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Auf den inneren und äußeren Oberflächen des Menschen existieren zahlreiche Mikrohabitate mit limitiertem Sauerstoffangebot. Vor allem während infektiöser Vorgänge kann aufgrund einwandernder Neutrophile die Sauerstoffkonzentration im menschlichen Gewebe auf unter 1% sinken. Eine rasche Anpassung an das vorherrschende Sauerstofflevel und die Nutzung effizienter alternativer Atmungsformen oder des Gärungsstoffwechsels sind deshalb entscheidend für das mikrobielle Überleben im menschlichen Wirt. In der vorliegenden Dissertationsarbeit wurde die anaerobe Genexpression von Staphylococcus aureus sowie die zugrundeliegenden regulatorischen Mechanismen näher untersucht. Die sich in vier Teile gliedernde Arbeit befasst sich zunächst mit einer eingehenden Beschreibung der anaeroben Adaptation und Physiologie von S. aureus auf Ebene des Transkriptoms, der Proteinsynthese und des extrazellulären Metaboloms. Die Identifikation eines konservierten Sequenzmotivs (inverted repeat) vor zahlreichen anaerob induzierten Genen war Ausgangspunkt für die Untersuchung der entsprechenden regulatorischen Vorgänge im zweiten Teil dieser Arbeit. Diese führten letztlich in Kooperation mit Arbeitsgruppen aus den USA, Schweden und Deutschland (AG R. Proctor, Universität Wisconsin; AG C. von Wachenfeldt, Universität Lund; AG C. von Eiff, Universität Münster; AG M. Lalk, Universität Greifswald) zu der Identifikation des Rex Proteins (SACOL2035) als zentraler Regulator der anaeroben Genexpression in S. aureus. Neben der Rex-abhängigen Expressionskontrolle wurde in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Friedrich Götz (Universität Tübingen) auch der Einfluss des Zwei-Komponenten¬systems NreBC auf die Genexpression in S. aureus näher untersucht. Auf Ebene des Transkriptoms, Proteoms und Metaboloms konnte so die essentielle Bedeutung des NreBC-Systems für die Expression der dissimilatorischen Nitrat- und Nitritreduktasen in S. aureus nachgewiesen werden. Der dritte Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Einordnung des anaeroben Proteinsynthese¬musters (Proteomsignatur) in den Kontext zahlreicher anderer stressinduzierter Proteomsignaturen von S. aureus. Die aus diesem komplexen Vergleich gewonnenen Ergebnisse geben detaillierte Einblicke in die Spezifitäten und Gemeinsam¬keiten der Proteinsynthese von S. aureus als Reaktion auf oxidativen Stress (H2O2, Diamid und Paraquat), nitrosativen Stress (NO), Sauerstofflimitation in An- und Abwesenheit von Nitrat, Hitzestress (48°C) sowie subinhibitorische Antibiotikakonzentrationen (Puromycin, Mupirocin). Für die Bereitstellung der entsprechenden Daten wurde im Rahmen dieser Arbeit zudem ein mySQL-basiertes System entwickelt, das die Visualisierung der Daten mit komplexen Abfrage- und Filtermöglichkeiten verknüpft (http://www.aureolib.de). Im letzten Teil gibt diese Arbeit schließlich einen Überblick über die Leistungen und Möglichkeiten der Proteomanalyse hinsichtlich physiologischer und infektionsrelevanter Fragestellungen. Besondere Beachtung findet hier die Aufklärung und Struktur des bereits erwähnten Rex Modulons.
Pestivirus-Replikons als Werkzeug für heterologe Genexpression und molekulare Charakterisierung
(2021)
Replikons sind autonom replizierende RNA-Moleküle die nicht in der Lage sind, infektiöse Viren zu bilden. Sie sind wichtige Hilfsmittel zur molekularen Charakterisierung von Viren. Außerdem werden sie erfolgreich als Expressionssystem für Proteine und zur Entwicklung von Impfvektoren eingesetzt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein Replikon-basiertes Testsystem für den Nachweis spezifischer Antikörper gegen das atypische porzine Pestivirus (APPV) in Schweineseren etabliert. Auf Basis eines Klons des Virus der bovinen Virusdiarrhoe Typ 1 (BVDV) wurden die ursprünglichen BVDV Glykoproteine E1 und E2 gegen die Glykoproteine des APPV ausgetauscht. Die Expression mittels Replikon gewährleistet die natürliche Konformation der Proteine und damit die Bindung der entsprechenden Antikörper. Dieses System ermöglichte die serologische Untersuchung von 1115 Schweineseren ohne vorherige Isolation oder Zellkulturadaptation des Virus. Mit diesem neu entwickelten System konnte eine Seroprävalenzstudie gestartet und eine hohe Prävalenz von APPV in der untersuchten deutschen Schweinepopulation gezeigt werden.
Im weiteren Verlauf dieser Arbeit wurden Replikons zur Charakterisierung des atypischen Pestivirus Bungowannah Pestivirus (BuPV) eingesetzt. Während die Replikons mit Deletionen der Gene für die einzelnen Strukturproteine C, E1 und E2 oder die gesamte Strukturproteinregion keine Besonderheiten im Vergleich zu bereits untersuchten Pestivirus-Replikons aufwiesen und keine infektiösen Virionen mehr produzieren konnten, zeigten BuPV-Replikons mit ERNS-Deletion die Fähigkeit, zwei weitere Replikationszyklen zu durchlaufen und Zellen zu infizieren, allerdings mit einem sehr deutlichen Wachstumsdefizit. Dieser Defekt scheint in der Virusassemblierung und/oder der Freisetzung aus der Zelle zu liegen. Es konnte somit erstmals gezeigt werden, dass ERNS nicht essentiell für die Bildung infektiöser Bungowannah-Viren ist, jedoch sehr wichtig für eine effiziente Virusvermehrung. Diese Eigenschaft der ERNS deletieren BuPV macht diese besonders interessant als Vektoren für die Entwicklung neuer Replikon-basierter Expressionssysteme und einer Vakzinplattform. ERNS-Deletionsmutanten wurden daher auf ihre Fähigkeit hin untersucht, eine effiziente Expression verschiedener immunogener Proteine zu gewährleisten. Die Konstrukte waren dabei in der Lage, die ausgewählten Proteine effizient zu exprimieren und konnten zudem effizient zu Virus-Replikon-Partikel (VRP) verpackt und in einer trans-komplementierenden Zelllinie vermehrt werden.
Auch der für das parentale Virus beschrieben Zelltropismus konnte für die generierten BuPV-VRP gezeigt werden. Zusätzlich zu den beschriebenen Eigenschaften sind es der nicht-zytopathogene Charakter und die in den meisten Regionen fehlende Immunität gegen BuPV, die das hohe Potential dieses Systems als universellen Vakzinvektor herausstellen.
Zusätzlich wurde im Rahmen dieser Arbeit ein erstes DNA-basiertes System zur Herstellung rekombinanter BuPVs etabliert. Dieses System ermöglicht sowohl die Virusproduktion ausgehend von einem T7-RNA-Polymerase Promotor, als auch von einem Polymerase-II-Promotor. Die infektiösen Viren zeigten gleiche Wachstumseigenschaften wie Viren, welche mit dem konventionellen RNA-System generiert wurden. Auf Basis des neuen DNA-Systems konnte auch ein Replikon mit Deletion im ERNS-Gen etabliert werden. Dieser Klon zeigte nach der Transfektion eine sehr geringe Replikationsrate, konnte jedoch zur weiteren Konstruktion eines „single round infectious particle“ (SRIP) eingesetzt werden. Diese SRIP sind durch die Koexpression des deletierten ERNS in der Lage, sich selbst zu verpacken und bilden damit ein ideales System zum Transport selbst-replizierender RNA. Durch seine selbstlimitierenden Eigenschaften könnte es zur Entwicklung und Etablierung einer effizienten und sicheren Vakzineplattform eingesetzt werden. Allerdings ist dafür eine weiterreichende Optimierung notwendig.
Insgesamt zeigten die Untersuchungen, dass sich pestivirale Replikons sowohl als effizientes und schnelles Testsystem für die Untersuchung der Verbreitung neu auftretender Pestiviren, als auch zur Entwicklung effizienter RNA- und DNA-basierter Transport- und Verpackungssysteme viraler Proteine, eignet.