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Qualitative und quantitative massenspektrometrische Analyse von Virionen des Pseudorabies Virus
(2006)
Das Ziel dieser Arbeit war die qualitative und quantitative Analyse der Zusammensetzung von Partikeln des Pseudorabies Virus (PrV), des Erregers der Aujeszky’schen Krankheit beim Schwein. In Partikeln des PrV-Virusstammes Kaplan wurden nach ein- oder zweidimensionaler Elektrophorese und Identifizierung durch peptide mass fingerprint 27 Strukturproteine viraler und vier Strukturproteine zellulärer Herkunft (Annexin I und -II, HSP70 und Aktin) identifiziert. Die viralen Strukturproteine pUL37, pUL48, pUL18, pUL19, pUL29 (gB) und alle Strukturproteine zellulärer Herkunft wurden nach zweidimensionaler Elektrophorese in mehreren Isoformen nachgewiesen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Zusammensetzung von Deletionsmutanten des PrV mit derjenigen von Wildtyp-Virionen verglichen. Ziel war hier die Analyse von Veränderungen in der Partikelzusammensetzung über den Verlust des deletierten Proteins hinaus, z.B. als Folge einer dadurch nicht mehr möglichen Protein-Protein-Wechselwirkung oder einer abweichenden Morphogenese. Im Vordergrund stand dabei die Untersuchung der Tegumentproteine, da diese in eine Vielzahl von Protein-Protein-Interaktionen einbezogen sind und ihnen eine entscheidende Rolle während der Virusmorphogenese zukommt. Die quantitative Analyse von Mutanten mit Deletionen der Tegumentproteine pUS3, pUL11, pUL13, pUL16, pUL21, pUL35, pUL41, pUL43, pUL47, pUL49, pUL51, sowie der Deletion eines C-terminalen Fragments des UL36-Gens und des Glykoproteins E erfolgte massenspektrometrisch mit der SILAC Strategie. Nach Untersuchung der Strukturproteinprofile von allen oben genannten Deletionsmutanten lässt sich über die genannten Details hinaus generell folgendes feststellen: (1) Kapsid- beziehungsweise kapsid-assoziierte Proteine (pUL18, pUL25, pUL35 und pUL38) werden in stöchiometrischen Mengen zum Hauptkapsidprotein MCP142 (pUL19) in die Viruspartikel eingebaut. Diese Stöchiometrie war robust gegen alle untersuchten Deletionen. (2) Größere Flexibilität beim Einbau in das reife Virion zeigten Komponenten des Teguments. Kapsidnahe Tegumentproteine wie das pUL36 wurden meist stöchiometisch eingebaut. Größere Schwankungen beim Einbau in die verschiedenen untersuchten Deletionsmutanten zeigten die Tegumentproteine pUL11, pUL16, pUL21, pUL46, pUL48, pUL49 und pUS3. Deletionen in einzelnen Tegumentproteinen führten zu vermindertem Einbau anderer Proteine, was z.B. durch den Ausfall von Protein-Protein Wechselwirkungen erklärt werden kann, oder auf einen vermehrten Einbau anderer Tegumentproteine hindeutet. (3) Virale Hüllglykoproteine zeigten die größten quantitativen Schwankungen im Einbau, was die Bewertung des Einbaus der Glykoproteine in die verschiedenen Deletionsmutanten erschwerte. Ausnahme war hier das essentielle Glykoprotein gH, dessen Einbau in die untersuchten Deletionsmutanten im Vergleich zum Wildtyp durchgängig unverändert war.
Summary Prostate cancer (PCa) is the most common type of cancer found in men from western countries and is the leading cancer death next to lung cancer and colorectal cancer. Proteomic studies on PCa identified a number of differentially expressed proteins and some of them were reported as potential markers, but clinical application of these markers is mostly missing. Most of the expression profiling studies have been carried out on radical prostatectomy specimens, formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue sections, serum, urine and prostate fluids. To define the protein expression pattern of prostate biopsies, in the present study we investigated biopsy samples from benign prostate hyperplasia (BPH) and PCa patients by two-dimensional gel electrophoresis (BPH n=11 and PCa n=12) and mass spectrometry to identify potential biomarkers which might distinguish the two clinical situations. 2-DE results revealed 88 protein spots expressed differentially among hyperplasia and cancer groups with statistical significance. Interesting spots were analyzed by MALDI-TOF-MS-MS and 79 different proteins identified. The important proteins identified included, Prohibitin and NDRG1 tumor suppressor proteins, HSPs, cytoskeletal proteins, enzymes like DDAH1 and ALDH2. Prohibitin expression was investigated in detail at mRNA level and protein level using immunohistochemistry on prostatectomized specimens. We found that the level of mRNA for prohibitin correlates with the increased amount of protein indicating the involvement of changes at transcriptional level. Furthermore, immunohistochemistry revealed no staining in BPH, moderate staining in prostate intraepithelial neoplasia (PIN) and strong staining in PCa. From the list of differentially proteins compared to PCa, TPD52 is over expressed in prostate cancer and also mRNA estimation by real-time PCR confirmed over expression of TPD52 at transcriptional level in cancer. TPD52 is a protein over expressed in prostate and breast cancer due to gene amplification but its exact physiological function is not investigated in detail. In the present study, we explored the responsiveness of LNCaP cells after dysregulation of TPD52 expression. Transfection of LNCaP cells with specific shRNA giving efficient knockdown of TPD52 resulted in a significant cell death of the carcinoma LNCaP cells. As evidenced by the activation of caspases (caspase-3 and -9) and by the loss of mitochondrial membrane potential, cell death occurs due to apoptosis. The disruption of the mitochondrial membrane potential indicates that TPD52 acts upstream of the mitochondrial apoptotic reaction. To study the effect of TPD52 expression on cell proliferation, LNCaP cells were either transfected with EGFP-TPD52 or a specific shRNA. EGFP-TPD52 overexpressing cells showed an increased proliferation rate whereas TPD52-depleted cells showed a reverse effect. Additionally, we demonstrated that the exogenous expression of TPD52 promotes cell migration via ávâ3 integrin in prostate cancer cells through the activation of protein kinase B (PKB/Akt) pathway. In an attempt to identify new interacting proteins for TPD52, GST pulldown assays provided evidence for the physical interaction between TPD52 and Prx1 in LNCaP cells. Further, immunoprecipitation results confirmed this interaction. Our results demonstrates that protein profiling and mRNA studies can be performed on prostate biopsies. Moreover, our study revealed a significant up-regulation of prohibitin in prostate cancer compared to BPH which may be a potential marker to distinguish PCa and BPH. From the results for functional characterization of TPD52, we conclude that TPD52 plays an important role in various molecular events particularly in morphological diversification and dissemination of PCa. It may be a promising target to investigate further in detail to develop new therapeutic strategies to treat PCa patients. Caspases represent a family of cysteine proteases that are regarded as central executioners of apoptotic cell death. Activation of caspase cascade is an essential prerequisite in the induction of apoptosis in cellular systems. So far, in many tumors caspases were shown to be downregulated while anti-apoptotic Bcl-2 is up-regulated. To get insight in their putative role in PCa progression we determined the expression of caspase-1, uncleaved caspases 3 and 6, cleaved (activated) caspases 3 and 6, caspase-9 and antiapoptotic protein Bcl-2 in benign prostate epithelium (BPE) and prostate carcinoma. In the current study 20 prostates were obtained from patients undergoing radical prostatectomy due to PCa. Paraffin embedded prostate whole mounts were cut at (4 µm) and investigated immunohistochemically using anti-mouse monoclonal antibodies directed against caspases 1 and 9, uncleaved caspases 3 and 6, cleaved caspases 3 and 6, and Bcl-2. In BPE all caspases were localized in the cytoplasm of glandular cells. Comparing BPE to PCa, no differences were found for caspase-1, uncleaved caspases 3 and 6 as well as caspase-9. Immunostaining for cleaved caspases 3 and 6, however, revealed a statistically significant reduction in PCa compared to non-neoplastic tissue. Whereas in BPE Bcl-2 protein was detected in the basal compartment of epithelial gland cells no immunostaining was seen in PCa. As our results show a decreased amount of activated caspases may be due to the alterations of posttranslational cleavage rather than expression of caspases 3 and 6. This suggests that the modification in their activation pathway could play an important role during PCa progression.
Das Zellerkennungsmolekül Tenascin-R spielt eine wichtige Rolle für die synaptische Plastizität im zentralen Nervensystem und für die Regulation des Verhaltens von Säugetieren. Viele der Erkenntnisse über in vivo - Funktionen von Tenascin-R wurden durch Untersuchungen der durch Insertion eines Neomycin-Resistenzgens in das Tnr-Gen hergestellten Tenascin-R-Knockout-Mäuse (Tnr-/-) erlangt. So weisen Tenascin-R-Knockout-Mäuse im Vergleich zu Wildtyp-Maus (Tnr+/+) Tieren ein deutlich ängstlicheres Verhalten und starke Defizite in der Motorkoordination auf. In der vorliegenden Arbeit sollten mögliche molekulare Mechanismen, welche die großen Unterschiede zwischen dem Verhalten der Mutante und dem wildtypischer Mäuse verursachen könnten, untersucht werden. Gene, deren Expression im Gehirn von Tenascin-R-Knockout-Mäusen im Vergleich zum Gehirn von Tnr+/+-Mäusen dysreguliert sind, sollten mit Hilfe von Expressionsprofilen identifiziert werden. Die Unterschiede zwischen den Expressionsprofilen der beiden Genotypen waren relativ gering. Dem am stärksten dysregulierten und daher eingehender untersuchten Transkript Gas5 fällt eine ungewöhnliche Funktion zu. Durch enzymatische Prozessierung entstehen aus dem Primärtranskript von Gas5 neun kleine nucleoläre RNAs (small nucleolar RNAs, snoRNAs). In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass neben der Expression von Gas5 auch die einer seiner snoRNAs, nämlich U44, in Tnr-/--Mäusen im Vergleich zu Tnr+/+-Mäusen in allen untersuchten Organen dramatisch verringert ist. Um einen in Betracht gezogenen dysregulationsauslösenden unspezifischen Effekt durch die zur Herstellung der TNR-/--Maus verwendeten Neomycinkassette auf die Expression von Gas5 auszuschließen, wurde eine zweite Tenascin-R-Knockout-Mauslinie mit Hilfe einer Neomycinkassetten-unabhängigen Methode hergestellt. Beide Dysregulationen konnten mit dieser Methode, bei der das mit loxP-Elementen flankierte erste kodierende Exon des Tenascin-RGens durch die separat exprimierte Cre-Rekombinase herausgeschnitten wurde, bestätigt werden. Erstaunlicherweise wurde diese Abnahme der Expression von Gas5 und U44 auch bei Mäusen beobachtet, die keine Cre-Rekombinase exprimierten, sondern die nur die loxP-Flankierung des ersten codierenden Exons von Tnr aufwiesen. Daher wurde für die Dysregulation des Gas5- Transkriptes die Zerstörung eines regulatorischen Elementes, welches zur post-transkriptionalen Regulation von U44 und Gas5 führt, im Tnr-Gen postuliert. Nach heutigem Kenntnisstand ist dies das erste Beispiel dafür, dass das Einfügen von loxP-Sequenzen in ein Mausgen die Expression eines benachbarten Gens selektiv beeinflusst. Ferner wurde erstmals das Expressionsmuster der aus Gas5- Primärtranskripten gebildeten snoRNAs in verschiedenen Organen analysiert. Dabei zeigte sich, dass in jedem Organ deutlich verschiedene Mengen der einzelnen snoRNAs vorliegen, aber auch, dass jede einzelne snoRNA von Organ zu Organ große Expressionsunterschiede aufweist. Dies wirft die Frage auf, welche Bedeutung Gas5 und dessen snoRNAs, speziell U44, für die Physiologie der Zellen des ZNS und somit letztlich für das Verhalten der Maus haben. Zur Klärung, ob Gas5 für die bei der Tenascin-R defizienten-Maus beobachteten Verhaltensauffälligkeiten verantwortlich sein könnte, wurden Untersuchungen durchgeführt, welche zeigten, dass das basale Gas5-mRNAExpressionsniveau Unterschiede im Angstverhalten bzw. in der Stressantwort von C57Bl/6-Mäusen erklären könnte. Die Verhaltensanalysen zeigten, dass die basale Expression der Gas5-mRNA im Hippocampus, aber nicht im restlichen Gehirn negativ mit stressanzeigenden Parametern des open field - und des elevated plus maze –Tests korreliert. Mit der Leistung der Mäuse im water maze-Test, einer räumlichen Lernaufgabe, korrelierte die Gas5-Expression hingegen nicht. Dies deutet darauf hin, dass der Gas5-Level für die hippocampale Stress- und Angstantwort wichtig ist, allerdings nicht für das räumliche Gedächtnis. Darüber hinaus ist die Expression von Gas5, aber nicht die seiner snoRNAs, 24 h nach einem, für die Maus stark stressauslösenden, olfaktorischen Kontakt mit einer Ratte um bis zu 50 % erhöht. Die Tenascin-R-mRNA-Menge ist bei denselben Mäusen um 25 % vermindert. Diese Gas5-mRNA-Expressions-Änderung wird hingegen nicht bei einem gemilderten Stressreiz, wie einer neuen Umgebung, beobachtet. Dieses Ergebnis zeigt, dass geringe Stressoren wie eine neue Umgebung nicht ausreichen, um die Gas5-Expression zu stimulieren, starke Stressoren wie Rattenkontakt hingegen zu einem Anstieg der Gas5-Expression führen. Gas5 scheint eine wichtige Funktion bei der Verarbeitung von Stress einzunehmen. Diese Verarbeitung könnte in der Tenascin-R defizienten-Maus derart gestört sein, dass eine normale Stressantwort nicht möglich ist und sich diese somit letztlich auch auf die motorischen Fähigkeiten der Tenascin-R defizieten Maus auswirkt.
Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die rekombinante Expression und Reinigung der extrazellulären Domänen der neuralen Zellerkennungsmoleküle P0 und L1. Die gereinigten Proteine sollten für Strukturanalysen verwendet werden. Da es sich sowohl bei P0 als auch bei L1 um Glykoproteine handelt, wurde die rekombinante Expression in eukaryotischen Systemen durchgeführt. Die extrazelluläre Domäne des Zelladhäsionsmoleküls L1 wurde als Fusionsprotein (L1-TEV-Fc) mit einem durch TEV-Protease spaltbaren Fc-Tag in CHO-Zellen exprimiert, die das L1-TEV-Fc in den Zellkulturüberstand sezernierten. Das L1- TEV-Fc konnte erfolgreich über eine Protein A-Säule aufgereinigt werden. Seine biologische Aktivität wurde in einem Neuritenwachstums-Assay nachgewiesen. Um strukturelle Analysen an der extrazellulären Domäne durchführen zu können, sollte der Fc-Tag mit der TEV-Protease abgespalten werden. Obwohl verschiedene Reaktionsparameter wie Temperatur, Inkubationszeit, Konzentration der TEVProtease und die Konzentration der Detergenzien variiert wurden, war eine Spaltung des L1-TEV-Fc im Rahmen dieser Arbeit nicht möglich. Das Zellerkennungsmolekül P0 ist das häufigste Protein im Myelin des peripheren Nervensystems. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte neben der wildtypischen auch eine mutierte Form der extrazellulären Domäne des P0-Proteins in Pichia pastoris exprimiert werden. Die mutierte Form des P0-Proteins enthielt einen Aminosäureaustausch an Position 106 von Isoleucin zu Leucin (Ile106Leu), welcher beim Menschen zu einer schweren Form der Charcot-Marie-Tooth’schen Krankheit vom Typ 1B führt. Sowohl die wildtypische als auch die Ile106Leu-Form der extrazellulären Domäne des P0-Proteins konnten in Pichia pastoris exprimiert werden, und wurden als Fusionsproteine mit einem Myc- und einem sechsfachen Histidin-Tag in den Überstand sezerniert. Die Aufreinigung erfolgte über Ni-NTA-Agarose-Beads. Durch eine Fermentation im 35 l-Maßstab konnten beide Fusionsproteine für strukturelle Analysen in größerer Menge produziert und aufgereinigt werden. Eine anschließende Analyse mittels Dynamischer Laserlichtstreuung (DLS) zeigte, dass die Voraussetzungen für die Durchführung eines Kristallisationsscreens mit 480 Bedingungen gegeben waren. Durch Deglykosylierung mit N-Glykosidase F und 1D-NMR-Spektroskopie konnte gezeigt werden, dass die extrazelluläre Domäne des wildtypischen P0-Proteins aus Pichia pastoris glykosyliert ist. Eine Hyperglykosylierung konnte ausgeschlossen werden. Neben dem Einfluss der Ile106Leu-Mutation auf die Struktur der extrazellulären Domäne wurde auch ihr Einfluss auf die homophile Interaktion des P0-Proteins untersucht. In einem Aggregations-Assay mit transient transfizierten CHO-Zellen konnte gezeigt werden, dass die Zellen, die das wildtypische P0 voller Länge exprimierten, im Verhältnis zu P0-Ile106Leu-exprimierenden Zellen stärker aggregierten. Die Ile106Leu-Mutation wirkt sich also offenbar negativ auf die homophile Interaktion des P0-Proteins aus.
Makrophagen spielen eine essentielle Rolle bei Entzündungsprozessen sowie bei der Aktivierung von Abwehrmechanismen gegenüber bakteriellen Infektionen. Als Antwort auf inflammatorische Cytokine und bakterielle Produkte setzen Makrophagen Stickstoffmonoxid (NO) und reaktive Sauerstoffverbindungen (ROS) frei, die sowohl redox-sensitive Signaltransduktionswege vermitteln als auch Zellschäden induzieren. Ein wichtiger Bestandteil des zellulären Abwehrsystems stellen unter anderem die ubiquitär exprimierten Peroxiredoxine (Prxs) dar. Sie bilden eine Familie von sechs Thiol-abhängigen Peroxidasen, die Wasserstoffperoxid, organische Peroxide sowie reaktive Stickstoffverbindungen reduzieren können. Neben ihrer antioxidativen Funktion sind sie in die Regulation der Zellproliferation, Signaltransduktion sowie Apoptose involviert. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass Peroxiredoxine in Knochenmarkmakrophagen (bone marrow-derived macrophages; BMM) von BALB/c- und C57BL/6-Mäusen konstitutiv exprimiert werden und die Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS) und Interferon γ (IFNγ) zu einer Änderung der Genexpression von Prxs führt. Während in C57BL/6 BMM die Induktion der Genexpression von Prx 1, 2, 4 und 6 durch LPS und IFNγ von der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) abhängig war, konnte in BALB/c BMM nur eine iNOS-abhängige Induktion der Prx 1- und Prx 6-Genexpression nachgewiesen werden. Des Weiteren wurde untersucht, ob die Tyrosinkinase JAK2, Tyrosinkinasen der Src-Familie, die Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K), Proteinkinase C-Isoenzyme sowie p44/42 MAPK, p38 MAPK und c-Jun-N-terminalen Kinase (JNK) an der LPS- und IFNγ-induzierten Genexpression von Prx 1, 5 und 6 beteiligt sind. Außerdem konnte erstmals gezeigt werden, dass die Genexpression von Prx 6 durch Nrf2- (nuclear factor-erythroid 2p45 (NF-E2)-related factor 2-) Aktivatoren induzierbar ist und der Genknockout von Nrf2 die LPS- und IFNγ-vermittelte Induktion von Prx 6 in Makrophagen herabsetzt. Des Weiteren war die cytosolische Phospholipase A(2) (cPLA(2)) in die Regulation der LPS- und IFNγ-induzierten Transkription von Prx 5 und Prx 6 involviert. Die Hemmung der stromabwärts der cPLA(2)-gelegenen Cyclooxygenase-Enzyme (COX) führte zu einer signifikanten Abnahme der Prostaglandin (PG) E2-Sekretion sowie der Genexpression von Prx 6. Im Gegensatz dazu resultierte exogen zugeführtes PGD(2)-, PGE(1)-, PGE(2)-, PGF(2α), PGA(1), PGA(2) oder 15-deoxy-Δ12,14-PGJ(2) in einer konzentrations- und zeitabhängigen Zunahme des Prx 6-Transkriptes. Es konnte festgestellt werden, dass an der Regulation der PGD2- und PGE2-induzierten Prx 6-Genexpression die Adenylylzyklase und durch sie generiertes cAMP beteiligt sind, aber die durch cAMP-aktivierbare Proteinkinase A sowie Epac (exchange protein directly activated by cAMP) keine essentielle Bedeutung für die Prx 6-Genregulation besitzen. Die Untersuchungen der Regulation der PGE2- oder PGD2-induzierten Prx 6-Transkription zeigten weiterhin die Beteiligung der JAK2, PI3K, p38 MAPK und einiger Isoenzyme der PKC sowie die Bedeutung von Nrf2 für die Induktion der Genexpression von Prx 6 durch konventionelle und Cyclopentenon-Prostaglandine. In dieser Arbeit wurde zudem der Nachweis erbracht, dass durch die Infektion mit dem Pathogen Burkholderia pseudomallei, das als Modellorganismus Gram-negativer, intrazellulärer Erreger dient, die Genexpression von Prx 1, 5 und 6 in IFNγ-aktivierten Makrophagen von C57BL/6- und BALB/c-Mäusen induziert wird, wobei die mRNA-Induktion von Prx 1 und Prx 6 stärker in C57BL/6 als in BALB/cBMM erhöht wird. In IFNγ-aktivierten und B. pseudomallei-infizierten Makrophagen zeigte sich sowohl eine NO-abhängige Induktion der Prx 1- und Prx 6-Transkription und eine Abhängigkeit der Prx 5- und Prx 6-Genexpression von der NADPH-Oxidase-gebildeten ROS als auch eine Beteiligung von COX-1 und COX-2 an der durch B. pseudomallei-erhöhten mRNA-Expression von Prx 6. IFN&gamma-aktivierte Makrophagen, die mit Stämmen der virulenten Burkholderia-Spezies pseudomallei infiziert wurden, verfügten in den meisten Fällen über eine verstärkte Geninduktion von Prx 6, sowie iNOS- und COX-2-Proteinexpression gegenüber Makrophagen, die mit Stämmen der avirulenten Burkholderia-Spezies thailandensis infiziert wurden. Darüber hinaus zeichneten sich B. thailandensis- im Vergleich zu B. pseudomallei-infizierte BMM überwiegend durch eine geringere Genexpression und Sekretion verschiedener proinflammatorischer Cytokine wie IL-1beta, IL-6 und TNFalpha aus.
Aufgrund der immensen ökonomischen Verluste im Zusammenhang mit Ausbrüchen der Klassischen Schweinepest (KSP) werden Notfall-Immunisierungspläne für die Europäische Union diskutiert. Tiere, welche mit dem konventionellen C-Stamm Lebendimpfstoff immunisiert wurden, unterliegen Handelsrestriktionen. Um diese Restriktionen zu lockern bzw. aufzuheben sind wirksame Markerimpfstoffe notwendig. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Prüfung der Markerimpfstoff-Kandidaten CP7_E2alf und CP7_E1E2alf_TLA in Tierversuchen. Weiterhin wurden neue diagnostische Methoden wie real-time RT-PCR Systeme zur Unterscheidung von Impfviren und Feldvirusstämmen entwickelt. Die Volllängen-Sequenzierung von Genomen ist eine hilfreiche Methode im Rahmen epidemiologischer Untersuchungen. Fünf aktuelle deutsche KSP Isolate wurden sequenziert und die Ergebnisse für die Nachverfolgung der Virusverbreitung und für phylogenetische Analysen des Virus in den Wildschweinepopulationen von Nordrhein-Westfalen und Rheinland-Pfalz herangezogen.
In den pankreatischen α-Zellen ist Pax6 als Aktivator der Glucagon-Genexpression bekannt, während dessen Einfluss auf die Insulinsynthese kontrovers diskutiert wird. Ziel dieser Arbeit war es, zu untersuchen, wie der Transkriptionsfaktor Pax6 und dessen co-exprimierte Isoform Pax6(5a) in den Insulin-produzierenden β-Zellen agieren, um so auf ihre Funktion in diesen Zellen schließen zu können. Mittels Luciferase-Assays, Northern Blots und Radioimmunoassays wurde gezeigt, dass Pax6 sowohl die Insulinsynthese als und auch die sezernierte Insulinmenge reduzieren kann, wobei die TAAT-Motiv-bindende Homöodomäne als essenziell für diesen Pax6-Effekt identifiziert wurde. Mit Hilfe fluoreszierender Fusionsproteine und der indirekten Immunfluoreszenz konnte beobachtet werden, dass der intrazelluläre Transport von Pax6 Glucose-abhängig erfolgt und zwar gegensätzlich zu dem von PDX-1, einem Aktivator des Insulingens. So befand sich Pax6 bei Glucose-Mangel vor allem im Zellkern, bei hohen Glucose-Konzentrationen hingegen vorwiegend im Cytoplasma. BETA2, das synergistisch mit PDX-1 die Insulin-Genexpression induzieren kann, war Glucose-unabhängig stets im Zellkern lokalisiert. Die physiologische Relevanz der Translokation von Pax6 konnte in vivo durch die immunhistochemische Untersuchung von Pankreasschnitten normo- und hypoglycämischer C57BL/6 Mäuse bestätigt werden. GST-Capture-Assays zeigten die Interaktion von Pax6 und BETA2. Darüber hinaus demonstrierten CHIP-Assays in vivo eine gegensätzliche Glucose-abhängige Bindung von Pax6 und PDX-1 an der ein TAAT-Motiv enthaltenden A3-Box des Ratten Insulin-II-Promotors und unterstützen damit die Hypothese von Pax6 als Inhibitor der Insulin-Genexpression. Das Serin 122 wurde in Pax6 als wichtige regulatorische Aminosäure nachgewiesen, deren Mutation die Glucose-abhängige Translokation und die Wirkung von Pax6 auf den Ratten Insulin-II-Promotor stark beeinflusste. Wahrscheinlich wird diese Aminosäure anders modifiziert, möglicherweise glycosyliert. Eine Glycosylierung des Pax6-Wildtyps bei Glucose-Entzug wurde mittels Immunpräzipitation von EGFP-Pax6 und anschließender Western Blot-Analyse unter Verwendung eines O-GlcNAc-erkennenden RL2-Antikörpers detektiert. So ist zu vermuten, dass bei Glucose-Mangel die Glycosylierung den Transport in den Kern vermittelt und die für den inhibitorischen Effekt von Pax6 auf die Insulin-Genexpression verantwortliche TAAT-bindende Homöodomäne beeinflusst. Für Pax6 lässt sich schlussfolgern, dass es sich bei geringer Glucose-Konzentration im Kern befindet, um die Aktivierung der Insulin-Genexpression zu verhindern, indem es mit BETA2 interagiert und die PDX-1-Bindungsstelle blockiert. Da Pax6 zusätzlich unter diesen Bedingungen auch die Expression der für die β-Zelle spezifischen Gene aktiviert, um sie auf den zukünftigen Bedarf vorzubereiten, ist dessen essenzielle Rolle für die Aufrechterhaltung der β-Zellfunktion unumstritten. Ganz andere Effekte bewirkt hingegen die in den β-Zellen co-exprimierte Isoform Pax6(5a), die durch alternatives Spleißen des Exons 5a entsteht. Ihre Funktion in diesen Zellen war bisher unbekannt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass sie im Gegensatz zu Pax6 nicht an der Insulingen-Regulation beteiligt ist und auch nicht mit BETA2 interagiert. Analog zu Pax6 wurde ein Glucose-abhängiger Transport innerhalb der Zelle beobachtet. In vitro Kinase-Assays identifizierten in Pax6(5a) Threonin 48 als CKII-Phosphorylierungsstelle. Da es sich hierbei um die erste Aminosäure des Exons 5a handelt, welche somit durch das alternative Spleißen in Pax6 nicht existiert, stellt diese Phosphorylierung eine spezifische Regulation dieser Isoform dar. Mittels fluoreszierender Fusionsproteine war zu beobachten, dass die Imitation dieser Phosphorylierung den Transport von Pax6(5a) in das Cytoplasma verhinderte. Das die CKII zahlreiche für Wachstum und Proliferation verantwortliche Faktoren reguliert, lässt auf die Bedeutung der Pax6(5a)-Isoform in pankreatischen β-Zellen als Regulator des Wachstums für den Erhalt der β-Zellmasse schließen.
Untersuchungen zur Expression der Nicotinamid N-Methyltransferase im klarzelligen Nierenzellkarzinom
(2011)
Mit einer steigenden Anzahl der Neuerkrankungen in den letzten 20 Jahren ist das Nierenzellkarzinom in Deutschland die dritthäufigste bösartige Erkrankung des Urogenitaltrakts. 75 % dieser malignen epithelialen Tumoren sind klarzellige Nierenzellkarzinome. Trotz des technischen Fortschritts in der Medizin ist die Diagnose Nierenzellkarzinom noch häufig ein sonografischer Zufallsbefund, denn klinische Symptome sind initial meist unspezifisch. Nach einer Tumornephrektomie erleiden 30 bis 40 % der Patienten ein Rezidiv, wobei zirka 2/3 in den ersten zwei Jahren nach Primärtherapie beobachtet werden. Spätmetastasen können beim Nierenzellkarzinom charakteristischerweise auch nach mehr als 15 Jahren auftreten. Diese Fakten legen nahe, dass eine frühzeitige Diagnosestellung den Erfolg einer entsprechenden Behandlungsstrategie mitbestimmt. Dieser Arbeit vorausgegangene Proteomanalysen zeigten eine differentielle Expression der Nicotinamid N-Methyltransferase im klarzelligen Nierenzellkarzinom. Auf der Grundlage der gefundenen tumorassoziierten Enzymalteration wurden im Rahmen dieser Arbeit Gewebeproben von 20 Patienten mit klarzelligem NZK molekularbiologisch untersucht um den Expressionsunterschied des Enzyms Nicotinamid N-Methyltransferase zu verifizieren. Pro Patient wurde die Expression der Nicotinamid N-Methyltransferase im Tumorgewebe sowie im makroskopisch unauffälligen Nierenrandgewebe analysiert. Der Nachweis der NNMT erfolgte anhand folgender Methoden: semiquantitative RT-PCR, quantitative real-time-PCR (SYBR® Green I- sowie TaqMan®-Assays), Western Blot, Immunhistochemie. Alle Untersuchungsmethoden bestätigten eine erhöhte Expression der NNMT im klarzelligen NZK im Vergleich zum Kontrollgewebe, wobei ein statistisch signifikanter Unterschied in der Western Blot-Analyse am deutlichsten war. Ein Zusammenhang zwischen der NNMT-Expression und Tumorstadium beziehungsweise Grading wurde weder auf Protein- noch auf RNA-Ebene gefunden. Mögliche Forschungsansätze könnten unter anderem die Untersuchung genetischer Polymorphismen, Mutationsanalysen, die Korrelation von NNMT-Genexpression und HNF-1beta-Genexpression im Nierenzellkarzinom sowie die Interaktion der NNMT in Angiogeneseprozesse bieten.
Das im Rahmen dieser Arbeit etablierte Verfahren zur morphometrischen Bewertung der lokalen Entzündungsreaktion nach Implantation von Biomaterialien stellt eine reproduzierbare, vielfältig anwendbare Methode dar. Das Programm ImageJ ermöglicht ein einfaches, modifiziertes Adaptieren dieses Analyseverfahrens an verschiedene immunhistochemische Untersuchungen. Die Anwendung des etablierten manuellen Zählverfahrens ermöglichte in den nachfolgenden Untersuchungen den Nachweis, dass das Konzept der Beschichtung von Implantatmaterialien mit einer biomimetischen Membran, basierend auf dem Phospholipid POPE, keine negativen Einflüsse auf die akute und chronische Entzündungsreaktion im das Implantat umgebenden Gewebe zeigte. Die Herstellung von biomimetischen Oberflächen als Implantatbeschichtung, die von den Zellen als körpereigen erkannt wird, könnte somit die langfristige Integration des Implantats in den Wirtsorganismus verbessern. Zusammen mit den In-vitro-Ergebnissen [Willumeit et al., 2007], in denen günstige Auswirkungen dieser Beschichtung auf Zell- und Bakterienadhäsion nachgewiesen wurden, zeigen die In-vivo-Befunde der vorliegenden Arbeit das Potential von Phospholipidbeschichtungen zum Erreichen von lang andauernder Integrität und Biofunktionalität metallischer Implantate in der klinischen Anwendung.
I have investigated the role played by reactive oxygen species (ROS) generated by the phagocyte NADPH oxidase system in the innate immune response. I first looked at effector functions by asking whether ROS released from phagocytes might be effective in the killing of extracellular bacteria. Since bacteria can be killed in many other ways – for example by proteases or by cationic peptides – I made use of the recently demonstrated capacity of ROS to remove discontinuities from the surface of gold as the basis of an in vivo assay for extracellular ROS. Unlike bacterial killing, this readout system is not affected by enzymes, cationic peptides or other biological anti-bacterial agents. By this means I was able to use wild type mice and a congenic strain which lacks the gene coding for the gp91 subunit of the phagocyte NADPH oxidase to demonstrate that ROS generated by the NADPH oxidase system are indeed found outside the cells during an inflammation in vivo and that their principle source is neutrophil granulocytes rather than tissue macrophages. Since ROS released by these cells will be non-specific in its action it is to be expected that the releasing cell will itself suffer considerable damage. This fits well to the known short life of activated neutrophils and may explain the established fact that their death is dependent on the NADPH oxidase system. The long lived macrophages, in contrast, restrict their production of extracellular ROS. ROS are increasingly being found to be involved in both intra and intercellular signalling processes I looked for an involvement of NADPH oxidase derived ROS in the recruitment of neutrophils to sites of inflammation in vivo. Since the gene coding for the gp91 subunit of the NADPH oxidase is on the X chromosome I made use of a mosaic expression strategy based on X chromosomal inactivation. The results show that indeed ROS serves as a component of the neutrophil recruitment process in the critical early stages of an infection. Possible mechanisms are explored.
Patients with atrial fibrillation (AF) often present with typical angina pectoris and mildly elevated levels of cardiac troponin (non-ST-segment elevation myocardial infarction) during an acute episode of AF. However, in a large proportion of these patients, significant coronary artery disease is excluded by coronary angiography, which suggests that AF itself influences myocardial blood flow. The present review summarizes the effect of AF on the occurrence of ventricular oxidative stress, redox-sensitive signaling pathways and gene expression, and microcirculatory flow abnormalities in the left ventricle.
Ziel der Arbeit war die Untersuchung der lokalen und systemischen Entzündungsreaktionen nach intramuskulärer Implantation von Niedertemperatur-Plasmapolymer-modifizierten Titanplättchen (Ti) im Tiermodell Ratte. Ausgangspunkt dafür waren vorherige Zellkultur-Untersuchungen zu Ti-Proben mit einer positiv geladenen Schicht aus plasma-polymerisiertem Allylamin (PPAAm) beziehungsweise einer negativ geladenen Schicht aus plasma-polymerisierter Acrylsäure (PPAAc). Diese In-vitro-Studien ergaben für eine Beschichtung mit PPAAm positive Effekte auf das Wachstum von Osteoblasten sowie für eine Beschichtung mit PPAAc auf die osteogene Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen. Für die darauf aufbauenden in dieser Arbeit durchgeführten In-vivo-Untersuchungen war es zunächst notwendig, eine Methode zur quantitativen histologischen Untersuchung der lokalen Gewebsreaktionen nach Implantation von Ti-Proben zu etablieren. Deren Evaluierung zeigte eine gute Reproduzierbarkeit der Ergebnisse und damit die Eignung des Bildanalyse-Verfahrens für die weiteren Untersuchungen. Anschließend erfolgten unter Anwendung dieser Methode morphometrische immunhistochemische Untersuchungen der lokalen Entzündungsantwort nach intramuskulärer Implantation von PPAAc- und PPAAm-beschichteten Ti-Plättchen. Hierzu wurden in einer ersten Studie für beide Beschichtungen die Gesamt-Monozyten und -Makrophagen sowie die MHC-Klasse-II-positiven antigen-präsentierenden Zellen im Periimplantatgewebe nach 56 Tagen Implantationsdauer im Vergleich zu unbeschichteten Kontrollproben untersucht. Dabei ergab sich für die PPAAc-beschichteten Ti-Plättchen im Vergleich zu PPAAm-beschichteten Implantaten und Kontrollen eine verstärkte chronische Entzündungsreaktion. Aufgrund dieser Ergebnisse wurden in einer anschließenden zweiten Studie für drei verschiedene PPAAm-Beschichtungen, die sich hinsichtlich der Plasmaprozessparameter im Duty cycle unterschieden, die Gewebsreaktionen im Kurz- und Langzeitverlauf analysiert. Dafür erfolgte eine Untersuchung der Gesamt-Monozyten und -Makrophagen, der gewebsständigen Makrophagen, der T Lymphozyten und der MHC-Klasse-II-positiven antigen-präsentierenden Zellen 7, 14 und 56 Tage nach Implantation für diese drei PPAAm-Varianten im Vergleich zu Kontrollen. Im Ergebnis waren die lokalen Gewebsreaktionen für die zwei PPAAm-Varianten mit dem höheren Duty cycle im Langzeitverlauf schwächer ausgeprägt als für die PPAAm-Schicht mit dem geringen Duty cycle und die Kontrollen. Dieses Ergebnis stand im Einklang mit entsprechenden Unterschieden in den physikochemischen Schichteigenschaften wie zum Beispiel der Schichtdicke, der Aminogruppendichte und der Proteinadsorption. Darüber hinaus wurden das Serumprofil und die Korrelationen der pro-inflammatorischen Zytokine IL-2 und IFNγ sowie der anti-inflammatorischen Zytokine IL-4 und IL-10 vor sowie wöchentlich für 56 Tage nach Implantation von PPAAc-und PPAAm-beschichteten Implantaten sowie Kontrollen analysiert. Diese Untersuchungen ergaben für die PPAAc-Gruppe in der Spätphase einen gegensätzlichen Verlauf von IL-4 und IL-10 sowie abweichende Korrelationen des IL-10 mit den anderen untersuchten Zytokinen, während in der PPAAm-Gruppe die systemischen Reaktionen und die Korrelationen zwischen den untersuchten Zytokinen mit den Befunden in der Kontrollgruppe vergleichbar waren. Die Gesamtbetrachtung der in dieser Arbeit erhobenen In-vivo-Ergebnisse mit den vorherigen In-Vitro-Befunden zeigt, dass eine positiv geladene PPAAm-Beschichtung einen vielversprechenden Ansatz zur Erzeugung von zelladhäsiven Implantatoberflächen mit dem Ziel einer Verbesserung des Einwachsens von Ti-Implantaten darstellt. Darüber hinaus konnte für die PPAAm-Beschichtung gezeigt werden, dass Variationen in den Plasmaprozessparametern zu Unterschieden in den physikochemischen Eigenschaften und den daraus resultierenden In-vivo-Gewebsreaktionen führen. Die Ergebnisse der Arbeit wurden in vier wissenschaftlichen Fachzeitschriften veröffentlicht (Walschus et al. 2011 J Microsc 242:94–99; Schröder et al. 2010 J Adh Sci Technol 24:1191–1205; Hoene et al. 2010 Acta Biomater 6:676–683; Walschus et al. 2012 J Mater Sci Mater Med 23:1299–1307).
Neurogenese in adulten Ratten ist vor allem in der Subventrikularzone und im Gyrus dentatus des Hippocampus aktiv und kann durch gezielte Aktivierung nach einem Schlaganfall zu einer verbesserten Funktionalität führen. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob auch in gealterten Ratten eine Stimulation der endogenen Neurogenese nach Schlaganfall die Erholung verbessert. Dazu wurde das Neurogenese-verstärkende Pentylentetrazol zum ersten Mal auf seine Wirkung nach Schlaganfall in einem gealterten Tiermodell untersucht. Dazu wurde in 12-Monate alten Sprague-Dawley-Ratten eine transiente fokale Ischämie per Okklusion der mittleren Hirnschlagader (MCAO) ausgelöst und die endogene Neurogenese mit subkonvulsivem Pentylentetrazol verstärkt. Die funktionelle Erholung wurde mit mehreren Verhaltenstests über einen Zeitraum von sieben Wochen überwacht. Nach dem Ablauf des Überlebenszeitraums wurde von den gewonnenen Hirngeweben eine globale Genexpressionsanalyse vom Infarktareal sowie immunhistochemische Färbungen für Zellproliferation und neuronale Vorläuferzellen im Infarktgebiet und der ipsilateralen Subventrikularzone durchgeführt. Die Verhaltenstests Acht-Arm-Labyrinth und Schräge zeigten eine signifikant verbesserte Erholung bei Tieren mit postischämischer Pentylentetrazolbehandlung. Die immunhistochemische Färbung für den Neurogenese-Marker Doublecortin ergab eine signifikante Steigerung der Neuroblastenanzahl in der Subventrikularzone. Im Infarktkerngebiet konnte signifikant mehr beta-3- Tubulin-positives axonales Aussprossen detektiert werden. Die globale Genexpressionsanalyse wies auf signifikante Veränderungen von Genen der Inflammationsreaktion und der Neurogenese hin. Insgesamt zeigen die vorliegenden Ergebnisse, dass eine postischämische Stimulation der Neurogenese mit Pentylentetrazol auf die funktionelle Erholung einen positiven Einfluss hat.
Glutaredoxine (Grxs) gehören zur Enzymgruppe der Oxidoreduktasen und sind Teil der Thioredoxin-Familie. Grxs katalysieren die reversible (De-)Glutathionylierung von Proteinen und die Reduktion von Protein-Disulfiden. Diese Aktivitäten sind entscheidend für diverse redoxvermittelte Signaltransduktionsprozesse in den verschiedenen Kompartimenten der Zelle. Zudem werden sie im Zusammenhang mit der neuronalen Entwicklung, neurodegenerativen Erkrankungen und der Krebsentstehung und -progression gesehen. Säugetiergenome kodieren vier Grxs (Grx1, Grx2, Grx3 und Grx5) mit zytosolischer, nukleärer oder mitochondrieller Lokalisation. Von humanem Grx2 wurden bisher drei Isoformen charakterisiert. Das mitochondrielle Grx2a wird ubiquitär exprimiert, während die nukleären und zytosolischen Isoformen Grx2b und Grx2c ein Vorkommen in Testes und Krebszellen aufweisen. Grx2c ist an der Aussprossung von Axonen beteiligt und daher entscheidend für die Hirnentwicklung. Die Überexpression von Grx2c in HeLa-Zellen führt zu einem elongierten Phänotyp mit filopodienartigen Ausläufern, der in vorangegangenen Studien gut beschrieben wurde. Als potentielles Ziel der Grx2c-Wirkung wurde das Collapsin response mediator protein 2 (CRMP2) identifiziert. In der Tat konnte ein Thiol-Disulfid-Schalter in CRMP2 ermittelt werden. Grx2c wurde als spezifische Reduktase identifiziert, während MICALs (molecule(s) interacting with CasL) als potentielle Oxidasen dieses Schalters vermutet werden. Basierend auf diesen vorangegangenen Ergebnissen erarbeiteten wir die Hypothese, dass der Thiol-Disulfid-Schalter in CRMP2 die Interaktion des Proteins mit Regulatoren der Aktinpolymerisation und -verzweigung (das heißt Sra1/Cyfip1 und wave regulatory complex) kontrolliert und dadurch die Dynamik des Zytoskeletts beeinflusst. Hauptsächliches Ziel der Arbeit war die Überprüfung dieser Hypothese. Besonders die Protein-Protein-Interaktionen und deren Abhängigkeit vom CRMP2-Redoxstatus sollten untersucht werden. Unter Verwendung von HeLa-Zellen und Grx2c-exprimierenden HeLa-Zellen (HeLa-Grx2c-Zellen) konnte mittels Immunopräzipitation und unter Verwendung quervernetzender Substanzen keine direkte Interaktion zwischen Sra1/Cyfip1 und CRMP2 festgestellt werden. Es zeigte sich jedoch eine Co-Immunopräzipitation von Sra1/Cyfip1 und MICAL2, was für eine direkte Interaktion der beiden Proteine spricht. Des Weiteren fanden sich bei Betrachtung von Bandenmustern nach in vivo Quervernetzung Anhaltspunkte für eine indirekte Interaktion von CRMP2 und MICAL2. Die Auswertung von Western Blots ergab teils deutliche kompensatorische Änderungen im Expressionsmuster der untersuchten Proteine bei Überexpression von Grx2c in HeLa-Zellen. So kam es zur Erhöhung der Sra1- und Beta-Aktin-Menge, während sich die MICAL2-Menge in der Zelle verringerte. Unter Berücksichtigung der Ergebnisse wurde ein neues Modell erstellt, welches auf einer indirekten Interaktion von CRMP2, MICAL2 und Sra1/Cyfip1 via Plexin A (Teil des Semaphorin3A-Rezeptors) beruht. In diesem Modell wirken MICAL2 über Oxidation und Grx2c über Reduktion von CRMP2, was zu konformationellen Änderungen des CRMP2s führt. Die oxidierte, geschlossene Konformation inhibiert Sra1 über Bindung an MICAL2, während die reduzierte, offenere Konformation zu einer Freigabe und Aktivierung von Sra1 führt und letztendlich in der Aktinpolymerisation und -verzweigung mündet. Dieser Mechanismus hat eine entscheidende Bedeutung in der Pathogenese verschiedenster Krebserkrankungen und neurodegenerativer Erkrankungen. Die weitere Beleuchtung der Rolle des Redoxschalters in CRMP2 und die genaue Kenntnis dessen Involvierung in spezifische Signalwege wie der Sema3A-Signalkaskade, basierend auf dem neu erstellten Modell, könnten zukünftig bei der Verwirklichung gezielter pharmakologischer Therapien gegen Krebserkrankungen und neurodegenerative Erkrankungen eingesetzt werden.
The systemic renin-angiotensin system (RAS) is an endocrine system that is mainly known to regulate blood pressure, fluid and electrolyte balance as well as volume homeostasis in the body through different active metabolites, the angiotensin (Ang) peptides. In addition, local renin-angiotensin systems have been discovered in various tissues, including the islet of Langerhans. Starting with angiotensinogen, the precursor of all angiotensin peptides which is cleaved into the decapeptide Ang I by renin, the RAS is divided into three axes. The main classical RAS axis is composed of angiotensin converting enzyme (ACE), angiotensin (Ang) II, and the Ang II type 1 receptor (AT1R), whereas the two alternative RAS axes comprise either ACE2, Ang-(1-7) and the receptor Mas or the aminopeptidase N (APN), Ang IV and the insulin-regulated aminopeptidase (IRAP). The activation of the main ACE/Ang II/AT1R RAS axis has been associated with metabolic syndrome, type 2 diabetes mellitus, and islet dysfunction. The detrimental effects resulting from the pathological activation of this axis have been shown to be attenuated or even abolished by the pharmacological inhibition of components of the main RAS axis. However, the impact of the two alternative ACE2/Ang-(1-7)/Mas and APN/Ang IV/IRAP RAS axes on islet function is less well understood. Previous studies mainly focused on the possible protective actions of Ang-(1-7) via the receptor Mas in insulin-sensitive tissues and on well known risk factors of metabolic syndrome (insulin resistance, hyperglycemia, obesity, hypertension and dyslipidemia). Thus, the impact of this axis on β-cell function and, in particular, insulin production and release was examined in the present study. Glucose and fatty acids have been subjects of diabetic research because they are established pathophysiologically relevant features of the metabolic syndrome and are known to harm β cells, phenomena which are referred to as gluco- or lipotoxicity, respectively. The pathophysiologically relevant factors glucose, saturated fatty acid (FA) palmitic acid (PA), and the methyl ester of the omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid (DHA-ME) were used in the present study to characterize the local β-cell RAS as well as β-cell function under pathophysiological conditions. Results of the present work demonstrate the expression of selected components of the RAS in isolated murine islets of Langerhans and the rat insulinoma cell line BRIN-BD11 under basal conditions. The alternative ACE2/Ang-(1-7)/Mas and APN/Ang IV/IRAP RAS axes were activated by high glucose in BRIN-BD11 cells after 24 h. Coincidently with these findings insulin production was found to be increased. In contrast, the expression of components of the main ACE/Ang II/AT1R RAS axis and the Ang II type 2 receptor (AT2R) were not affected under the same conditions (Härdtner et al., 2013). Both FAs, PA and DHA-ME were shown to alter the expression of components of the renin-angiotensin system in BRIN-BD11 cells. PA increased the expression of AT1R, the receptor of the main RAS axis, and of AT2R, whereas that of the receptor of the alternative ACE2/Ang-(1-7)/Mas RAS axis, Mas, appeared to be down-regulated at basal low glucose concentrations (5.5 mM). These effects were accompanied by a dose-dependent reduction of the insulin production and secretion. In contrast, DHA-ME augmented the expression of components of the ACE2/Ang-(1-7)/Mas axis and IRAP at low glucose concentrations, an effect which could be partially enhanced under high glucose conditions (25 mM). At basal glucose concentrations DHA-ME reduced the insulin secretion, whereas it was increased under high glucose conditions. However, the insulin mRNA amount remained unaffected by DHA-ME. Additionally, in contrast to glucose and palmitic acid, DHA-ME significantly increased the production of reactive oxygen species, at least hydrogen peroxide after 30 min. Expression alterations of components of the alternative ACE2/Ang-(1-7)/Mas RAS axis by glucose and PA correlated strongly with the corresponding insulin secretion and production. Therefore, an involvement of the ACE2/Ang-(1-7)/Mas RAS axis in the regulation of insulin secretion and production was hypothesized and validated in primary islets of Langerhans of both Mas-deficient and wild-type mice. Islets were exposed to the preferred natural ligand for Mas, Ang-(1-7), or to its pharmacological agonists or antagonists, respectively....
Tachyarrhythmie in vivo und in vitro verursacht eine massive Alteration des Transkriptoms des Vorhofs bzw. der Kardiomyozyten, welche durch Irbesartan teilweise reversibel sind. Mögliche Mechanismen der differentiellen Beeinflussung dieses Expressionsverhaltens sollten sowohl in einer vergleichenden Promotoranalyse als auch in in vivo und in vitro Experimenten untersucht werden. Die vergleichende Promotoranalyse Irbesartan-regulierter Genen bei simuliertem Vorhofflimmern in vivo im Schwein zeigte das signifikant häufigere Vorhandensein der Transkriptionsfaktorbindungsstelle V$HAND1E47_01 in Promotoren der durch Irbesartan supprimierten Gene. Mit steigendem Irbesartaneffekt nimmt die Häufigkeit dieser Bindungsstelle signifikant ab. In vitro konnte an murinen HL1-Kardiomyozyten unter rapid-pacing und bei gleichzeitiger Irbesartaninkubation eine Induktion der Hand1-Expression gezeigt werden, simuliertes Vorhofflimmern in vivo respektive rapid-pacing in vitro allein zeigen keinen signifikanten Effekt auf die Expression. Für die aus der Promotoranalyse abgeleiteten hypothetischen Hand1-Targetgene E2F8 und PPP2R5B wurde in vitro ein zu den in vivo Daten deutlich unterschiedliches Expressionsverhalten beobachtet. Aus den in vitro Daten lässt sich die Vermutung der gegenseitigen Beeinflussung dieser Faktoren und Verschränkung des Renin- Angiotensin-Netzwerks und Calciumsignalings ableiten. Es scheint unter rapid-pacing und gleichzeitiger Irbesartaninkubation in vitro ein proliferations- und regenerationsförderndes Milieu zu entstehen, welches die protektiven Eigenschaften der Angiotensin II-Antagonisten bei Vorhofflimmern erklären könnte. Hierbei könnte Hand1 auf transkriptionsregulierender Ebene eine Schlüsselrolle spielen. Überexpressionen von Hand1 lieferten keine eindeutigen und sicheren Ergebnisse.
Das Ziel dieser Arbeit ist es, mittels RP (rapid pacing) in vitro bzw. RAP (rapid atrial pacing) in vivo die Bedeutung der miRNAs-1 und -328 für Remodeling-Vorgänge bei Vorhofflimmern zu untersuchen. Von Interesse ist dabei einerseits die Bestimmung des zeitabhängigen Expressionsniveaus der miRNAs unter RP, während andererseits die Auswirkungen ihres funktionellen „knock-down“ auf das Protein-Expressionsmuster von Kardiomyozyten untersucht werden. Für die geplanten Analysen (RT-qPCR, 2-D-Gelelektrophorese) solletn primäre Schweine- und Mauskardiomyozyten sowie die murine HL-1-Kardiomyozytenlinie als Modelle dienen. Im Zentrum der Untersuchungen stehen dabei akut eintretende Veränderungen, da diese für den pathophysiologischen Übergang in die persistierende Rhythmusstörung relevant sind, aber aufgrund der möglichen reversiblen Natur interessante therapeutische Optionen eröffnen könnten. Aufbauend auf die bereits gewonnenen Erkenntnisse in der Literatur soll diese Arbeit einen Beitrag für das Verständnis von atrialen Remodeling-Prozessen leisten, die das Vorhofflimmern zu einer chronischen Krankheit mit erheblichen Komplikationen machen.
Thioredoxine (Trxs) bilden eine Familie ubiquitärer Oxidoreduktasen, welche durch posttranslationale Redox-Modifikationen von Cysteinyl-Thiolgruppen sowie die Regulation der intrazellulären Wasserstoffperoxidgehaltes die zelluläre Redoxantwort steuern. Es ist bekannt, dass Thioredoxine, Glutaredoxine (Grxs) und Peroxiredoxine (Prxs) wesentliche Signalwege von Inflammation, Proliferation und Apoptose beeinflussen und somit in vielen Pathologien, insbesondere bei entzündlichen Erkrankungen wie dem allergischen Asthma, eine entscheidende Rolle spielen. Derzeit sind vorwiegend die intrazellulären Funktionen der Proteine der Trx-Familie in Gesundheit und Krankheit umfassend untersucht, doch die extrazellulären Funktionen bei der Redox-Signalübertragung bleiben bis zum heutigen Tage weitestgehend im Dunkeln. In dieser Arbeit haben wir uns daher zum Ziel gesetzt, Verteilung und Funktion von Proteinen der Trx-Familie in der Regulation der Immunantwort zu untersuchen, wobei der Schwerpunkt auf dem extrazellulären Vorkommen und den damit verbundenen Eigenschaften liegt.
Allergische Atemwegsentzündungen sind durch bronchiale Obstruktion und chronischen Umbau sowie Hyperreagibilität der Atemwege gekennzeichnet. Die Anhäufung reaktiver Sauerstoffspezies in der bronchialen Flüssigkeit der Lunge und die sich daraus ergebenden Veränderungen des Redoxzustands in den bronchialen Epithelzellen sind in den letzten Jahren in den Fokus der Asthmaforschung gerückt. Mehrere Studien beschrieben eine positive Wirkung von Trx1 und Grx1 in Atemwegsinfektionen, so würde eine Th2-typische Immunmodulation reduziert und verringere in der Folge den Umbau der Atemwegsstruktur – eine zentrale Pathologie des Asthmas.
In dieser Studie untersuchten wir die Expressionsniveaus von Proteinen der Trx-Familie in Lungengewebe und bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit in einem Mausmodell der Ovalbumin (OVA) induzierten allergischen Atemwegsentzündung. Wir konnten eine Zunahme von Grx2 und Prx4 in intrazellulären Proben aus der Mäuselunge nach einsetzen der induzierten Atemwegsinfektion zeigen. Ausschließlich unter OVA-induzierter Inflammation wurde in diesen Proben eine zweite Isoform von Grx2, zytosolisches Grx2c, nachgewiesen. Die Behandlung von Mäusen mit intraperitoneal appliziertem, rekombinantem Grx2 parallel zur Induktion der Entzündung mit OVA, hatte eine entzündungshemmende Wirkung, die zu einer Verringerung des asthmatischen Phänotyps in der Immunhistochemie und einer signifikanten Reduktion der Gesamtzahl der Entzündungszellen, besonders der eosinophilen Granulozyten führte. Die Verabreichung der rekombinanten Grx2C40S-Mutante, der die Fähigkeit zur Katalyse des Dithiol-Reaktionsmechanismus fehlt, hatte nicht die gleiche entzündungshemmende Wirkung. Eine zusätzlich durchgeführte His-Tag-Färbung zeigte eine Aufnahme von rekombinantem Grx2 in die Epithelzellen und Makrophagen der entzündeten Lunge. Die Färbung von Lungenabschnitten für HIF1- und Pro-Caspase3 nahm nach Beginn der allergischen Atemwegsentzündung zu und ging bei den mit dem wildtyp Grx2 behandelten Mäusen deutlich zurück.
In den extrazellulären Fraktionen war die Konzentration von Trx1, Grx1, Prx2 und Prx4 unter Entzündungsbedingungen erhöht, zudem konnte Prx4 in dieser Studie erstmals nur in der Entzündung, nicht aber bei gesunden Mäusen nachgewiesen werden. In-vitro-Experimente, bei denen Makrophagen aus Balb/c-Mäusen stimuliert wurden, sollten Aufschluss über die Funktionen von Trxs und Grxs in der Immunantwort geben. Grx2 und Trx1 wurden als potenzielle Stimulatoren von Makrophagen identifiziert, die die Sekretion von RANTES, IL-6, IL-10 und TNF-α induzieren, während die Zytokinspiegel von IL-4 und INF-γ nicht verändert wurden. Bei kombinierter Verabreichung von Redoxinen mit LPS/IFN-γ, die einen Entzündungszustand nachahmt, wurde gezeigt, dass Trx1 die Zytokinspiegel von TNF-α und INF-γ im Vergleich zu LPS/IFN-γ allein senkt. Die Behandlung mit Trx1/LPS/IFN-γ induzierte die Produktion von IL-6 und RANTES auf ein Niveau vergleichbar mit der alleinigen Stimulation durch LPS/IFN-γ.
Diese Arbeit beleuchtet Proteinveränderungen von Thioredoxinen, Glutaredoxinen und Peroxiredoxinen in einem Mausmodell für allergische Atemwegsentzündungen mit besonderem Schwerpunkt auf der extrazellulären Verteilung und Funktion der Proteine. Wir zeigen, dass die Veränderungen der Proteinspiegel selektiv reguliert werden und zu einem fein abgestimmten Netzwerk von Partnern in der Redox-Signalgebung beitragen und somit Potenzial für mögliche Therapieansätze bieten.