT-Motiv enthaltenden A3-Box des Ratten Insulin-II-Promotors und unterstützen damit die Hypothese von Pax6 als Inhibitor der Insulin-Genexpression. Das Serin 122 wurde in Pax6 als wichtige regulatorische Aminosäure nachgewiesen, deren Mutation die Glucose-abhängige Translokation und die Wirkung von Pax6 auf den Ratten Insulin-II-Promotor stark beeinflusste. Wahrscheinlich wird diese Aminosäure anders modifiziert, möglicherweise glycosyliert. Eine Glycosylierung des Pax6-Wildtyps bei Glucose-Entzug wurde mittels Immunpräzipitation von EGFP-Pax6 und anschließender Western Blot-Analyse unter Verwendung eines O-GlcNAc-erkennenden RL2-Antikörpers detektiert. So ist zu vermuten, dass bei Glucose-Mangel die Glycosylierung den Transport in den Kern vermittelt und die für den inhibitorischen Effekt von Pax6 auf die Insulin-Genexpression verantwortliche TAAT-bindende Homöodomäne beeinflusst. Für Pax6 lässt sich schlussfolgern, dass es sich bei geringer Glucose-Konzentration im Kern befindet, um die Aktivierung der Insulin-Genexpression zu verhindern, indem es mit BETA2 interagiert und die PDX-1-Bindungsstelle blockiert. Da Pax6 zusätzlich unter diesen Bedingungen auch die Expression der für die β-Zelle spezifischen Gene aktiviert, um sie auf den zukünftigen Bedarf vorzubereiten, ist dessen essenzielle Rolle für die Aufrechterhaltung der β-Zellfunktion unumstritten. Ganz andere Effekte bewirkt hingegen die in den β-Zellen co-exprimierte Isoform Pax6(5a), die durch alternatives Spleißen des Exons 5a entsteht. Ihre Funktion in diesen Zellen war bisher unbekannt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass sie im Gegensatz zu Pax6 nicht an der Insulingen-Regulation beteiligt ist und auch nicht mit BETA2 interagiert. Analog zu Pax6 wurde ein Glucose-abhängiger Transport innerhalb der Zelle beobachtet. In vitro Kinase-Assays identifizierten in Pax6(5a) Threonin 48 als CKII-Phosphorylierungsstelle. Da es sich hierbei um die erste Aminosäure des Exons 5a handelt, welche somit durch das alternative Spleißen in Pax6 nicht existiert, stellt diese Phosphorylierung eine spezifische Regulation dieser Isoform dar. Mittels fluoreszierender Fusionsproteine war zu beobachten, dass die Imitation dieser Phosphorylierung den Transport von Pax6(5a) in das Cytoplasma verhinderte. Das die CKII zahlreiche für Wachstum und Proliferation verantwortliche Faktoren reguliert, lässt auf die Bedeutung der Pax6(5a)-Isoform in pankreatischen β-Zellen als Regulator des Wachstums für den Erhalt der β-Zellmasse schließen.
Das im Rahmen dieser Arbeit etablierte Verfahren zur morphometrischen Bewertung der lokalen Entzündungsreaktion nach Implantation von Biomaterialien stellt eine reproduzierbare, vielfältig anwendbare Methode dar. Das Programm ImageJ ermöglicht ein einfaches, modifiziertes Adaptieren dieses Analyseverfahrens an verschiedene immunhistochemische Untersuchungen. Die Anwendung des etablierten manuellen Zählverfahrens ermöglichte in den nachfolgenden Untersuchungen den Nachweis, dass das Konzept der Beschichtung von Implantatmaterialien mit einer biomimetischen Membran, basierend auf dem Phospholipid POPE, keine negativen Einflüsse auf die akute und chronische Entzündungsreaktion im das Implantat umgebenden Gewebe zeigte. Die Herstellung von biomimetischen Oberflächen als Implantatbeschichtung, die von den Zellen als körpereigen erkannt wird, könnte somit die langfristige Integration des Implantats in den Wirtsorganismus verbessern. Zusammen mit den In-vitro-Ergebnissen [Willumeit et al., 2007], in denen günstige Auswirkungen dieser Beschichtung auf Zell- und Bakterienadhäsion nachgewiesen wurden, zeigen die In-vivo-Befunde der vorliegenden Arbeit das Potential von Phospholipidbeschichtungen zum Erreichen von lang andauernder Integrität und Biofunktionalität metallischer Implantate in der klinischen Anwendung.
Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die rekombinante Expression und Reinigung der extrazellulären Domänen der neuralen Zellerkennungsmoleküle P0 und L1. Die gereinigten Proteine sollten für Strukturanalysen verwendet werden. Da es sich sowohl bei P0 als auch bei L1 um Glykoproteine handelt, wurde die rekombinante Expression in eukaryotischen Systemen durchgeführt. Die extrazelluläre Domäne des Zelladhäsionsmoleküls L1 wurde als Fusionsprotein (L1-TEV-Fc) mit einem durch TEV-Protease spaltbaren Fc-Tag in CHO-Zellen exprimiert, die das L1-TEV-Fc in den Zellkulturüberstand sezernierten. Das L1- TEV-Fc konnte erfolgreich über eine Protein A-Säule aufgereinigt werden. Seine biologische Aktivität wurde in einem Neuritenwachstums-Assay nachgewiesen. Um strukturelle Analysen an der extrazellulären Domäne durchführen zu können, sollte der Fc-Tag mit der TEV-Protease abgespalten werden. Obwohl verschiedene Reaktionsparameter wie Temperatur, Inkubationszeit, Konzentration der TEVProtease und die Konzentration der Detergenzien variiert wurden, war eine Spaltung des L1-TEV-Fc im Rahmen dieser Arbeit nicht möglich. Das Zellerkennungsmolekül P0 ist das häufigste Protein im Myelin des peripheren Nervensystems. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte neben der wildtypischen auch eine mutierte Form der extrazellulären Domäne des P0-Proteins in Pichia pastoris exprimiert werden. Die mutierte Form des P0-Proteins enthielt einen Aminosäureaustausch an Position 106 von Isoleucin zu Leucin (Ile106Leu), welcher beim Menschen zu einer schweren Form der Charcot-Marie-Tooth’schen Krankheit vom Typ 1B führt. Sowohl die wildtypische als auch die Ile106Leu-Form der extrazellulären Domäne des P0-Proteins konnten in Pichia pastoris exprimiert werden, und wurden als Fusionsproteine mit einem Myc- und einem sechsfachen Histidin-Tag in den Überstand sezerniert. Die Aufreinigung erfolgte über Ni-NTA-Agarose-Beads. Durch eine Fermentation im 35 l-Maßstab konnten beide Fusionsproteine für strukturelle Analysen in größerer Menge produziert und aufgereinigt werden. Eine anschließende Analyse mittels Dynamischer Laserlichtstreuung (DLS) zeigte, dass die Voraussetzungen für die Durchführung eines Kristallisationsscreens mit 480 Bedingungen gegeben waren. Durch Deglykosylierung mit N-Glykosidase F und 1D-NMR-Spektroskopie konnte gezeigt werden, dass die extrazelluläre Domäne des wildtypischen P0-Proteins aus Pichia pastoris glykosyliert ist. Eine Hyperglykosylierung konnte ausgeschlossen werden. Neben dem Einfluss der Ile106Leu-Mutation auf die Struktur der extrazellulären Domäne wurde auch ihr Einfluss auf die homophile Interaktion des P0-Proteins untersucht. In einem Aggregations-Assay mit transient transfizierten CHO-Zellen konnte gezeigt werden, dass die Zellen, die das wildtypische P0 voller Länge exprimierten, im Verhältnis zu P0-Ile106Leu-exprimierenden Zellen stärker aggregierten. Die Ile106Leu-Mutation wirkt sich also offenbar negativ auf die homophile Interaktion des P0-Proteins aus.
Das Prostatakarzinom ist bei Männern in Deutschland die häufigste Krebserkrankungen und die dritthäufigste Krebstodesursache. Aufgrund der steigenden Inzidenz mit fortschreitendem Alter und der parallel dazu immer älter werdenden Bevölkerung ist diese Erkrankung von großer sozioökonomischer Bedeutung. Nach einer antiandrogenen Therapie im fortgeschrittenen Tumorstadium kommt es häufig zur erneuten Progression des Tumorwachstums. In diesem kastrationsresistenten Stadium kommt es zur hormonunabhängigen Aktivierung und Aufrechterhaltung von Signalwegen des Androgenrezeptors.
Ein in diesem Zusammenhang postulierter Mechanismus besteht in der direkten Wechselwirkung des Rezeptors mit dem Tumorprotein PC1 (prostate and colon gene-1), welches auch als Tumorprotein D52 bezeichnet. Es liegt in Prostatakarzinomzellen häufig überexprimiert vor und steht daher im Verdacht, maßgeblich zur Progression des Tumorwachstums beizutragen, insbesondere im kastrationsresistenten Stadium.
In der vorliegenden Arbeit sollten mit Hilfe von FRET-basierten Interaktionsstudien mögliche Wechselwirkungen von PC1 mit dem Androgenrezeptor untersucht werden. Da es bereits Hinweise für eine Interaktion von PC1 mit Prdx1 gab, wurde dieses Protein in die Analyse mit einbezogen. Die Untersuchungen wurden an den Prostatakarzinom-
zelllinien LNCaP und PC-3 unter verschiedenen Kulturbedingungen durchgeführt.
Die verwendeten Methoden umfassten die Klonierung von Expressionsvektoren, Transfektion von Plasmid-DNA in Säugerzellen, indirekte Immunfluoreszenz, Westernblot-Analysen, Durchflusszytometrie sowie konfokale Mikroskopie.
In dieser Arbeit konnte eine Kolokalisation zwischen PC1 und dem Androgenrezeptor sowie zwischen PC1 und Prdx1 im Zytoplasma von androgenabhängig wachsenden LNCaP-Zellen gezeigt werden. Auch in PC-3-Zellen, welche ähnlich wie kastrationsresistente Zellen androgenunabhängig wachsen, gelang es, eine Kolokalisation zwischen PC1 und dem Androgenrezeptor im Zytoplasma nachzuweisen. Bei Kultivierung dieser Zellen in hormonfreiem Medium waren PC1 und der Androgenrezeptor sogar im Zellkern von PC-3-Zellen kolokalisiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten auf die besondere und zentrale Funktion des PC1 bei der Aufrechterhaltung des Tumorwachstums hin. Somit wäre das prostataspezifisch vorkommende PC1 eine durchaus interessante Zielstruktur für die Entwicklung neuer Therapiestrategien beim fortgeschrittenen Prostatakarzinom.
Aufgrund der immensen ökonomischen Verluste im Zusammenhang mit Ausbrüchen der Klassischen Schweinepest (KSP) werden Notfall-Immunisierungspläne für die Europäische Union diskutiert. Tiere, welche mit dem konventionellen C-Stamm Lebendimpfstoff immunisiert wurden, unterliegen Handelsrestriktionen. Um diese Restriktionen zu lockern bzw. aufzuheben sind wirksame Markerimpfstoffe notwendig. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Prüfung der Markerimpfstoff-Kandidaten CP7_E2alf und CP7_E1E2alf_TLA in Tierversuchen. Weiterhin wurden neue diagnostische Methoden wie real-time RT-PCR Systeme zur Unterscheidung von Impfviren und Feldvirusstämmen entwickelt. Die Volllängen-Sequenzierung von Genomen ist eine hilfreiche Methode im Rahmen epidemiologischer Untersuchungen. Fünf aktuelle deutsche KSP Isolate wurden sequenziert und die Ergebnisse für die Nachverfolgung der Virusverbreitung und für phylogenetische Analysen des Virus in den Wildschweinepopulationen von Nordrhein-Westfalen und Rheinland-Pfalz herangezogen.
Der akute Myokardinfarkt auf Grundlage einer koronaren Herzerkrankung ist eine der häufigsten Todesursachen weltweit. Besonders ältere Patienten leiden oft an mehreren kardiovaskulären Grunderkrankungen - so sind Vorhofflimmern und KHK häufige Komorbiditäten. Die pharmakologische Therapie von Vorhofflimmern bei bestehender KHK ist ein therapeutisches Problem. Dronedaron hat sich in zahlreichen klinischen Studien als wirksames Antiarrythmikum herausgestellt und zeigte zudem positive Effekte auf die Inzidenz und Sterblichkeit von akuten Myokardinfarkten (ATHENA-Studie). In verschiedenen Forschungsarbeiten konnte nachgewiesen werden, dass Dronedaron in der Frühphase nach einem akuten Myokardinfarkt eine Reduktion der Infarktgröße bewirken kann. Im Gegensatz dazu scheinen Patienten mit schwerer struktureller Herzerkrankung bezüglich ischämischer Ereignisse nicht von einer Dronedarontherapie zu profitieren (PALLAS-Studie).
In dieser Arbeit sollte unter Nutzung des Schweins als Modellorganismus geklärt werden, ob im Langzeitverlauf vier Wochen nach einem akuten Myokardinfarkt protektive Effekte Dronedarons auf die Infarktgröße und die kardiale Funktion nachgewiesen werden können. Desweiteren wurden mithilfe ventrikulärer Gen- und Proteinexpressionsanalysen Dronedaroneffekte in gesundem Myokard, Infarktgrenze und Infarktnarbe auf molekularbiologischem Level untersucht.
Für den experimentellen Myokardinfarkt wurde mithilfe eines Ballonkatheters der rechte Ramus interventricularis anterior distal des ersten Septalastes für 90 Minuten verschlossen. Nach 4-wöchiger Infarktheilung wurden die Herzen explantiert und Gewebsproben für die Expressionsanalysen entnommen. Die Größe der Infarktnarbe wurde an den formalinfixierten Herzen mithilfe der MRT-Bildgebung bestimmt. Genexpressionsprofile wurden mittels RNA-Microarray und anschließender Validierung mittels RT-qPCR, Proteinexpressionsprofile mittels 2D-DIGE-Analyse und anschließender massenspektrometrischer Proteinidentifizierung erstellt.
Die Infarktgröße wurde durch die Dronedarontherapie nicht signifikant beeinflusst (Kontrolle vs. Dronedaron: 10,1 % vs. 9,2 %, n.s.). Das Schlagvolumen der dronedaronbehandelten Tiere zeigte im Gegensatz zu den Kontrolltieren vier Wochen nach Infarzierung keine signifikante Reduktion. Enddiastolisches Volumen, Ejektionsfraktion sowie Serummarker zeigten keine Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen.
In den Expressionsanalysen konnten insbesondere in der Infarktgrenze Effekte der Dronedarontherapie beobachtet werden. Es kam zu einer Expressionssteigerung von TGFβ3, der TGFβ-Rezeptoren 1 und 2 sowie der TGFβ-bindenden Proteine LTBP1 und 2. Die vermehrte Aktivierung des TGFβ-Signalings zeigte sich auch in einer Expressionssteigerung matrizellulärer Proteine, darunter Thrombospondin 1 und 2, Periostin und Fibronektin, sowie diverser extrazellulärer Matrixproteine, v.a. Kollagen-Subtypen.
Die Aktivierung des TGFβ-Signalings sowie die Expressionssteigerung TGFβ-induzierter matrizellulärer Proteine in der Infarktgrenze begünstigen durch antiinflammatorische Effekte und Stimulation der Kollagensynthese die Infarktheilung sowie die Stabilisierung des Narbengewebes. Die Proteine Thrombospondin 1 und 2 verhindern zudem eine Expansion des Infarktes in gesunde Myokardareale. Desweiteren kann insbesondere Periostin die Kardiomyozytenproliferation im infarzierten Myokard stimulieren. So können das TGFβ-Signaling sowie matrizelluläre Proteine zu einer Verbesserung der kardialen Funktionalität nach akutem Myokardinfarkt beitragen. Es ist vorstellbar, dass Calcium-abhängige Mechanismen in Kardiomyofibroblasten die dronedaronabhängige gesteigerte Aktivierung des TGFβ-Signalings und als Folge der matrizellulären Proteine vermitteln.
Die Aufrechterhaltung des Schlagvolumens des linken Ventrikels durch die Dronedarontherapie vier Wochen nach einem Myokardinfarkt spricht für einen Erhalt der systolischen Kontraktionskraft des Herzens. Auch wenn keine signifikante Reduktion der Infarktgröße festgestellt werden konnte, deuten die gefundenen Ergebnisse auf eine protektive Wirkung von Dronedaron auf kardiale Funktionalität und die Infarktheilung bei ansonsten gesunden Patienten hin. Bei Patienten mit bereits strukturell vorgeschädigtem Herzen beispielsweise im Sinne einer schweren Herzinsuffizienz könnte die gefundene vermehrte Aktivierung des TGFβ-Signalings zu einer Verschlechterung der Prognose führen, was die Ergebnisse der PALLAS-Studie erklären könnte.
Macrophages are cells of the innate immune system and represent an important component of the first-line defense against pathogens and tumor cells. Here, their diverse functions in inflammation and tumor defense are described, and the mechanisms, tools, and activation pathways and states applied are presented. The main focus is on the role and origin of reactive oxygen species (ROS), the important signal pathways TLR/NF-κB, and the M1/M2 polarization of macrophages.
Cancer stem cells (CSCs) represent a small subset of slowly dividing cells with tumor-initiating ability. They can self-renew and differentiate into all the distinct cell populations within a tumor. CSCs are naturally resistant to chemotherapy or radiotherapy. CSCs, thus, can repopulate a tumor after therapy and are responsible for recurrence of disease. Stemness manifests itself through, among other things, the expression of stem cell markers, the ability to induce sphere formation and tumor growth in vivo, and resistance to chemotherapeutics and irradiation. Stemness is maintained by keeping levels of reactive oxygen species (ROS) low, which is achieved by enhanced activity of antioxidant pathways. Here, cellular sources of ROS, antioxidant pathways employed by CSCs, and underlying mechanisms to overcome resistance are discussed.
Vordergründiges Ziel der Arbeit war eine Grundlagenforschung über die Expression der TRPCKanäle in Osteosarkomzellen unter basalen und stimulierten Bedingungen durchzuführen. Als thematisches Setting wurde zum einen die bisher unklare Wirkung des erfolgversprechenden Medikaments Mifamurtid gewählt sowie zum anderen ein möglicher Zusammenhang mit der alternativen Ang-(1-7)/Mas-Achse gesucht.
Die vorliegende Arbeit hat einerseits die Expression der TRPC-Kanäle in Osteosarkomzellen nachgewiesen und andererseits interessante Schnittpunkte zu der alternativen ACE2/Ang-(1-7)/Mas-Achse des RAS gezeigt. So wird in Zukunft möglicherweise ein Zusammenhang zwischen der Mas-Aktivität und den TRPC-Kanälen – insbesondere von TRPC6 – substantiviert werden können. Die massive Induktion der Transkription von TRPC5 unter Inhibierung der PI3-Kinase ist eine interessante Beobachtung, die Ansätze für weiterführende Untersuchungen eröffnet. Inwieweit die pharmakologische Modulation von Mas- (oder MrgD-) Rezeptoren eine therapeutisch relevante Option beim Osteosarkom darstellt und inwieweit die Modulation der TRPC-Kanäle dazu beitragen kann, ist mit dieser Arbeit nicht geklärt. Die vorgelegten Daten zeigen jedoch eindeutig, dass der Mas-Antagonist D-Ala die Expression von zumindest TRPC 5, 6 und 3 sowie von Mas selbst in Osteosarkom-Zellen beeinflusst; Effekte die auch durch die Modulation von PI3K und MAP-Kinase Signalwegen erreicht werden können.
Das Zellerkennungsmolekül Tenascin-R spielt eine wichtige Rolle für die synaptische Plastizität im zentralen Nervensystem und für die Regulation des Verhaltens von Säugetieren. Viele der Erkenntnisse über in vivo - Funktionen von Tenascin-R wurden durch Untersuchungen der durch Insertion eines Neomycin-Resistenzgens in das Tnr-Gen hergestellten Tenascin-R-Knockout-Mäuse (Tnr-/-) erlangt. So weisen Tenascin-R-Knockout-Mäuse im Vergleich zu Wildtyp-Maus (Tnr+/+) Tieren ein deutlich ängstlicheres Verhalten und starke Defizite in der Motorkoordination auf. In der vorliegenden Arbeit sollten mögliche molekulare Mechanismen, welche die großen Unterschiede zwischen dem Verhalten der Mutante und dem wildtypischer Mäuse verursachen könnten, untersucht werden. Gene, deren Expression im Gehirn von Tenascin-R-Knockout-Mäusen im Vergleich zum Gehirn von Tnr+/+-Mäusen dysreguliert sind, sollten mit Hilfe von Expressionsprofilen identifiziert werden. Die Unterschiede zwischen den Expressionsprofilen der beiden Genotypen waren relativ gering. Dem am stärksten dysregulierten und daher eingehender untersuchten Transkript Gas5 fällt eine ungewöhnliche Funktion zu. Durch enzymatische Prozessierung entstehen aus dem Primärtranskript von Gas5 neun kleine nucleoläre RNAs (small nucleolar RNAs, snoRNAs). In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass neben der Expression von Gas5 auch die einer seiner snoRNAs, nämlich U44, in Tnr-/--Mäusen im Vergleich zu Tnr+/+-Mäusen in allen untersuchten Organen dramatisch verringert ist. Um einen in Betracht gezogenen dysregulationsauslösenden unspezifischen Effekt durch die zur Herstellung der TNR-/--Maus verwendeten Neomycinkassette auf die Expression von Gas5 auszuschließen, wurde eine zweite Tenascin-R-Knockout-Mauslinie mit Hilfe einer Neomycinkassetten-unabhängigen Methode hergestellt. Beide Dysregulationen konnten mit dieser Methode, bei der das mit loxP-Elementen flankierte erste kodierende Exon des Tenascin-RGens durch die separat exprimierte Cre-Rekombinase herausgeschnitten wurde, bestätigt werden. Erstaunlicherweise wurde diese Abnahme der Expression von Gas5 und U44 auch bei Mäusen beobachtet, die keine Cre-Rekombinase exprimierten, sondern die nur die loxP-Flankierung des ersten codierenden Exons von Tnr aufwiesen. Daher wurde für die Dysregulation des Gas5- Transkriptes die Zerstörung eines regulatorischen Elementes, welches zur post-transkriptionalen Regulation von U44 und Gas5 führt, im Tnr-Gen postuliert. Nach heutigem Kenntnisstand ist dies das erste Beispiel dafür, dass das Einfügen von loxP-Sequenzen in ein Mausgen die Expression eines benachbarten Gens selektiv beeinflusst. Ferner wurde erstmals das Expressionsmuster der aus Gas5- Primärtranskripten gebildeten snoRNAs in verschiedenen Organen analysiert. Dabei zeigte sich, dass in jedem Organ deutlich verschiedene Mengen der einzelnen snoRNAs vorliegen, aber auch, dass jede einzelne snoRNA von Organ zu Organ große Expressionsunterschiede aufweist. Dies wirft die Frage auf, welche Bedeutung Gas5 und dessen snoRNAs, speziell U44, für die Physiologie der Zellen des ZNS und somit letztlich für das Verhalten der Maus haben. Zur Klärung, ob Gas5 für die bei der Tenascin-R defizienten-Maus beobachteten Verhaltensauffälligkeiten verantwortlich sein könnte, wurden Untersuchungen durchgeführt, welche zeigten, dass das basale Gas5-mRNAExpressionsniveau Unterschiede im Angstverhalten bzw. in der Stressantwort von C57Bl/6-Mäusen erklären könnte. Die Verhaltensanalysen zeigten, dass die basale Expression der Gas5-mRNA im Hippocampus, aber nicht im restlichen Gehirn negativ mit stressanzeigenden Parametern des open field - und des elevated plus maze –Tests korreliert. Mit der Leistung der Mäuse im water maze-Test, einer räumlichen Lernaufgabe, korrelierte die Gas5-Expression hingegen nicht. Dies deutet darauf hin, dass der Gas5-Level für die hippocampale Stress- und Angstantwort wichtig ist, allerdings nicht für das räumliche Gedächtnis. Darüber hinaus ist die Expression von Gas5, aber nicht die seiner snoRNAs, 24 h nach einem, für die Maus stark stressauslösenden, olfaktorischen Kontakt mit einer Ratte um bis zu 50 % erhöht. Die Tenascin-R-mRNA-Menge ist bei denselben Mäusen um 25 % vermindert. Diese Gas5-mRNA-Expressions-Änderung wird hingegen nicht bei einem gemilderten Stressreiz, wie einer neuen Umgebung, beobachtet. Dieses Ergebnis zeigt, dass geringe Stressoren wie eine neue Umgebung nicht ausreichen, um die Gas5-Expression zu stimulieren, starke Stressoren wie Rattenkontakt hingegen zu einem Anstieg der Gas5-Expression führen. Gas5 scheint eine wichtige Funktion bei der Verarbeitung von Stress einzunehmen. Diese Verarbeitung könnte in der Tenascin-R defizienten-Maus derart gestört sein, dass eine normale Stressantwort nicht möglich ist und sich diese somit letztlich auch auf die motorischen Fähigkeiten der Tenascin-R defizieten Maus auswirkt.
Qualitative und quantitative massenspektrometrische Analyse von Virionen des Pseudorabies Virus
(2006)
Das Ziel dieser Arbeit war die qualitative und quantitative Analyse der Zusammensetzung von Partikeln des Pseudorabies Virus (PrV), des Erregers der Aujeszky’schen Krankheit beim Schwein. In Partikeln des PrV-Virusstammes Kaplan wurden nach ein- oder zweidimensionaler Elektrophorese und Identifizierung durch peptide mass fingerprint 27 Strukturproteine viraler und vier Strukturproteine zellulärer Herkunft (Annexin I und -II, HSP70 und Aktin) identifiziert. Die viralen Strukturproteine pUL37, pUL48, pUL18, pUL19, pUL29 (gB) und alle Strukturproteine zellulärer Herkunft wurden nach zweidimensionaler Elektrophorese in mehreren Isoformen nachgewiesen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Zusammensetzung von Deletionsmutanten des PrV mit derjenigen von Wildtyp-Virionen verglichen. Ziel war hier die Analyse von Veränderungen in der Partikelzusammensetzung über den Verlust des deletierten Proteins hinaus, z.B. als Folge einer dadurch nicht mehr möglichen Protein-Protein-Wechselwirkung oder einer abweichenden Morphogenese. Im Vordergrund stand dabei die Untersuchung der Tegumentproteine, da diese in eine Vielzahl von Protein-Protein-Interaktionen einbezogen sind und ihnen eine entscheidende Rolle während der Virusmorphogenese zukommt. Die quantitative Analyse von Mutanten mit Deletionen der Tegumentproteine pUS3, pUL11, pUL13, pUL16, pUL21, pUL35, pUL41, pUL43, pUL47, pUL49, pUL51, sowie der Deletion eines C-terminalen Fragments des UL36-Gens und des Glykoproteins E erfolgte massenspektrometrisch mit der SILAC Strategie. Nach Untersuchung der Strukturproteinprofile von allen oben genannten Deletionsmutanten lässt sich über die genannten Details hinaus generell folgendes feststellen: (1) Kapsid- beziehungsweise kapsid-assoziierte Proteine (pUL18, pUL25, pUL35 und pUL38) werden in stöchiometrischen Mengen zum Hauptkapsidprotein MCP142 (pUL19) in die Viruspartikel eingebaut. Diese Stöchiometrie war robust gegen alle untersuchten Deletionen. (2) Größere Flexibilität beim Einbau in das reife Virion zeigten Komponenten des Teguments. Kapsidnahe Tegumentproteine wie das pUL36 wurden meist stöchiometisch eingebaut. Größere Schwankungen beim Einbau in die verschiedenen untersuchten Deletionsmutanten zeigten die Tegumentproteine pUL11, pUL16, pUL21, pUL46, pUL48, pUL49 und pUS3. Deletionen in einzelnen Tegumentproteinen führten zu vermindertem Einbau anderer Proteine, was z.B. durch den Ausfall von Protein-Protein Wechselwirkungen erklärt werden kann, oder auf einen vermehrten Einbau anderer Tegumentproteine hindeutet. (3) Virale Hüllglykoproteine zeigten die größten quantitativen Schwankungen im Einbau, was die Bewertung des Einbaus der Glykoproteine in die verschiedenen Deletionsmutanten erschwerte. Ausnahme war hier das essentielle Glykoprotein gH, dessen Einbau in die untersuchten Deletionsmutanten im Vergleich zum Wildtyp durchgängig unverändert war.
Eine häufig therapiebedingte Spätkomplikation beim Prostatakarzinom ist die Ausprägung einer Kastrationsresistenz. Diese zeichnet sich durch eine von Androgenen unabhängige Progression aus. Die Therapieoptionen in diesem Stadium sind begrenzt und die Prognose ist ungünstig. Als eine Ursache wird die hormonunabhängige Aktivierung des Androgenrezeptors diskutiert. Ein weiterer Mechanismus ist die Entstehung neuroendokrin-differenzierter Tumorzellen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle eines Proteins der TPD52-Familie bei diesen Prozessen untersucht. Durch alternatives Spleißen entstehen vom TPD52-Gen verschiedene Transkriptvarianten. Neben der ubiquitär vorkommenden Isoform 3 lag der Fokus dieser Arbeit auf der prostataspezifischen Isoform 1, hier als PC-1 (prostate and colon gene 1) bezeichnet. Beide Isoformen sind mit der Progression des Prostatakarzinoms assoziiert, scheinen in diesem Kontext jedoch unterschiedliche Funktionen zu haben. Um speziell PC-1 untersuchen zu können, wurde ein rekombinant hergestelltes Antigen erfolgreich zur Gewinnung eines spezifischen Antikörpers verwendet. Zur funktionellen Charakterisierung von PC-1 wurde auf Basis der Prostatakarzinomzelllinie LNCaP ein Zellkulturmodell etabliert, welches eine induzierbare Überexpression dieses Proteins ermöglicht. Unter Verwendung dieser Zelllinie konnte gezeigt werden, dass PC-1 die Zellviabilität unter Androgenablation und während der Behandlung mit dem Antiandrogen Flutamid steigert. Zudem fördert PC-1 die Translokation des Androgenrezeptors in den Zellkern. Durch Androgenablation oder eine Kultivierung in Gegenwart des Zytokins IL-6 lassen sich Prostatakarzinomzellen in Richtung eines neuroendokrinen Phänotyps differenzieren. Diese Differenzierung korreliert unter anderem mit charakteristischen Veränderungen der Zellmorphologie. In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass die Behandlung mit IL-6 zu einer signifikanten Überexpression von PC-1 führt. Andere TPD52-Isoformen werden nicht beeinflusst. Den größten Effekt auf eine neuroendokrine Differenzierung zeigte eine Kombination aus IL-6-Behandlung und PC-1-Überexpression. Dieser konnte durch Western-Blot-Analysen, Immunfluoreszenzfärbungen, live cell imaging sowie über den RT-qPCR-basierten Nachweis einer vermehrten Expression neuronaler Marker validiert werden. Des Weiteren zeigten neuroendokrin-differenzierte LNCaP-Zellen nach PC-1-Überexpression eine erhöhte Zellviabilität, vermutlich durch eine gesteigerte Expression und Aktivität des Androgenrezeptors. Darüber hinaus konnte demonstriert werden, dass sich das Wachstum undifferenzierter LNCaP-Zellen durch die Präsenz neuroendokrin-differenzierter Zellen fördern lässt. Dieser Effekt war sogar unter Androgenablation deutlicher als in androgenhaltigem Medium und ist vermutlich auf sezernierte Mediatoren zurückzuführen, die das Medium entsprechend konditioniert haben. Um die Beteiligung von PC-1 an sekretorischen Vorgängen besser zu verstehen, wurden potentielle Interaktionspartner identifiziert. Speziell für die Kinesine KLC1/2 und UKHC ergaben sich Hinweise auf eine Wechselwirkung mit PC-1. Neben konfokalmikroskopisch analysierten Kolokalisationen konnten Interaktionen mittels Co-Immunpräzipitationen bestätigt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit verdeutlichen, dass PC-1 die Progression des Prostatakarzinoms über verschiedene Mechanismen beeinflusst. Somit kann PC-1 als ein bedeutsames, therapeutisches Zielprotein betrachtet werden.
Das Prostatakarzinom ist die häufigste Krebserkrankung des Mannes und die Inzidenz nimmt seit fast drei Jahrzehnten stetig zu. Moderne Therapieverfahren führen zu einem längeren Überleben der Patienten, durchaus auch mit kompletter Remission. Dennoch können im Rahmen der Therapie, insbesondere unter der Hormonentzugstherapie, weitere Veränderungen des Tumors zu einer Progression der Erkrankung führen. Durch den Verlust der Androgenabhängigkeit des Tumors bezeichnet man dies als kastrationsresistentes Prostatakarzinom. Dieser Progress ist häufig mit einer Zunahme von neuroendokrinen Zellen assoziiert, die im Rahmen einer sog. Neuroendokrinen Transdifferenzierung (NETD) aus den Drüsenzellen des Adenokarzinoms entstehen.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine solche Differenzierung durch die Kultivierung der Prostatakarzinomzelllinie LNCaP in Gegenwart von IL-6 simuliert. Diese experimentell erzeugte NETD konnte sowohl durch die Überexpression typischer Markerproteine, als auch durch die charakteristische Veränderung der Zellmorphologie nachgewiesen werden.
Um die molekularbiologischen Mechanismen im Rahmen der NETD besser zu verstehen, wurde das Proteom der differenzierten Zellen mit dem von Kontrollzellen verglichen. Differentiell exprimierte Proteine wurden mittels Massenspektrometrie identifiziert.
Die Proteine Gelsolin, Septin 7 und PC1 wurden in weiterführenden Experimenten validiert. Im Kontext der NETD erwies sich Gelsolin aufgrund seiner bekannten Funktionen als besonders interessant. Daher wurde dessen Expression mittels RNA- Interferenz moduliert und die Auswirkungen auf Zellfunktion und Morphologie untersucht. Gelsolin ist ein multifunktionelles Protein, welches sowohl Zytoskelett- modulierend wirkt, als auch in die Regulation der Apoptose involviert ist. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass ein Gelsolin knockdown eine deutliche Expressionserhöhung der aktivierten Caspase 3 bewirkt, was mit einer erhöhten Apoptoserate korreliert. Naheliegend war es auch der Frage nachzugehen, ob Gelsolin an der Ausprägung der charakteristischen morphologischen Veränderungen im Zuge der NETD beteiligt ist. Der begleitend zur IL-6-Behandlung durchgeführte knockdown ergab jedoch keinen relevanten Einfluss auf die Ausbildung von Zellausläufern.
Eine auf immunzytochemischer Färbetechnik basierende Analyse zeigte eine Kolokalisation von Gelsolin mit den Proteinen VDAC1 und PC1. Beide sind als Stabilisatoren des mitochondrialen Membranpotenzials bekannt. Somit könnte Gelsolin als Adapterprotein im Rahmen der Apoptoseregulation fungieren.
Die vorliegende Arbeit hat differentiell exprimierte Proteine identifiziert, die im Kontext einer NETD erstmals beschrieben wurden und somit den Weg bereitet, den Erkenntnisgewinn zu molekularbiologischen Abläufen bei der Entwicklung eines kastrationsresistenten Prostatakarzinoms auszuweiten.
Untersuchungen zur Expression der Nicotinamid N-Methyltransferase im klarzelligen Nierenzellkarzinom
(2011)
Mit einer steigenden Anzahl der Neuerkrankungen in den letzten 20 Jahren ist das Nierenzellkarzinom in Deutschland die dritthäufigste bösartige Erkrankung des Urogenitaltrakts. 75 % dieser malignen epithelialen Tumoren sind klarzellige Nierenzellkarzinome. Trotz des technischen Fortschritts in der Medizin ist die Diagnose Nierenzellkarzinom noch häufig ein sonografischer Zufallsbefund, denn klinische Symptome sind initial meist unspezifisch. Nach einer Tumornephrektomie erleiden 30 bis 40 % der Patienten ein Rezidiv, wobei zirka 2/3 in den ersten zwei Jahren nach Primärtherapie beobachtet werden. Spätmetastasen können beim Nierenzellkarzinom charakteristischerweise auch nach mehr als 15 Jahren auftreten. Diese Fakten legen nahe, dass eine frühzeitige Diagnosestellung den Erfolg einer entsprechenden Behandlungsstrategie mitbestimmt. Dieser Arbeit vorausgegangene Proteomanalysen zeigten eine differentielle Expression der Nicotinamid N-Methyltransferase im klarzelligen Nierenzellkarzinom. Auf der Grundlage der gefundenen tumorassoziierten Enzymalteration wurden im Rahmen dieser Arbeit Gewebeproben von 20 Patienten mit klarzelligem NZK molekularbiologisch untersucht um den Expressionsunterschied des Enzyms Nicotinamid N-Methyltransferase zu verifizieren. Pro Patient wurde die Expression der Nicotinamid N-Methyltransferase im Tumorgewebe sowie im makroskopisch unauffälligen Nierenrandgewebe analysiert. Der Nachweis der NNMT erfolgte anhand folgender Methoden: semiquantitative RT-PCR, quantitative real-time-PCR (SYBR® Green I- sowie TaqMan®-Assays), Western Blot, Immunhistochemie. Alle Untersuchungsmethoden bestätigten eine erhöhte Expression der NNMT im klarzelligen NZK im Vergleich zum Kontrollgewebe, wobei ein statistisch signifikanter Unterschied in der Western Blot-Analyse am deutlichsten war. Ein Zusammenhang zwischen der NNMT-Expression und Tumorstadium beziehungsweise Grading wurde weder auf Protein- noch auf RNA-Ebene gefunden. Mögliche Forschungsansätze könnten unter anderem die Untersuchung genetischer Polymorphismen, Mutationsanalysen, die Korrelation von NNMT-Genexpression und HNF-1beta-Genexpression im Nierenzellkarzinom sowie die Interaktion der NNMT in Angiogeneseprozesse bieten.
Survival, development, and function of cells depend on numerous signaling pathways or-
chestrating the response to external and internal stimuli. Besides the well-established signaling through reversible phosphorylation, the concept of specific, spatio-temporal redox modifi-
cations of protein cysteinyl and methionyl side chains that regulate the biological function of these proteins is supported by an overwhelming amount of data. Although the specific reduction of protein redox modifications has been studied intensively, the oxidation of protein side chains was thought to be a result of so-called ‘oxidative stress’. However, this term has been increasingly challenged, since signaling pathways depend on specific, spatio-temporal oxidation of target proteins, most likely catalyzed by specific enzymes. The discovery of MICAL (molecule interacting with CasL) proteins evinced
the first examples of specific oxidases in signal transduction in the redox regulation of cellular functions.As part of the semaphorin signaling pathway, MICAL proteins were characterized to stereospecifically oxidize methionyl residues in actin, thereby regulating actin deolymerization, a process important in neurogenesis and cell migration. This oxidation can be reversed by the specific methionine-R-sulfoxide eductase B1. Besides the regulation of actin dynamics, MICALs are involved in the regulation of cell proliferation and
apoptosis, and the production of hydrogen peroxide may qualify them as specific oxidases also for cysteinyl residues.