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Neben dem bekannten biologisch-aktiven Angiotensin II sind andere biologisch-aktive Angiotensine wie das Angiotensin IV und Angiotensin (1-7) entdeckt worden. Vor einigen Jahren wurde herausgefunden, dass das Mas-Protoonkogen für einen Rezeptor kodiert, welcher essentiell für den Angiotensin (1-7)-Signalweg ist. Dieses wird nicht nur in der Peripherie, sondern auch im Gehirn exprimiert. Hierauf basierend untersuchten wir die Verteilung von Mas innerhalb des Gehirns der Maus mithilfe eines Antikörpers, welcher gegen die 3. zytoplasmatische Schleife des Rezeptors gerichtet ist. Die stärkste Expression wurde im Gyrus dentatus sowie im piriformen Cortex detektiert. Jedoch wurden ebenfalls Mas-positive Neurone in vielen Bereichen des Cortex, des Hippocampus, der Amygdala, den Basalganglien, dem Thalamus und dem Hypothalamus gefunden. Da der Gyrus dentatus zur adulten Neurogenese fähig ist, untersuchten wir den Einfluss der Deletion von Mas auf eben diese. Im Gyrus dentatus beeinflusste di e Deletion von Mas weder die Zellproliferation (nachgewiesen durch Phosphohistone H3) noch den Zelltod (nachgewiesen durch aktivierte Caspase3). Jedoch resultierte der Knockout von Mas in einer Erhöhung Doublecortin-positiver Zellen. In Bezug auf den pirifomen Cortex wird diskutiert, ob dieser unter physiologischen Gesichtspunkten zur adulten Neurogenese fähig ist. Wir konnten demonstrieren, dass der Mas-Knockout einen Einfluss auf die Zellteilung und die Population Doublecortin-positiver Neurone hat. Da Mas nicht vor dem ersten postnatalen Tag exprimiert wird, lassen unsere Daten vermuten, dass adulte hippocampale Neurogenese und die Neurogenese in der pränatalen Entwicklung mehrere gemeinsame Mechanismen besitzen. Darüber hinaus, da der Knockout von Mas die Zahl Doublecortin-positiver Neurone erhöht, könnte die Blockade von Mas hilfreich sein bei der Stimulation der Neurogenese beim Erwachsenen.
Mentale Retardierung (MR) wird definiert als ein erniedrigter Intelligenzquotient unter beziehungsweise gleich 70. Man weiß, dass MR im Rahmen anderer Krankheiten, wie Autismus oder Schizophrenie eine starke genetische Komponente in der Entstehung aufweist. Diesen Krankheiten liegen höchstwahrscheinlich entwicklungsbedingte Fehlanlagen von Nervenzellverbindungen, sowie eine verminderte synaptische Plastizität, also aktivitätsbedingte Veränderungen der bestehenden Nervenzellverbindungen, zugrunde. Dieses Spektrum an Erkrankungen wird häufig als Neurodevelopmental Disorders (ND) zusammengefasst.
In den letzten Jahren wurden viele Gene identifiziert, die einerseits mit dem physiologischen Lernen, als auch bei deren Abwesenheit oder Fehlfunktion mit MR oder anderen Krankheiten im Spektrum der ND assoziiert werden konnten. Dazu gehört das SrGAP3-Gen mit dem dazugehörigen Produkt, dem Protein (Slit-Robo Rho-GTPase activating Protein 3). Gegenstand dieser Arbeit waren genetisch modifizierte Mäuse (Knockoutmäuse), deren SrGAP3-Gene vollständig ausgeschaltet wurden. In vorhergehenden morphologischen Untersuchen zeigten diese Mäuse eindrückliche Veränderungen des Zentralen Nervensystems (ZNS), wie eine Vergrößerung der Hirnmasse und insbesondere des Gesamtvolumens. Zudem fiel eine Vergrößerung der Ventrikel, den flüssigkeitsgefüllten Hohlräumen des ZNS, auf. Diese Vergrößerung wird als Hydrocephalus bezeichnet.
In dieser Arbeit wurden vergleichende Verhaltensversuche von gesunden Kontrollmäusen und modifizierten Knockoutmäusen durchgeführt. Diese Versuche beinhalteten unter anderem die Beobachtung der motorischen Fähigkeiten im Open Field, über Erfassung der Neugierde im Hole Board, räumliches Lernen im Morris Water Maze, Nestbauverhalten im Nest Building, sowie eine Erfassung des Grabtriebes im Marble Burying. Zu unserer Überraschung zeigten die Knockoutmäuse insbesondere in den Lerntests keine statistisch signifikante Verschlechterung, obwohl sie so starke Auffälligkeiten in der Anatomie zeigten.
Die signifikante Verschlechterung im Marble Burying, sowie das in Voruntersuchungen auffällig eingeschränkte Sozialverhalten der Knockoutmäuse, lassen in der Gesamtschau von der Annahme einer MR in Assoziation mit dem SrGAP3-Gendefekt Abstand nehmen. Eher rücken andere Krankheiten im Spektrum der ND in den Fokus. Insbesondere sei hier die Schizophrenie zu erwähnen bei der eine genetische Komponente mit Defekten von SrGAP3-ähnlichen Genen bereits in der Literatur beschrieben wurde.
Das Ziel der vorliegenden Studie bestand darin, die Beziehungen der Zahnwurzeln der oberen Prämolaren und Molaren zum Sinus maxillaris bei den Großen Menschenaffen vergleichend-anatomisch zu untersuchen. Dabei wurden für den Orang-Utan auch Wachstumsveränderungen berücksichtigt. Für diese Arbeit standen 26 adulte Schädel der Gattungen Pongo pygmaeus, Gorilla gorilla und Pan troglodytes sowie 13 infantile und juvenile Schädel der Gattung Pongo pygmaeus zur Verfügung. Das biologische Alter der Tiere zum Zeitpunkt des Todes war unbekannt. An den Schädeln wurden zunächst definierte Längen-, Breiten- und Höhenmaße erhoben.
Von den Schädeln wurden DVT-Datensätze mit dem Digitalen Volumentomographen QR-DVT 9000 (NewTom Verona, Italien) angefertigt. An den DVT-Datensätzen wurden zunächst mit Hilfe der NewTom 3G Software (QR NNT 2.11 Professional) lineare Messungen der Zahnwurzellängen der Prämolaren und Molaren des Oberkiefers sowie der Knochendicke zwischen den Zahnwurzeln und dem Boden des Sinus maxillaris vorgenommen. Außerdem wurden die im DICOM-Format vorliegenden Schichtserien in das JPEG-Format umgewandelt. Anhand dieser Datensätze wurden die Zahnkeime der permanenten Zähne unter Verwendung von SURFdriver® dreidimensional rekonstruiert und deren Volumina bestimmt. Die erhobenen Daten wurden mit Hilfe nicht parametrischer Verfahren analysiert und untereinander in Beziehung gesetzt.
Die Untersuchungen zur Entwicklung der permanenten Zähne des Orang-Utans zeigten zu Beginn eine ausgeprägte Volumenzunahme der Zahnkeime des ersten Inzisivus und des ersten Molars. Der Durchbruch des ersten Molars erfolgte als erstes. Zu diesem Zeitpunkt begann die Resorption an den mittleren Milchschneidezähnen. Dem Wechsel der Inzisivi ging meist der Durchbruch des zweiten Molars voraus. Desweiteren überlappte der Beginn der Kronenbildung des dritten Molars mit der Fertigstellung der Krone des zweiten Molars.
Beim Orang-Utan weisen die Volumina der permanenten Zahnkeime einen signifikanten Zusammenhang mit der Gesichtsschädellänge, Gaumenlänge, Maxilloalveolarlänge und der Mittelgesichtsbreite auf. Mit Ausnahme des Zahnkeims des zweiten Molars konnte ebenfalls eine Korrelation mit der Gesamtschädellänge und der Obergesichtshöhe nachgewiesen werden.
Der Abstand zwischen den Zahnwurzelspitzen und dem Sinus maxillaris war bei allen drei untersuchten Gattungen Pongo, Gorilla und Pan über den palatinalen Wurzeln der Molaren am kleinsten. Die Knochendicke über den Zahnwurzeln des Schimpansen ist im Vergleich zu den anderen Gattungen am dünnsten. Darüber hinaus konnte bei Pan troglodytes eine Abnahme der Knochendicke über den palatinalen Wurzelspitzen von anterior nach posterior nachgewiesen werden.
Bezüglich der Wurzellängen zeigten unsere Untersuchungen, dass bei allen drei Gattungen die distobukkale Wurzel des dritten Molars die kürzeste war. Die Mittelwerte der Wurzellängen von Pongo und Gorilla lagen sehr nah beieinander, der Gorilla hatte jedoch tendenziell längere Wurzeln. Die kürzesten Zahnwurzeln wies der Schimpanse auf.
Bei den Pongiden besteht eine enge topographische Beziehung der Zahnwurzeln der Oberkiefermolaren zum Sinus maxillaris. Besonders bei Pan bilden sich tiefe Recessus der Kieferhöhle zwischen den Zahnwurzeln aus. Beim Schimpansen ragen 40,5% der Molarenwurzeln in den Sinus maxillaris, beim Gorilla hingegen nur 18,1% und bei Pongo 16,6%.
Als Zufallsbefund stellten sich drei überzählige Zähne dar. Dabei handelte es sich um eine Doppelanlage des lateralen Milchschneidezahns eines juvenilen Orang-Utans, sowie um vierte Molaren bei einem Orang-Utan Weibchen und einem Gorilla Männchen.
Die hier vorgestellten Untersuchungsergebnisse erweitern die Kenntnisse über die Beziehungen der seitlichen Oberkieferzähne und dem Sinus maxillaris bei den Großen Menschenaffen. Damit bilden sie eine Grundlage für Studien an unterschiedlichen menschlichen Populationen sowie weiteren nicht-menschlichen Primaten.
In dieser Arbeit wurden 29 Patienten mit invasivem Peniskarzinom immunhistochemisch hinsichtlich ihrer Expression von KI67, Tenascin und Fibronectin untersucht. Hieraus sollte eine prognostische Bedeutung für den Tumor abgeleitet werden. Eine Abhängigkeit zwischen Grading bzw. Tumorstadium und Höhe des Ki67 – Labeling bestand bei Peniskarzinomen nicht. Ein hoher Ki67 – Index spricht für das Vorliegen einer lymphogenen Metastasierung, ab einem Label von 60% traten bei allen Patienten Lymphknotenmetastasen auf, in diesen Fällen sollte also eine Lymphadenektomie unbedingt angestrebt werden. Auf eine Entfernung von Lymphknoten kann man hingegen bei Patienten ohne Risikofaktoren mit einem schwachen Ki67 – Label verzichten, da bei diesen Tumoren keine Lymphknotenmetastasen nachweisbar waren. Ab einem Cut off von 50% für den Ki67 – Index zeigte sich im logrank - Test eine signifikante Verschlechterung des Überlebens. Ki67 scheint aus diesem Grund geeignet, als zusätzlicher prognostischer Parameter für das Peniskarzinom zu fungieren. 85% der Peniskarzinome mit intrazytoplasmatischer Tenascinexpression waren metastasiert. Die klinische Bedeutung liegt in einer zusätzlichen Information für Patienten mit intrazytoplasmatischer Tenascinexpression. Hier sollte eine inguinale Lymphadenektomie angestrebt werden. Insgesamt zeigten aber alle Peniskarzinome ein ähnliches Expressionsmuster für Tenascin bzw. Fibronectin, so dass eine Vorhersage von Lymphknotenmetastasen und damit eine prognostische Aussage zur Tumorerkrankung nicht möglich waren.
Die Morphologie der Podozytenfußfortsätze und eine intakte glomeruläre Basal-membran (GBM) sind essentiell für die Filtration des Blutes. Bei der diabetischen Nephropathie (DN), deren Inzidenz in den letzten Jahrzehnten deutlich gestiegen ist, kommt es neben pathologischen Veränderungen der Fußfortsätze auch zu Ablösung und Verlust der Podozyten. Als hochdifferenzierte, postmitotische Zellen können Podozyten nicht regeneriert werden. Jeder Verlust ist damit irreversibel. Aber auch weitreichende Veränderungen der GBM, sowie eine Sklero¬sierung der Glomeruli sind zu beobachten. Dies führt zu einer progredienten Nieren¬insuffizienz, welche oft im Nierenversagen endet. Man geht davon aus, dass glomeru¬lärer Hypertonus, der zur mechanischen Dehnung von Podozyten führt, ein wichtiger Teil des Pathomechanismus der DN ist. Welchen Einfluss mechanische Kräfte auf Podozyten haben war in der Vergangenheit nur unzureichend untersucht. Daher wurde von der AG Endlich ein Dehnungsapparat entwickelt, mit dem Zellen einer zyklischen mechanischen Dehnung ausgesetzt werden können. So konnte gezeigt werden, dass Podozyten mechanosensitiv sind und unter anderem mit Veränderungen des Aktin-Zytoskeletts auf mechanische Dehnung reagieren. Die vorliegende Arbeit zeigt zum einen, dass kultivierte Podozyten unter mechanischer Dehnung vermehrt das Protein Fibronektin bilden. Fibronektin ist ein essentielles Matrixprotein und spielt als Mechanotransducer in der Literatur eine große Rolle. Zum anderen zeigt die Arbeit, dass Fibronektin eine Schlüsselrolle hinsichtlich der Adhäsivität von kultivierten Podozyten unter mechanischer Dehnung spielt. Um das zu untersuchen, wurden Podozyten mit Fibronektin-Knockdown und -Knockout generiert und der Einfluss auf die Morphologie und Adhäsiviät der Podozyten untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Podozyten ohne Fibronektin bei mechanischer Dehnung nach drei Tagen nur noch zu etwa 20 % auf der Membranoberfläche adhärent waren. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass Fibronektin für die Adhäsion von kultivierten Podozyten unter mechanischer Dehnung eine zentrale Rolle spielt. Durch Immun¬fluoreszenz¬färbung konnte an Biopsien nachgewiesen werden, dass Fibronektin in der GBM von Patienten mit DN vermehrt eingelagert wird. Die vorliegenden Ergebnisse deuten darauf hin, dass mechanische Dehnung der Podozyten in vivo zu einer Akkumulation von Fibronektin in der GBM führt, was langfristig sehr wahrscheinlich die Eigenschaften der GBM und die glomeruläre Filtration negativ beeinflusst. Die genaueren Zusammenhänge zwischen Mechanotransduktion und Fibronektin-expression aufzuschlüsseln sollte daher Ziel weiterführender Forschungsarbeiten sein, um in Zukunft einen therapeutischen Ansatz zur Behandlung der diabetischen Nephropathie zu entwickeln.
Für eine intakte Filtration des Blutes sind hochspezialisierte Epithelzellen in den Glomeruli der Nieren, die Podozyten, essentiell. Der Verlust oder die Schädigung dieser postmitotischen Epithelzellen bzw. morphologische Veränderungen der komplex geformten Fortsätze dieser Zellen sind die häufigsten Ursachen für den Verlust der Filtrationsfähigkeit der Nieren. Diese besondere 3D-Morphologie der Podozyten hängt entscheidend vom Aktinzytoskelett und von Aktin-bindenden Proteinen ab. Aus der Literatur weiß man, dass das Aktin-bindende Protein Palladin einen entscheidenden Einfluss auf die Nukleation bzw. Polymerisation von Aktinfilamenten ausübt und dass Palladin sowohl die Morphologie als auch die Dynamik von Zellen bestimmt. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von Palladin hinsichtlich der Podozytenmorphologie und -funktion in vitro und in vivo erstmals untersucht.
Mittels in vitro Experimenten an kultivierten Podozyten der Maus konnte gezeigt werden, dass ein Knockdown von Palladin zu einer deutlichen Abnahme der Aktinfilamente und kleineren Fokalkontakte führt. Interessanterweise hatte dies aber keinen Einfluss auf die Adhäsionfähigkeit der Podozyten, sogar unter mechanischer Bean¬spruchung. Ferner konnte gezeigt werden, dass Palladin einen entscheidenden Einfluss auf die Expression anderer essentieller Aktin-assoziierter Proteine, wie Synaptopodin und α-Aktinin-4, aufweist.
Dass Palladin eine wichtige Rolle bei der Bildung und Stabilität von Aktinfilamenten spielt, konnte durch die Inkubation von kultivierten Palladin Knockdown-Podozyten mit verschiedenen Inhibitoren der Aktin-Polymerisation gezeigt werden. Die quantitative Auswertung mit Hilfe der Software F_Seg zeigte, dass Palladin Knockdown-Podozyten nach der Inkubation deutlich weniger Aktinfilamente und mehr Aktin-Cluster im Vergleich zu den Kontrollen aufweisen. Der Einsatz eines Migrations-Assays zeigte zudem, dass kultivierte Palladin Knockdown-Podozyten schneller migrieren und vermehrt dynamische Strukturen wie Lamellipodien und sogenannte Ring-Like-Structures (RiLiS) ausbilden.
Um den Einfluss von Palladin auf Podozyten in vivo zu untersuchen, wurden Mäuse generiert, bei denen Palladin spezifisch in den Podozyten ausgeknockt ist. Analysen der Glomeruli-Morphologie dieser Tiere mit Hilfe der Immunfluoreszenz-, Superresolution- und Elektronenmikroskopie (Raster- und Transmissionsmikros-kopie) zeigten eindeutig, dass die glomerulären Kapillaren stark erweitert waren und sich ein stark vergrößerter sub-podozytärer Raum ausgebildet hatte. Ferner waren die für die Filtration des Blutes maßgeblichen Fortsätze der Podozyten stark verbreitert und die Expression des essentiellen Schlitzmembranproteins Nephrin nach dem Knockout von Palladin signifikant reduziert.
Durch den Einsatz eines nephrotoxischen Serums wurde eine Glomerulonephritis induziert, die bei Podozyten-spezifischen Palladin-Knockout Mäusen zu einer stärkeren Schädigung der Glomeruli im Vergleich zu den Kontrolltieren führte. Dies deutet auf eine essentielle Rolle von Palladin für die Morphologie und Funktion der Filtrationsbarriere hin.
Des Weiteren konnte anhand von Nierenbiopsien nachgewiesen werden, dass die Palladin-Expression bei Patienten, die an einer fokal segmentalen Glomerulosklerose bzw. an der diabetischen Nephropathie erkrankt waren, im Vergleich zu den Kontrollnieren deutlich verringert ist.
Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, dass Palladin sowohl in vitro als auch in vivo einen entscheidenden Einfluss auf das Aktin-zytoskelett der Podozyten und somit auf die Funktion dieser hochspezialisierten Epithelzelle hat.
Die Prävalenz der chronischen Nierenerkrankung (CKD) nahm in den letzten Jahren
global stetig zu. Die häufigsten Ursachen für die CKD, arterielle Hypertonie und
Diabetes mellitus, sind oftmals mit einer glomerulären Hypertonie assoziiert, die eine
erhöhte mechanische Belastung der hochspezialisierten und postmitotischen
Podozyten verursachen kann. Dies führt zum sogenannten Effacement, einer
Verbreiterung und Abflachung der durch ein komplexes Aktin-Zytoskelett gestützten
Podozytenfußfortsätze und schließlich zum Ablösen von Podozyten von der
glomerulären Basalmembran. Auch kultivierte Podozyten reagieren auf mechanische
Dehnung mit Veränderungen ihres Aktin-Zytoskeletts. Über welchen Mechanosensor
die Podozyten mechanische Dehnung wahrnehmen, ist jedoch nicht geklärt.
Filamine bilden mit F-Aktin stabile Netzwerke und können bei mechanischer Veränderung
der Netzwerke durch Freilegung von Proteinbindestellen als Mechanosensor
fungieren. Die Herunterregulation von Filamin A in kultivierten Mauspodozyten führte
zu einem deutlichen Verlust der Aktin-Stressfasern. Zudem zeigten wir zum ersten
Mal, dass die Synaptopodin-Expression kultivierter Podozyten abhängig von der
Filamin A-Expression war. Ferner konnten wir Filamin A als neuen Interaktionspartner
von Synaptopodin, einem podozytenspezifischen Aktin-bindenden Protein, aufzeigen.
Da Filamine in mechanisch gedehnten kultivierten Mauspodozyten vermehrt exprimiert
wurden und der Verlust von Filamin A darüber hinaus zu einer reduzierten Expression
von Fokaladhäsionsproteinen führte, gingen wir von einer geringeren Adhäsivität
mechanisch gedehnter Filamin A Knockout-Podozyten aus. Interessanterweise war
die Adhäsivität erst nach gemeinsamem Verlust von Filamin A und B reduziert, was
wir auf einen Rescue-Mechanismus zwischen den Isoformen zurückführten. Auf Basis
dieser Ergebnisse nahmen wir auch eine erhöhte Expression von Filamin A in Podozyten
unter mechanischer Belastung in vivo an. In der Tat exprimierten Podozyten in
einem Mausschadensmodell glomerulärer Hypertonie sowie in Glomeruli von Patienten
mit diabetischer Nephropathie vermehrt Filamin A in den Podozytenfußfortsätzen.
Zusammenfassend legen die Ergebnisse nahe, dass Filamine entscheidende Funktionen
hinsichtlich der Aktin-Organisation sowie der Adhäsivität von mechanisch gedehnten
Podozyten ausüben und sogar möglicherweise als Mechanosensor in
Podozyten fungieren können, was in weiterführenden Studien untersucht werden wird.
Chronic kidney disease (CKD) is a major public health burden affecting more than 500 million people worldwide. Podocytopathies are the main cause for the majority of CKD cases due to pathogenic morphological as well as molecular biological alterations of postmitotic podocytes. Podocyte de-differentiation is associated with foot process effacement subsequently leading to proteinuria. Since currently no curative drugs are available, high throughput screening methods using a small number of animals are a promising and essential tool to identify potential drugs against CKD in the near future. Our study presents the implementation of the already established mouse GlomAssay as a semi-automated high-throughput screening method—shGlomAssay—allowing the analysis of several hundreds of FDA-verified compounds in combination with downstream pathway analysis like transcriptomic and proteomic analyses from the same samples, using a small number of animals. In an initial prescreening we have identified vitamin D3 and its analog calcipotriol to be protective on podocytes. Furthermore, by using RT-qPCR, Western blot, and RNA sequencing, we found that mRNA and protein expression of nephrin, the vitamin D receptor and specific podocyte markers were significantly up-regulated due to vitamin D3- and calcipotriol-treatment. In contrast, kidney injury markers were significantly down-regulated. Additionally, we found that vitamin D3 and calcipotriol have had neither influence on the expression of the miR-21 and miR-30a nor on miR-125a/b, a miRNA described to regulate the vitamin D receptor. In summary, we advanced the established mouse GlomAssay to a semi-automated high-throughput assay and combined it with downstream analysis techniques by using only a minimum number of animals. Hereby, we identified the vitamin D signaling pathway as podocyte protective and to be counteracting their de-differentiation.
Study of the effect of the podocyte-specific palladin knockout in mice with a 129 genetic background
(2023)
Worldwide, chronic kidney disease is one of the leading public health problems. Podocytes, highly specialized postmitotic cells in the filtration unit of the kidney glomerulus, are essential for the size selectivity of the filtration barrier. Loss of the complex 3D morphology of their interdigitating foot processes, effacement and detachment of the cells from the capillaries lead to proteinuria and often loss of kidney function.
Since the morphology of podocyte foot processes is highly dependent on an intact actin cytoskeleton and actin-binding proteins, we investigated the role of the actin-binding protein palladin in podocytes from mice with a 129 genetic background, that is more susceptible to kidney injury. PodoPalld129-/- mice were examined at 6 and 12 months of age using immunofluorescence staining, electron and 3D super-resolution microscopy as well as qRT-PCR.
Our analysis of PodoPalld129-/- mice at 6 and 12 months of age showed that podocyte- specific knockout of palladin results in dilation of the capillary tuft accompanied by loss of mesangial cells, indicating the influence of palladin on glomerular tuft formation. Besides, we observed morphological abnormalities such as an enlarged sub-podocyte space, cyst formations and an increased number of cell-cell contacts between podocytes and parietal epithelial cells in PodoPalld129-/- mice compared to controls. Moreover, palladin knockout resulted in downregulation of the slit diaphragm protein nephrin as well as an age-dependent significant increase in podocyte foot process effacement. Although there was a significant change in foot process morphology, we did not detect albuminuria in PodoPalld129-/- mice of both age groups. However, we found an increase of trefoil factor 1 (Tff1) in the urine of the mice, indicating an altered, more permeable filtration barrier.
Considering that palladin has several binding sites for important actin-binding and regulatory proteins, we studied the expression of Lasp-1, Pdlim2, VASP and Klotho in dependence on palladin. We found a remarkable reduction in, for example, phosphorylated Lasp-1 as well as Klotho, which could influence the morphology of podocyte foot processes.
Compared with PodoPalldBL/6-/- mice, PodoPalld129-/- mice showed stronger glomerular tuft dilation and developed podocytes with increased morphological abnormalities, underlining the importance of the genetic background.
In conclusion, these results demonstrate the essential role of palladin for podocyte morphology in mice with a 129 genetic background.
Die Gruppe der solute carrier (SLC) Transportproteine hat 396 Mitglieder unterteilt in 53 Familien. Die Familie SLC35 fasst die Nukleosidzucker-Transporter zusammen. Einer der Mitglieder ist SLC35F1. Die Funktion von SLC35F1 ist bislang unbekannt, jedoch konnte gezeigt werden, dass SLC35F1 mRNA im Gehirn und der Niere stark exprimiert wird.
Das Ziel dieser Arbeit war es, die Lokalisation und Funktion von SLC35F1 im murinen Gehirn genauer zu charakterisieren. Hierfür wurden an Schnitten muriner Gehirne Immunfluoreszenzfärbungen durchgeführt. Im Anschluss erfolgte eine quantitative Analyse des Verteilungsmusters in verschiedenen Hirnarealen. Weiterhin sollte die subzelluläre Lokalisation von SLC35F1 geklärt werden. Hierfür wurden die Glioblastomazellen der Reihe U251-MG genutzt. Diese wurden mit einem t-grün-fluoreszierenden Protein (GFP) gekoppelten SLC35F1 Plasmid transfiziert. Mit den transfizierten Zellen wurden Lokalisationsstudien sowie in vivo Beobachtungen durchgeführt.
Diese Arbeit konnte zeigen, dass es sich bei SLC35F1 um ein neuronenspezifisches Protein handelt. Es wird im ZNS ubiquitär exprimiert. Auf subzellulärer Ebene scheint SLC35F1 im Gegensatz zu den meisten Nukleosidzucker-Transportern nicht im ER oder Golgi-Apparat vorzukommen. Stattdessen scheint SLC35F1 mit dem recycling Endosomenmarker Rab11 assoziiert zu sein. In diesem Kontext kann spekuliert werden, dass SLC35F1, vermittelt über Rab11, an verschiedenen Prozessen, die die neuronale Plastizität und die Bildung von LTP und dendritischen Dornen beeinflussen, beteiligt ist. Auch erscheint ein Einfluss auf die neuronale Entwicklung und die Entwicklung von Störungen wie der pädiatrischen Epilepsie möglich. Die genaue Funktion von SLC35F1 bleibt jedoch weiterhin ungeklärt.
Increasing the information depth of single kidney biopsies can improve diagnostic precision, personalized medicine and accelerate basic kidney research. Until now, information on mRNA abundance and morphologic analysis has been obtained from different samples, missing out on the spatial context and single-cell correlation of findings. Herein, we present scoMorphoFISH, a modular toolbox to obtain spatial single-cell single-mRNA expression data from routinely generated kidney biopsies. Deep learning was used to virtually dissect tissue sections in tissue compartments and cell types to which single-cell expression data were assigned. Furthermore, we show correlative and spatial single-cell expression quantification with super-resolved podocyte foot process morphometry. In contrast to bulk analysis methods, this approach will help to identify local transcription changes even in less frequent kidney cell types on a spatial single-cell level with single-mRNA resolution. Using this method, we demonstrate that ACE2 can be locally upregulated in podocytes upon injury. In a patient suffering from COVID-19-associated collapsing FSGS, ACE2 expression levels were correlated with intracellular SARS-CoV-2 abundance. As this method performs well with standard formalin-fixed paraffin-embedded samples and we provide pretrained deep learning networks embedded in a comprehensive image analysis workflow, this method can be applied immediately in a variety of settings.
Obwohl in Deutschland kaum bekannt, existieren auch heute noch bei vielen afrikanischen, asiatischen und indianischen Stammesvölkern diverse rituelle Zahndeformierungspraktiken. Die Arbeit untersucht besonders am Beispiel des Volkes der Bench in Südwest- Äthiopien das Phänomen der Zahndeformierungen und prüft anhand einer wissenschaftlichen Auswertung die möglichen Folgen auf die Zahngesundheit und Gaumenmorphologie. Zentrale Fragestellung dieser Arbeit: Welche Einflüsse haben rituelle Zahndeformierungen auf das orofaziale System? Inhaltliche Schwerpunkte der Arbeit: - Überblick über kulturell bedingte Zahndeformierungspraktiken weltweit. - Beschreibung der Zahngesundheit und der Zahndeformierungspraktiken der Bench aus Äthiopien. - Prüfung der Auswirkungen der Zahndeformierung bei den Bench auf das orofaziale System unter Berücksichtigung der Gaumenmorphologie.
Vergleichende Untersuchungen über einen möglichen Einfluss von Lippen-Kiefer-Gaumenspalten (LKGS) auf die Morphologie des Sinus maxillaris haben zu widersprüchlichen Ergebnissen geführt. Die Durchsicht der Literatur hat gezeigt, dass sich diese Studien vorwiegend auf postnatale Entwicklungsstadien der Kieferhöhlen beschränken. Untersuchungen zur Entwicklung des fetalen Sinus maxillaris sind in der Literatur nur sporadisch zu finden. In der vorliegenden Arbeit wurde deshalb der Einfluss Procarbazin-induzierter Lippen-Kiefer-Gaumenspalten auf die Entwicklung des fetalen Sinus maxillaris und der knorpeligen Nasenkapsel von Rattus norvegicus untersucht. Vor dem Hintergrund, der in der Literatur schon vielfach beschriebenen spaltbedingten Wachstumsretardierung der knorpeligen Nasenkapsel und in Anbetracht der Tatsache, dass die Anlage der Kieferhöhle bereits ab dem 16. Entwicklungstag (post conceptionem) innerhalb der Nasenkapsel erfolgt (primäre Pneumatisation), könnte also ein Einfluss spaltbedingt veränderter Wachstumsmuster der knorpeligen Nasenkapsel auf die Morphologie des fetalen Sinus maxillaris angenommen werden. Die Untersuchungen erfolgten an histologischen Serienschnitten von 29 Köpfen männlicher Rattenfeten (21. Entwicklungstag) mit und ohne LKGS. Die Darstellung und Berechnung des Volumens der Kieferhöhlen erfolgte mit Hilfe eines 3D-Rekonstruktionsprogamms. Darüber hinaus wurden die Höhe und Breite der knorpeligen Nasenkapsel sowie die Höhe des knorpeligen Nasenseptums vermessen, um dann eine Beurteilung hinsichtlich möglicher Wechselbeziehungen zwischen der knorpeligen Nasenkapsel und dem sich in ihr entwickelnden Sinus maxillaris vornehmen zu können. Die Ergebnisse dieser Untersuchung haben gezeigt, das Procarbazin-induzierte LKGS zu signifikanten Wachstumsretardierungen der knorpeligen Nasenkapsel und des Nasenseptums führen, ein Einfluss auf die Morphologie des fetalen Sinus maxillaris war jedoch nicht nachweisbar. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass spaltbedingt veränderte Wachstumsmuster der knorpeligen Nasenkapsel keinen Einfluss auf die primäre Pneumatisation des Sinus maxillaris haben. Darüber hinaus deuten die Untersuchungsergebnisse darauf hin, dass die pränatale Entwicklung der Kieferhöhle nach einem eigenen Wachstumsmuster abläuft.
Die vorliegende Studie befasste sich mit der Morphologie des Canalis nasolacrimalis (CN) von Japanischen Makaken (Macaca fuscata) basierend auf der Untersuchung koronaler computertomographischer Schichtaufnahmen. Im ersten Teil der Studie wurde das geschlechtsspezifische Wachstum des CN anhand von 29 Schädeln in unterschiedlichen postnatalen Altersgruppen analysiert. Der zweite Teil befasste sich mit dem Einfluss geographischer und klimatischer Faktoren auf die Morphologie des Tränenkanals adulter Japanischer Makaken, die definierten lokalen Populationen entstammen. Im dritten Teil der Arbeit wurde schließlich die Morphologie des CN von Macaca fuscata mit der anderer Spezies der Faszikularis-Gruppe der Makaken (Macaca cyclopis, Macaca fascicularis, Macaca mulatta) verglichen.
Zur Darstellung der Morphologie des CN wurden anhand der koronalen CT-Schichtaufnahmen mit Hilfe der WinSurf Version 4.0® - Software 3D-Rekonstruktionen des CN angefertigt und die entsprechenden Volumina ermittelt. Darüber hinaus wurde die Länge des CN sowie der Winkel zwischen der Achse des CN und der Horizontalebene mit dem Programm OsiriX® Version 5.8.2 vermessen. Die ermittelten Maße des CN wurden mit externen linearen Schädelmaßen in Beziehung gesetzt, um den Einfluss der Schädelmorphologie auf den CN zu untersuchen.
Männliche und weibliche Japanische Makaken wiesen zahlreiche Übereinstimmungen in der Morphologie des CN auf. So erstreckte sich der CN vom orbitalen Eingang nach kaudal und lateral. Dabei befand sich der orbitale Eingang weiter medial als die Mündungsstelle in der Nasenhöhle. Erst ab der Altersgruppe 2 erschien der Sinus maxillaris gleichzeitig auf einem Schichtbild mit dem CN. Die Maße des CN vergrößerten sich mit zunehmendem Alter, wobei das Volumen des CN adulter männlicher Tiere größer war als das der weiblichen Tiere. Bis auf den linken CN adulter Tiere wiesen weibliche Individuen in allen anderen Altersgruppen einen längeren CN auf als männliche Individuen. Die größte Volumen- und Längenzunahme zeigten sich bei Männchen zwischen der Altersgruppe 3 und 4, bei Weibchen zwischen der Altersgruppe 1 und 2. Die Achse des CN war bei infantilen Tieren nahezu senkrecht zur Horizontalebene ausgerichtet und verlagerte sich mit zunehmenden Alter schräg nach vorne.
Für die Volumen-, Längen- und Winkelmessungen des CN konnten signifikante geschlechtsspezifische Unterschiede beobachtet werden. Jedoch waren die Unterschiede nicht einheitlich und betrafen nicht alle Altersgruppen. Die vorliegende Studie zeigte für Macaca fuscata einen statistisch signifikanten Zusammenhang zwischen dem Wachstum des CN und externen Schädelmaßen. Darüber hinaus zeigten die Vergleiche der Anstiege der Regressionsgeraden zwischen beiden Geschlechtern keine signifikanten Unterschiede. Somit ist anzunehmen, dass sich die Tränennasenkanäle beider Geschlechter mit einem ähnlichen Wachstumsmuster vergrößern.
Der Einfluss klimatischer und geographischer Faktoren auf den CN wurde an 37 Schädeln adulter Japanischer Makaken beiderlei Geschlechts von fünf definierten geographischen Regionen Japans untersucht. Dazu wurden die ermittelten Maße des CN in Relation zu Klimadaten gesetzt. Für das Volumen ergaben sich keine statistisch signifikanten Unterschiede im Populationsvergleich. Jedoch unterschieden sich die Messwerte der lokalen Gruppen hinsichtlich der Länge und der Achsenneigung des CN signifikant voneinander. Zudem konnten für den linken CN signifikante Beziehungen zur geographischen Lage und der kleinsten Januartemperatur herausgearbeitet werden. Da dieser Zusammenhang nur für eine Seite beobachtet werden konnte, besteht weiterer Untersuchungsbedarf.
Schließlich wurden die vier Spezies der Faszikularis-Gruppe bezüglich der Morphologie des CN anhand von 34 adulten Schädeln beiderlei Geschlechts untersucht. Statistisch signifikante Unterschiede ergaben sich für das Volumen und die Länge des CN. Während für den CN von Macaca fuscata bezüglich Volumen und Länge die größten Messwerte bestanden, zeigte Macaca mulatta die kleinsten Messwerte. Hinsichtlich der Ausrichtung des CN zur Horizontalebene bestanden keine Speziesunterschiede.
Die Ergebnisse dieser Untersuchung beschreiben nicht nur den Tränennasengang innerhalb einer Wachstumsreihe von Macaca fuscata, sondern liefern erstmals Erkenntnisse über die Morphologie des CN bei verschiedenen geographischen Populationen der Rotgesichtsmakaken sowie der Faszkularis-Gruppe. Angesichts der bekannten Unterschiede zwischen Catarrhini und Platyrrhini bezüglich der Morphologie der Nasenhöhle sind weiterführende Untersuchungen notwendig um die Faktoren, welche die Morphologie des Tränennasengangs beeinflussen, weiter zu ergründen.
Anhand von 44 Schädeln verschiedener postnataler Altersgruppen von Pan troglodytes wurde das postnatale Wachstum der Nasennebenhöhlen für männliche und weibliche Tiere untersucht. Aufgrund des Fehlens der genauen Altersangaben zum Todeszeitpunkt der Tiere wurden die Schädel anhand der Dentition in 3 Altersgruppen eingeteilt. Zur Darstellung der Morphologie der Nasennebenhöhlen wurden von allen Schädeln computertomographische Schichtaufnahmen angefertigt. Mit Hilfe der Software Winsurf® 4.0 wurden dann die Volumina der Nasennebenhöhlen berechnet und eine 3D-Rekonstruktion der Nasennebenhöhlen erstellt. Das Volumen der Nasennebenhöhlen von Pan troglodytes war in allen Altersgruppen bei den männlichen Tieren stets größer als bei den weiblichen Tieren. Die Kieferhöhle des Schimpansen ist durch den Recessus palatinus, Recessus alveolaris, Recessus frontalis und Recessus zygomaticus erweitert. Recessus palatinus und Recessus alveolaris sind schon in Altersgruppe 1 vorzufinden, die anderen Recessus dagegen sind erst ab Altersgruppe 2 zu beobachten. Die Wurzeln der Molaren reichen meist in das Lumen der Kieferhöhle. Der Sinus sphenoidalis beginnt ab Altersgruppe 1 und 2 anterior im Processus pterygoideus. Die Anzahl der Siebbeinzellen ist beim Schimpansen variabel. Neben zwei bis drei größeren Siebbeinzellen waren häufig weitere kleine Hohlräume vorhanden. Die hinteren Siebbeinzellen überragen das Dach des Sinus sphenoidalis und stehen in engem Kontakt zum Canalis opticus. Für den Sinus frontalis lässt sich feststellen, dass er sich erst ab Altersgruppe 2 zwischen den beiden Orbitae entwickelt. Ab Altersgruppe 3 erreicht der Sinus frontalis den Torus supraorbitalis. Das Wachstum der Nasennebenhöhlen wurde aufgrund des Fehlens des genauen Alters mit Hilfe einer einfachen linearen Regressionsanalyse für männliche und weibliche Tiere getrennt untersucht. Als Bezugsgröße diente die Schädelbasislänge und die größte Schädellänge. Mit Ausnahme des Sinus sphenoidalis vergrößern sich die Nasennebenhöhlen männlicher und weiblicher Schimpansen nach einem ähnlichen Wachstumsmuster. Die Nasennebenhöhlen des Schimpansen wiesen zu fast allen erhobenen Schädelmaßen signifikante Korrelationen aus. Bei der Betrachtung der Asymmetrie der Nasennebenhöhlen konnten wir feststellen, dass der Sinus frontalis die größte Asymmetrie aufweist, gefolgt von Sinus sphenoidalis und Cellulae ethmoidales. Dagegen verhalten sich die Kieferhöhlen symmetrisch.Das postnatale Wachstum der Kieferhöhlen von Pan troglodytes, Pongo pygmaeus und Macaca fuscata lässt sich durch speziesspezifische Regressionsgeraden beschreiben. Der Vergleich des postnatalen Wachstum des Kieferhöhlenvolumens von Pan troglodytes, Pongo pygmaeus und Macaca fuscata zeigt jedoch, dass sich die Kieferhöhlen dieser drei Primatenspezies vermutlich nach einem ähnlichen Wachstumsmuster entwickeln.
Fehlfunktionen oder der Verlust von Podozyten führen zu Glomerulopathien, welche in ca.
90 % der Fälle die Ursache für eine Niereninsuffizienz ist. Der Verlust resultiert aus einer
fehlerhaften Haftung an der glomerulären Basalmembran unter anderem durch eine erhöhten mechanischen Beanspruchung, zum Beispiel bei erhöhtem Blutdruck. Die Erforschung
des Zusammenspieles aus dem Aktin-Zytoskelett und den Fokaladhäsionen verspricht hier
einen Erkenntnisgewinn über die Mechanismen der Adhäsion und der Resistenz gegen äußere Kräfte.
Die Fluoreszenzmikroskopie erlaubt eine detailreiche Abbildung dieser Strukturen. Die anschließende Beschreibung oder Quantifizierung ist allerdings aufgrund der ungeordneten
und statistisch verteilten Formen und Anordnungen der Filamente und Fokaladhäsionen
erschwert. Moderne computergestützte Bildauswertungsmethoden stellen hier eine Ausweg
dar, weil sie eine große Anzahl von Zellen mit einer beliebigen Detailgenauigkeit nach festen
Regeln untersuchen können. Das Ziel dieser Arbeit ist die Entwicklung und Testung von
solchen Methoden zur quantitativen Bildauswertung für die Merkmalsextraktion von Fokaladhäsionen, des Aktin-Zytoskelettes und der Zellform bei Podozyten.
Damit einzelne Zellen verglichen werden können, müssen die Zellgrenzen erkannt werden.
Dies ist erschwert durch sich überlappende Zellen und die selektive Bildinformation von
Fluoreszenz-Bildern.
Es konnten zwei Methoden etabliert werden. Eine hat einen hohen Automatisierungsrad, basiert auf Voronoi-Diagrammen und ist geeignet zur Auswertung von vielen Zellen. Die andere
ist semi-automatisiert und erreicht eine hohe Genauigkeit beim Erkennen der Zellgrenzen.
Hiernach werden die Zellen durch Bestimmung gängiger Formfaktoren charakterisiert und
insbesondere Filopodien in ihrer Anzahl und Größe analysiert.
Der Algorithmus zur Analyse des Aktin-Zytoskelettes fußt auf einer neuen iterativen Programmstruktur. Diese ermöglicht das Beobachten von pathologischen Veränderungen des
Aktin-Zytoskelettes ohne die Parameter neu zu justieren. Es wird der vollständige Datensatz aus Länge, Breite und Orientierung der beliebig gekrümmten Aktin-Fasern extrahiert.
Das präsentierte Programm zur Auswertung der Fokaladhäsionen wurde für eine hohe Sensitivität und Spezifität optimiert. Es werden die wichtigen Merkmale Anzahl, Fläche und
Orientierung für alle Fokaladhäsionen bestimmt. Die Orientierung der Fokaladhäsionen wird
erstmals sehr robust durch die Bestimmung des Gradientenfeldes der Fluoreszenz-Intensität
berechnet.
Die Programme wurden mit Matlab implementiert und jeweils mit einer eigenständigen
Programmoberfläche ausgestattet. Außerdem wurde auf eine intuitive Bedienbarkeit und
Anwenderfreundlichkeit geachtet.
Eine erste Anwendung fanden die etablierten Methoden bei der Erforschung der Bedeutung
von Palladin und Fascin-1 auf das Zytoskelett. Bei Palladin-Knockdown-Podozyten konnte
eine Abnahme der Aktinfilamente und eine höhere Vulnerabilität auf Toxine gefunden werden. Ein Fascin-1-Knockdown bewirkt eine Abnahme der Fokaladhäsionen in ihrer Anzahl
und Fläche.
Weitere Auswirkungen von intrinsischen oder extrinsischen Veränderungen auf das Zytoskelett und die Zellform können mit den hier etablierten Methoden in Zukunft untersucht
werden. Tiefere Einblicke in die Funktionsweise des Zytoskelettes sind auch durch die Korrelation dieser neu zugänglichen Merkmale untereinander und ggf. durch ein Abgleich mit
Modellen zur Simulation der Dynamik des Aktin-Zytoskelettes erwartbar.
Die Behandlung des trockenen Auges erfolgt hauptsächlich symptomatisch mit Tränenersatzmitteln. Eine Vielzahl an Benetzungsmitteln mit unterschiedlichen Wirk- und Zusatzstoffen zum Ausgleich des Tränenmangels und zum Schutz der Schleimhaut wurde entwickelt. In einem standardisierten Zellkulturmodell wurde die protektive Wirkung verschiedener Präparate untersucht. Als Indikator zur Erfassung vitaler Zellen wurde Alamar blue genutzt. Nach Inkubation der Zellkulturen mit den Benetzungsmitteln wurden vier Austrocknungszeiten unter einem konstanten Luftstrom eingehalten. Anschließend wurde der Redoxindikator appliziert und nach vier Stunden Inkubation wurde die Absorption von Alamar blue mit dem ELISA-Reader bestimmt. Mit zunehmender Austrocknungszeit kam es bei allen Benetzungsmitteln zum Verlust vitaler Zellen in den geprüften Zellkulturen. Das Präparat mit einer Kombination der Wirkstoffe PVA und PVP zeigte einen signifikant besseren Schutzeffekt auf die Zellkulturen. Die mit Benzalkoniumchlorid konservierten Mittel führten zum höchsten Verlust vitaler Zellen. Hier konnten Präparate mit dem Konservierungsmittel Oxyd bessere Ergebnisse erzielen.
Chronic alcohol abuse is one of the most common addictions and one of the most substantial public health problems as it affects millions of people physically as well as mentally around the world. Globally more than 3 million deaths are assignable to alcohol intake each year. Chronic alcoholism is a multi-component disease and its development is associated with both environmental as well as genetic factors. However, the key mechanisms underlying an addiction, especially on a cellular and physiological basis, are still unknown. Bio-medically an influence of chronic alcohol consumption on synaptic plasticity in the brain of humans as well as rodents has been proven.
On the dendritic shaft of nervous brain cells, small membrane protrusions called dendritic spines can be found. These spines possess the capacity to change their morphology and quantity and are thought to play an important role in learning and memory forming, and seem to be impaired in multiple neurological disorders. These dynamics are called synaptic plasticity. Most of these studies however, were carried out on the cortex. These previous observations raise the question whether such alterations in synaptic plasticity can also be observed in regions of the brain that contribute to the limbic system and therefore to the processing of emotional responses, learning and decision making. The amygdala is of special interest when trying to understand the neurobiology and pathophysiology that lead to the emergence and up keeping of an alcohol addiction. In this thesis a closer look has been taken at possible alterations in synaptic plasticity within different amygdaloid nuclei by the help of a rat model. These rats were put into the so called postdependent state, one of the most common animal models to investigate excessive ethanol intake in rodents. The postdependent state is a model in which the key driving force to obtain alcohol as part of a preserved addiction cycle is based on negative affect. Studies showed differences in the behavioural outcome of those animals that were exposed to chronic intermittent alcohol consumption compared to a control group, so it was of special interest to see whether those behavioural changes also show on a cellular basis.
In the study, a morphological comparison of the spine length as well as the spine density of alcohol dependent rats with a comparable control group has been made. The medial, the central, the lateral and the basolateral amygdaloid nucleus were of special interest in this research project.
The results showed no significant difference of the spine densities in any of the four amygdaloid regions. When comparing the spine morphology within the ethanol and the control group, differences showed in the lateral amygdaloid nucleus. In this region the spines of the ethanol group were significantly smaller. This leads to the conclusion that chronic alcohol intake can have an influence on the spine morphology and hence alter anatomical brain structures.
80% of chronic kidney diseases are caused by the loss and the damage of a differentiated and postmitotic cell type, the podocytes. The size-selectivity of the blood filtration barrier is highly dependent on the complex interdigitation of the podocyte foot processes as well as of the slit membrane which is spanned in between. Changes of this specific morphology as well as a detachment of podocytes lead to the clinical hallmark of a nephrotic syndrome e.g. proteinuria and oedema formation.
Since specific drugs or therapies are usually not available, patients are often dependent on dialysis and transplantation. Therefore, intensive studies are necessary to understand the pathogenesis of glomerulopathies as well as to identify specific drugs. In the past, it was already demonstrated that the zebrafish is an ideal model to study kidney function and to screen for drugs, since the larvae quickly develop a simple glomerulus that is comparable to the glomeruli of mice, rat and human.
In the present work, a zebrafish model was established to study a specific glomerulopathy named focal segmental glomerulosclerosis (FSGS). FSGS is mainly characterized by histology of the glomeruli which shows segmental scar formation and matrix deposition due to an activation of parietal epithelial cells (PEC) lining the Bowman’s capsule. For this purpose, we used the nitroreductase/metronidazole (NTR/MTZ) system, in which a cytotoxic agent is exclusively generated in podocytes by the enzyme NTR resulting in apoptosis of cells. Firstly, the parameters for development of an FSGS-like disease were evaluated and the glomerular response to podocyte depletion was examined during three days after the induction of podocyte damage. Using classic histological techniques, immunofluorescence staining and transmission electron microscopy, it was possible to demonstrate that zebrafish larvae phenocopy human FSGS in important characteristics after partial podocyte depletion. Secondly, by intravascular injection of fluorescence-labeled high molecular weight dextran, we found that the filtration barrier became leaky. Moreover, we identified a severe podocyte foot process effacement, formation of subpodocyte space pseudocysts and loss of the slit membrane protein podocin. Morphometrical, histological and ultrastructural analysis revealed an enlargement of the glomerulus, proliferation of cuboidal PECs and intraglomerular deposition of extracellular matrix components, all typical hallmarks of FSGS. Further, we observed adhesions between the parietal and the visceral glomerular cell layer forming sclerotic lesions. However, it remains still unclear whether an inflammatory response is involved in the development of sclerotic lesions. Our microscopic analysis provided some evidence for immigration of immunocompetent cells like neutrophils, presumably due to induction of apoptosis in our model.
Taken together, in the present work a zebrafish model was established with characteristics of mammals FSGS which will be useful for pathomechanism studies as well as for drug screening.
Together with endothelial cells and the glomerular basement membrane, podocytes form the size-specific filtration barrier of the glomerulus with their interdigitating foot processes. Since glomerulopathies are associated with so-called foot process effacement—a severe change of well-formed foot processes into flat and broadened processes—visualization of the three-dimensional podocyte morphology is a crucial part for diagnosis of nephrotic diseases. However, interdigitating podocyte foot processes are too narrow to be resolved by classic light microscopy due to Ernst Abbe's law making electron microscopy necessary. Although three dimensional electron microscopy approaches like serial block face and focused ion beam scanning electron microscopy and electron tomography allow volumetric reconstruction of podocytes, these techniques are very time-consuming and too specialized for routine use or screening purposes. During the last few years, different super-resolution microscopic techniques were developed to overcome the optical resolution limit enabling new insights into podocyte morphology. Super-resolution microscopy approaches like three dimensional structured illumination microscopy (3D-SIM), stimulated emission depletion microscopy (STED) and localization microscopy [stochastic optical reconstruction microscopy (STORM), photoactivated localization microscopy (PALM)] reach resolutions down to 80–20 nm and can be used to image and further quantify podocyte foot process morphology. Furthermore, in vivo imaging of podocytes is essential to study the behavior of these cells in situ. Therefore, multiphoton laser microscopy was a breakthrough for in vivo studies of podocytes in transgenic animal models like rodents and zebrafish larvae because it allows imaging structures up to several hundred micrometer in depth within the tissue. Additionally, along with multiphoton microscopy, lightsheet microscopy is currently used to visualize larger tissue volumes and therefore image complete glomeruli in their native tissue context. Alongside plain visualization of cellular structures, atomic force microscopy has been used to study the change of mechanical properties of podocytes in diseased states which has been shown to be a culprit in podocyte maintenance. This review discusses recent advances in the field of microscopic imaging and demonstrates their currently used and other possible applications for podocyte research.
LASP-1 (LIM und SH3 Protein 1) ist ein aktinbindendes Struktur- und Signalprotein. Es spielt eine Rolle bei der Migration, Proliferation und Differenzierung von Zellen. Im Mamma-, Ovarial- und Urothelkarzinom sowie im kolorektalen und hepatozellulären Karzinom werden Überexpressionen beschrieben, die mit klinischen Parametern korrelieren. In dieser Arbeit wurde die Lokalisation des Proteins im benignen Prostatagewebe, in der prostatischen intraepithelialen Neoplasie (PIN) und im Prostatakarzinom analysiert. Hierzu wurden Gewebeschnitte von Prostatakarzinomen von insgesamt 50 Patienten mittels Immunhistochemie und Prostatakarzinomzelllinien (DU-145, PC-3, LNCaP) mittels Immunfluoreszenz und Transfektion von LASP-GFP-Plasmiden untersucht. LASP-1 wurde im Zytoplasma und im Zellkern von Zellen nicht-neoplastischer Drüsen und Zellen der prostatischen intraepithelialen Neoplasie (PIN) exprimiert. Im Prostatakarzinom war eine heterogene LASP-1-Expression auffällig. In den Zellkernen des Prostatakarzinoms kam eine starke Immunreaktivität signifikant häufiger vor als in denen nicht-neoplastischer Zellen. Die Intensität der Immunfärbung für LASP-1 nahm mit fortschreitender Entartung der Gewebe zu, d. h. Zellen der Perineuralscheideninvasionen wiesen die stärkste Anfärbung auf. Des Weiteren war mit steigendem Gleason-Muster eine vermehrte Expression von LASP-1 in den Zellkernen der Tumorzellen zu finden. Je höher die T-Kategorie des Karzinoms war, desto mehr LASP-1 kam in den Zellkernen der Tumorzellen vor. Bei positivem Lymphknotenstatus zeigte sich vermehrt eine starke Immunreaktivität in den Zellkernen der Tumorzellen im Primärtumor. In den Prostatakarzinomzelllinien DU-145, PC-3 und LNCaP wurde LASP-1 immunzytochemisch nachgewiesen und eine Kolokalisation mit Aktin in der Zellperipherie an Zell-Zell-Kontakten, Zell-Substrat-Kontakten und Zellmembranausläufern bestätigt. Außerdem zeigte sich eine Kolokalisation von LASP-1 und Vinculin in Fokaladhäsionen und Zell-Zell-Kontakten. Die Transfektion der Zellen mit LASP-GFP-Plasmiden führte zu einer Hemmung der Zellmigration in den Prostatakarzinomzelllinien DU-145 und LNCaP, während bei PC-3-Zellen die Migration nicht durch die Transfektion beeinflusst wurde. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen folgern, dass LASP-1 eine Rolle für die Adhärenz und Motilität von Prostatakarzinomzellen spielt und ein Zusammenhang zwischen der LASP-1-Expression und der Malignität sowie klinischen Parametern des Prostatakarzinoms besteht.
Um herauszufinden, inwiefern das Tragen weicher Kontaktlinsen die Expression spezifischer Apoptose-assoziierter Gene in der Konjunktiva verglichen mit jungen und alten Augengesunden verändert, wurden in der vorliegenden Studie Bindehautzellproben von 25 jungen Trägern weicher Kl mittels Impressionszytologie gewonnen. Zur Beurteilung der exprimierten Apoptose-Faktoren wurden die Proben einer RT-PCR unterzogen. Verglichen mit augengesunden Gleichaltrigen wurden im Expressionsmuster 4 signifikante Unterschiede (Casp 3 (p=0,000), Casp 5 (p<0,004), Casp 8 (p<0,046) und Bax (p<0,037)) gefunden, während bei dem Vergleich zwischen den jungen Kl-Trägern und alten Augengesunden lediglich 2 signifikante Unterschiede (c-myc (p<0,049) und Bag-1 (p<0,001)) detektiert wurden. Folglich kann vermutet werden, dass das Tragen von Kl einen inadäquaten verfrühten Alterungsprozess von Bindehautzellen bewirken kann.
Leda-1 ist ein 2010 entdecktes Transmembranprotein, das im neuronalen Gewebe exprimiert
wird. Bis zum jetzigen Zeitpunkt identifizierte Interaktionspartner sind PILRα und GABABRezeptor-
Komplexe. 2016 wurde bei einem Kleinkind eine homozygote Defizienz des
entsprechenden Gens festgestellt. Der Junge wies Dysmorphien und eine allgemeine
Entwicklungsstörung auf. Ziel dieser Arbeit ist es, Auswirkungen der Defizienz von Leda-1
im Mäusegehirn unter neuroanatomischen Gesichtspunkten zu erfassen und zu bewerten.
Die Mäusegehirne wurden makroskopisch auf Gewicht und Volumen und mikroskopisch
anhand immunhistochemisch gefärbter Hirnschnitte untersucht. Die Färbung erfolgte mit
CNPase- und GFAP-Antikörpern sowie DAPI als Gegenfärbung. Die Schichtdicken
ausgewählter Bereiche des Neocortex’, des Hippocampus und verschiedener Fasertrakte
wurden vermessen und die Astrozytendichte der CA1-Region des Hippocampus wurde
bestimmt. Zur Untersuchung der adulten Neurogenese wurden als Marker Progenitorzellen
in der subgranulären Zone des Gyrus dentatus gezählt. Anhand von In-situ-
Hybridisierungsbildern wurde das Vorkommen von Leda-1 im Mäusegehirn beschrieben.
Das Gewicht der KO-Gehirne wies keinen Unterschied zur Kontrollgruppe auf. Das
Volumen war leicht erhöht. Im Stratum moleculare und im Stratum granulare des Gyrus
dentatus wurden signifikant geringere Schichtdicken bei den KO-Tieren gemessen. Die
Astrozytendichte war im untersuchten Bereich bei KO-Tieren vermindert. Die adulte
Neurogenese wies keinen messbaren Unterschied auf. Die Auswertung der In-situ-
Hybridisierungsbilder zeigte eine weit verbreitete Expression von Leda-1 in Neuronen des
gesamten Gehirns. Besonders stark stellte sich die Expression in den Purkinjezellen des
Kleinhirns dar.
Die Defizienz von Leda-1 bewirkt verschiedene neuroanatomische Veränderungen. Die
verringerten Schichtdicken könnten auf eine alterierte Zellzusammensetzung
zurückzuführen sein. Der Einfluss von Leda-1 auf die Astrozyten kann als Wirkung auf das
Immunsystem interpretiert werden. Wahrscheinlich beeinflusst Leda-1 auch die adulte
Neurogenese. Die makro- und mikrostrukturellen Veränderungen des Mäusegehirns, die
Wirkung auf das Immunsystem und die adulte Neurogenese sowie eine mögliche
Verbindung zur Autismus-Spektrum-Störung bleiben Thema zukünftiger Forschung.
Einleitung: In unseren Untersuchungen an Kiefergelenken (KG) von menschlichen und Cercopithecus mona Präparaten haben wir die Strukturen, die die Protrusionsbewegung führen, morphologisch und biomechanisch untersucht. Die protrusive Funktion wird im KG durch eine dimere Kette (DK) beschrieben. Es wurden die knöchernen Konturen vermessen, und die Anordnung der DK im Raum untersucht. Material und Methode: Wir haben sagittale Schnittserien von 9 humanen und 20 KG-abformungen des Cercopithecus untersucht. Die Konturen wurden durch Kreisabschnitte beschrieben und vermessen. Zwischen Tuberculum und der Fossa wurde der Wendepunkt (WP) eingezeichnet. Teilweise lag kein WP sondern ein Wendebereich (WB) vor. Bei den Cercopithecus-KGs wurde die Länge der DK sowie der Winkel zur FH gemessen. Der Punkt am Condylus mit dem geringsten Abstand zum Os temporale ist P. Ergebnisse: Die DK ist im mittleren KG-bereich am längsten. In 49% schneidet DK P. Der Winkel DK/FH ist fast konstant. Beim Vergleich der linken und rechten KGs konnten kaum morphologische Korrelationen festgestellt werden. Diskussion: Es gibt starke morphologische Schwankungen zwischen rechten und linken KGs, die biomechanische Zuordnung konnte aber seitengleich gefunden werden. Mit einer Toleranz von 1mm geht DK immer durch P. DK ist im mittleren KG-bereich am längsten und verläuft von lat. nach med. fast parallel. Vermutlich deuten bei statischer Betrachtung alle DKs in einem KG auf eine Rotationsachse.
SLC35F1 is a member of the sugar-like carrier (SLC) superfamily that is expressed in the mammalian brain. Malfunction of SLC35F1 in humans is associated with neurodevelopmental disorders. To get insight into the possible roles of Slc35f1 in the brain, we generated Slc35f1-deficient mice. The Slc35f1-deficient mice are viable and survive into adulthood, which allowed examining adult Slc35f1-deficient mice on the anatomical as well as behavioral level. In humans, mutation in the SLC35F1 gene can induce a Rett syndrome-like phenotype accompanied by intellectual disability (Fede et al. Am J Med Genet A 185:2238–2240, 2021). The Slc35f1-deficient mice, however, display only a very mild phenotype and no obvious deficits in learning and memory as, e.g., monitored with the novel object recognition test or the Morris water maze test. Moreover, neuroanatomical parameters of neuronal plasticity (as dendritic spines and adult hippocampal neurogenesis) are also unaltered. Thus, Slc35f1-deficient mice display no major alterations that resemble a neurodevelopmental phenotype.
Ziel dieser Arbeit ist die Analyse des kinematischen Gleichgewichts am proximalen Interphalangealgelenk mit Hilfe einer modellhaften Darstellung. Anhand der neuen Erkenntnisse über die morphologischen Inkongruenzen im proximalen Interphalangealgelenk ergibt sich eine neue Vorstellung des kinematischen Ablaufes der Gelenkbewegung: Bei der Beugung dreht sich das Gelenk nicht nur um eine fixe Bewegungsachse, sondern um zwei Achsen. Diese entsprechen im ebenen Bild den beiden Mittelpunkten der Gelenkflächenkrümmungen und werden als dimere Kette bezeichnet. Mit diesen biomechanischen Grundlagen wurde eine Rekonstruktion des proximalen Interphalangealgelenkes in der Sagittalebene angefertigt, an dem die Gelenkmechanik unter Einwirkung der aktiven Muskelkräfte des M. flexor digitorum, M. extensor digitorum sowie der intrinsischen Muskeln untersucht werden konnte. Die dargestellten Muskelkräfte in unserem Funktionsmodell bedingen verschiedene Gleichgewichtslagen des Gelenkes, so dass bei ihrer Variation unterschiedliche Auslenkungen der Drehungen um die beiden Mittelpunkte erfolgen. Eine besondere Stellung nimmt hierbei die intrinsische Muskulatur ein, die in der beugenden Bewegung dem M. flexor digitorum entgegenwirkt Dieser spezielle Einfluss des M. lumbricalis auf die Gelenkmechanik hat relevante Auswirkungen auf die Lubrikation und Ernährung des Gelenkknorpels. Des Weiteren hat dieser Effekt entscheidende Bedeutung für die Erstellung von Fingergelenksprothesen, die gegenwärtig immer mehr Anwendung finden. Durch ein verbessertes Verständnis der Kinematik der Fingerbewegungen ist es möglich, eine den morphologischen Gegebenheiten getreue Prothese zu erstellen und so einen normalen „physiologischen Bewegungsablauf“ zu rekonstruieren.
Georg Wetzel Werk für die Entwicklungsmechanik geboren: 29.12.1871 in Wittenberge, gestorben: 13.09.1951 in Halle; Konfession: evangelisch; Vater: praktischer Arzt Dr. Edmund Wetzel; Wetzel war Schüler von A. Kossel und K. Hürtle in der Psychologie und W. Roux in der Anatomie und Entwicklungsmechanik; Wilhelm Roux gilt als der Begründer der Entwicklungsmechanik; Wetzl war 1918 - 1924 Professor und Abteilungsvorsteher am Anatomischen Institut zu Halle unter W. Roux und H. Stieve; 1924 - 1930 am Anatomischen Institut in Greifswald unter K. Peter; 1930 - 1936 Direktor des für ihn neu gegründeten Instituts für Entwicklungsmechanik in Greifswald; Schriftenverzeichnis ca. 80 Werke; (Lehrbuch der Anatomie für Zahnärzte und Studierende der Zahnheilkunde, Handbuch der Anatomie des Kindes) intensive Zusammenarbeit mit Zahn-, Mund- und Kiefernheilkunde.
Bei der Entwicklung der hier beschriebenen Prothese mit medial-lateral asymmetrischen Gelenkflächen und damit gegebenen naturnahen Funktionen wurden Antworten auf folgende Fragen gesucht: 1) Welche funktionellen Eigenschaften hat das natürliche Tibiofemoralgelenk und welche Bedeutung hat dabei die medial-laterale Asymmetrie? 2) Welche funktionellen Eigenschaften des natürlichen Knies werden durch die gegenwärtigen Knieendoprothesen beeinträchtigt bzw. zerstört? 3) Welche Funktionsdefizite könnten von einer Prothese mit naturnaher Gelenkgeometrie ausgeglichen werden? 4) Welche Probleme werden durch den künstlichen Gelenkersatz erzeugt und wie können diese minimiert werden? 5) Wie erfolgreich ist eine solche Prothese im klinischen Einsatz? Das Roll-Gleit-Verhalten des natürlichen Kniegelenkes beruht auf der besonderen Gestaltung der Gelenkflächen. Die tibiale Gelenkfläche ist im lateralen Kompartiment sagittal konvex geformt, der Krümmungsmittelpunkt der femoralen Gelenkfläche gegenüber der tibialen ist nach posterior verschoben und die Gelenkkontakte liegen transversal auf den Abhängen des Höckers der tibialen Gelenkfläche. Die neue Knieendoprothese wurde nach diesem kinematischen Modell konstruiert. Das natürliche Roll-Gleit-Verhalten dieser Prothese konnte in umfangreichen Untersuchungen nachgewiesen werden. Eine Beweglichkeit von 0° bis 90° Beuge erreichen postoperativ nur 60% der Patienten. Konventionelle Knieendoprothesen bilden die natürliche Kinematik nur unzureichend ab, zu einem großen Teil wird die Mechanosensorik im Tibiofemoralgelenk zerstört. Das Gehen mit der konventionellen Prothese muss neu erlernt werden, meist ist eine Gehhilfe erforderlich. Eine Knieendoprothese mit natürlichem Roll-Gleit-Verhalten stellt die mechanische Funktion des Kniegelenkes wieder her. Zur Kompensation der fehlenden Mechanosensorik können gelernte Programmschleifen des muskulären Systems wieder abgerufen werden. Das Gehen mit der neuen Prothese muss nicht neu erlernt werden. Die Langzeiterfolge von Knieendoprothesen werden durch Polyethylenverschleiß und aseptische Lockerungen beeinträchtigt. Das Verschleißproblem wird mit der ÆQUOS™ Knieendoprothese durch das überwiegende Rollen in der Standphase verringert, die tribologischen Untersuchungen zeigen gute Ergebnisse. Das natürliche Roll-Gleit-Verhalten verteilt die kritischen Spannungen auf einen großen Bereich des Tibia-Inlays und verhindert so ein vorzeitiges Totalversagen. Aus der natürlichen Oberflächengestalt des Kniegelenkes wurde ein geometrisches Modell des dazugehörigen Viergelenkes entwickelt. Dieses Viergelenk wurde auf das Roll-Gleit-Verhalten im Knie angepasst. Das Viergelenk stellt für jeden Beugewinkel eine kinematisch stabile Position ein. Mit diesem Modell wurde ein Implantatsystem für das Knie konstruiert und gefertigt. Im Rahmen der medizinischen Zulassung wurden Verschleißuntersuchungen und FEM-Berechnungen erstellt, deren Ergebnisse wieder in die Konstruktion und Fertigung eingingen. Über die Ausführung der Viergelenke im sagittalen und im frontalen Schnitt stabilisiert sich das Implantat selbstständig ausschließlich über die Oberflächengeometrie. Ambitioniertes Ziel ist dabei die möglichst vollständige Wiederherstellung eines hohen Bewegungsbereiches, der die mechanisch stabile Hocke, das Aufstehen ohne Gehhilfen, Radfahren usw. einschließt. Dies geht weit über das konventionelle Ziel einer „nahezu normalen" Gelenkfunktion mit Gewährleistung eines schmerzfreien Ganges hinaus. Die ÆQUOS™-Knieendoprothese hat das CE-Zertifikat nach ISO 13485 und 93/42 EWG erhalten und ist somit als Medizinprodukt zugelassen. Die ÆQUOS™-Knieendoprothese wurde seit September 2003 bereits 160-mal erfolgreich implantiert. Diese Implantationen zeigten auch in vivo die erwartet guten Ergebnisse.
In der vorliegenden Studie wurden die in einzelnen Kasuistiken berichteten schwerwiegenden Komplikationen, wie die Perforation des Spinalkanals und dadurch hervorgerufenen Verletzungen der intraspinalen Strukturen (Heyll und Ziegenhagen 2000; Schmittinger et al. 2011) im Rahmen der neuraltherapeutischen Injektion der Tonsilla pharyngea aus morphologischer Sicht einer näheren Betrachtung unterzogen. Zu diesem Zweck wurde der mögliche Stichkanal einer Kanüle virtuell anhand computertomographischer Datensätze von insgesamt 53 adulten Schädeln von sieben unterschiedlichen Populationen verschiedener historischer und geographischer Herkunft rekonstruiert. Dabei wurde der Einfluss einer 8 cm langen und nach 4 cm um 140° nach kranial gebogenen Kanüle entsprechend den Vorgaben von Barop (2015) mit einer 8 cm langen, geraden Kanüle in Anlehnung an Dosch (1995) verglichen. Der knöcherne Treffpunkt der Kanülenspitzen im Epipharynx wurde anschließend mittels linearer Streckenmaße metrisch erfasst. Um den Einfluss der Schädelmorphologie auf die Messergebnisse beurteilen zu können, wurden zusätzlich Zusammenhänge zwischen definierten Parametern am Epipharynx und ausgewählten Schädelparametern statistisch geprüft.
Alle Untersuchungen erfolgten an CT-Datensätzen mittels des Programmes Horos v3.3.5 (© 2019 Horos Project). Dazu wurden Längenmessungen und Winkelberechnungen am Schädel vorgenommen sowie Abstände zu definierten Landmarken an Schädelbasis und Epipharynx vermessen. Die Beziehungen zwischen den erhobenen Parametern wurden bei Vorliegen einer Normalverteilung mit Hilfe parametrischer Tests (u. a. einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA)) untersucht.
Die Untersuchungsergebnisse zeigten für alle Schädel und unabhängig der Verwendung einer geraden oder abgewinkelten Kanüle stets einen knöchernen Treffpunkt im Epipharynx. Die Treffpunkte der gebogenen Kanüle lagen stets weiter anterior als jene der gerade Kanüle. Demzufolge ist hinsichtlich des Risikos, den Spinalkanal zu verletzen, die gebogene Kanüle zu favorisieren.
Mögliche statistische Beziehungen zwischen den Schädelparametern mit den Abständen des knöchernen Treffpunktes der Kanülen zum Basion wurden mittels einer Korrelationsanalyse nach Pearson, einer einfachen linearen Regressionsanalyse sowie mit einer multifaktoriellen ANOVA geprüft. Die Ergebnisse dieser Studie verdeutlichen signifikante Korrelationen zwischen Epipharynx- und Gesichtslänge. Zudem ließ sich ein tendenzieller Zusammenhang zwischen der mittleren Gesichtshöhe bzw. der Epipharynxhöhe zum Abstand des knöchernen Kanülentreffpunktes und dem höchsten Punkt im Epipharynx nachweisen. Im Ergebnis der statistischen Untersuchungen zeigte sich jedoch auch, dass mögliche Populationsunterschiede keinen Einfluss auf den knöchernen Kanülentreffpunkt im Epipharynx haben.
Mit der vorliegenden Arbeit wurde eine standardisierte Methode vorgestellt, die es ermöglicht, den knöchernen Treffpunkt einer Kanüle an der Schädelbasis zu analysieren und quantitativ zu bestimmen. Damit ergeben sich neue Möglichkeiten zur Untersuchung der neuraltherapeutischen Injektion an das Rachendach auch unter Berücksichtigung phylogenetischer und populationsbiologischer Aspekte. Derartige Daten sind für die Reduktion schwerwiegender Komplikationen von unmittelbarer klinischer Bedeutung.
Das vorrangige Ziel der in-vitro-Untersuchung bestand in der hochgenauen Erfassung der Wirbelbewegung unter physiologischen Standardbelastungen. Methode: Ein cervikales Bewegungssegment C5/6 wurde in einer 6-D-Messapparatur untersucht. Unter dem Einfluss zyklisch variierter freier Drehmomente (axiale Rotation, Lateralflexion und Flexion/Extension)wurde die Reaktion des Segments erfasst, während variable Vorlasten (0-6 kg) verschiedenste physiologische Bedingungen simulierten. Das Auflösungsvermögen betrug bei der Translation bis zu 3.1 µm und 4,5 mGrad bei Drehbewegungen. Spezielle Software ermöglichte eine biomechnaische Analyse: : alpha(T)-Kurven zeigten die Verteilung des Momentanwinkels, Spurpunkte und 3-D-Ansichten visualisierten die räumliche Verteilung differenzieller Schraubachsen (IHA) in Bezug zu den anatomischen Komponenten. Resultate: Das Bewegungsverhalten wurde sehr stark sowohl von der Ausrichtung des Drehmoments als auch von der einwirkenden Vorlast bestimmt. Selbst kleine Variationen veränderten die räumliche Verteilung der IHAs, die hiermit charakteristische Veränderungen der Segmentbewegung aufzeigten. Der Bewegungsumfang sank mit steigender Last und dezentrale Vorlasten führten zu einer Langzeit-Flexion des Segments. Eine Computersimulation der Segmentrotation gab Aufschluss über die wechselnde Führung von Facetten- und Uncovertebralgelenken. Zusammenfassung: Nicht nur die Art des Drehmoments, sondern auch die Größe und die Position der Kraftwirkungslinie der Vorlasten bestimmen das Bewegungsverhalten und die Wechselwirkung der Gelenke.
Podozyten, die hochspezialisierten viszeralen Epithelzellen des Glomerulus, bedecken die Außenseite der glomerulären Kapillaren und sind für die Filtration des Blutes in der Niere essentiell. Eine Schädigung der Podozyten geht mit dem Verlust ihrer komplexen dreidimensionalen Struktur, dem sogenannten Fußfortsatz-Effacement einher. Effacement und Detachment, das Ablösen der Podozyten von der glomerulären Basalmembran, führen zur Ausscheidung von hochmolekularen Proteinen mit dem Urin und in vielen Fällen zu einer nicht heilbaren chronischen Nierenerkrankung (CKD). In der Vergangenheit wurde anhand von Zellkulturstudien und Versuchen an Ratten und Mäusen die These aufgestellt, dass Podozyten entlang der glomerulären Basalmembran wandern können. Da diese Experimente jedoch bisher nicht eindeutig belegen konnten, dass es sich bei den beobachteten Zellen tatsächlich um vollständig differenzierte Podozyten handelte und diese Fragestellung für das Verständnis der Pathogenese chronischer Nierenerkrankungen und damit für die Entwicklung neuer Therapieverfahren von wesentlicher Bedeutung ist, wurde im Rahmen dieser Arbeit ein Verfahren entwickelt, Fluoreszenz-markierte Podozyten in vivo in lebenden Zebrafischlarven zu beobachten. Dazu wurde zunächst durch Kreuzung ein transgener Zebrafischstamm generiert, dessen Larven vollständig transparent sind und das grün-fluoreszierende Protein unter Kontrolle des wt1a-Promoters in Podozyten exprimieren. Mit der 2-Photonenmikroskopie konnten nun in Langzeitaufnahmen einzelne Podozyten in fünf bis sechs Tage alten Zebrafischlarven beobachtet werden. Hierbei zeigte sich eindeutig, dass Podozyten über Zeiträume von bis zu 23 Stunden nicht wandern. Da mit dieser Technik auch einzelne Primärfortsätze der Podozyten beobachtet werden können, konnte erstmals gezeigt werden, dass sich auch diese nicht signifikant innerhalb eines Beobachtungszeitraums von bis zu 23 Stunden bewegten. Als Nachweis, dass mit dieser Beobachtungsmethode dynamische Podozyten nachgewiesen werden können, wurde die Bewegung einzelner Zellen während der Bildung des Glomerulus über einen Zeitraum von 3 Tagen verfolgt. Um ferner auszuschließen, dass Podozytenfortsätze sehr schnelle, oszillierende Bewegungen vollführen, wurden einzelne Podozyten in sehr kurzen Intervallen aufgenommen und das Bewegungsmuster analysiert. Auch hier zeigten sich keine dynamischen Eigenschaften der Podozyten im lebenden Organismus. Somit kann davon ausgegangen werden, dass Podozyten unter physiologischen Bedingungen in lebenden Zebrafischlarven kein dynamisches Verhalten zeigen, sondern als statische Zellen anzusehen sind.
Etwa jeder zehnte Deutsche leidet an einer chronischen Nierenerkrankung (CKD), deren Entstehung zu etwa zwei Drittel auf eine Schädigung der Podozyten zurückgeführt werden kann. Die Funktion der Podozyten für die Aufrechterhaltung der selektiven glomerulären Filtration ist eng an ihre einzigartigen Morphologie interdigitierender Fußfortsätze gebunden. Deren Zwischenräume werden von einer Schlitzmembran überbrückt, die aus spezifischen Proteinen wie Nephrin besteht. Im Falle einer CKD kommt es jedoch zu einer Dedifferenzierung der Podozyten, welche einen Verlust ihrer komplexen dreidimensionalen Struktur und damit eine Proteinurie nach sich zieht. Da dieser Prozess durch die derzeit zur Verfügung stehenden Pharmaka wie Glukokortikoide oder Calcineurin Inhibitoren nur unzureichend therapiert werden kann, ist eine Dialysepflichtigkeit und/oder Nierentransplantation für die meisten Patienten unausweichlich.
Deswegen wurde im Rahmen dieser Arbeit der GlomAssay entwickelt und für das Screening podozytenspezifischer Wirkstoffe genutzt. Dazu wurden die Glomeruli eines transgenen Nephrin::CFP Mausstammes isoliert, welcher unter der Kontrolle des Nephrin Promoters den Fluoreszenzreporter CFP exprimiert. Anschließend wurden die Glomeruli kultiviert und der durch die zeitabhängige Dedifferenzierung der Podozyten bedingte Nephrin Abfall anhand der CFP Fluoreszenzintensität in situ quantifiziert.
Beim Vergleich verschiedener Isolationsmethoden erwies sich die Glomeruli Isolation mit magnetischen Dynabeads als geeignetstes Verfahren. Die Unversehrtheit der Podozyten wurde mittels Laser Scanning , Raster und Transmissionselektronenmikroskopie sowie durch Immunfluoreszenzfärbungen der Podozytenmarker Nephrin, Podocin und WT-1 verifiziert. Die spontane Dedifferenzierung der Podozyten in Zellkultur führte zu einem graduellen Abfall der CFP Fluoreszenz über 9 Tage. Dass die sinkende CFP Fluoreszenzintensität dabei unmittelbare Rückschlüsse auf eine verringerte Nephrin Expression zulässt, wurde mittels RT PCR, Western Blot , Transkriptom und Proteomanalyse belegt. Ein Effacement der Podozyten-Fußfortsätze und ein Verlust der Schlitzmembranen wurde anhand transmissions- und rasterelektronenmikroskopischer Aufnahmen nachgewiesen.
Um die Mechanismen der Podozytendedifferenzierung genauer zu verstehen, wurde das glomeruläre Transkriptom und Proteom nach 3 , 6 und 9 tägiger Kultivierung analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass außer den Schlitzmembranproteinen auch bspw. die Komponenten des Zytoskeletts, der Zell Matrix Kontakte oder der glomerulären Basalmembran von Bedeutung sind für die Podozytendedifferenzierung.
Die Validierung des GlomAssays erfolgte mit Hilfe verschiedener podozytenprotektiver und schädigender Substanzen. Die Podozyten Noxen Daunorubicin und Vinblastin bedingten dabei erwartungsgemäß einen Abfall der CFP Fluoreszenzintensität mit einer IC50 Konzentration von 1,55 µM bzw. 87,82 nM. Von den untersuchten podozytenprotektiven Pharmaka Dexamethason, all trans Retinsäure, Pioglitazon und 1α,25 Dihydroxyvitamin D3 führte nur die Behandlung mit Letzterem zu einer Reduktion der Podozytendedifferenzierung. Die damit einhergehende, erhöhte Nephrin und CFP Expression wurde mittels RT PCR und Western Blot Analyse nachgewiesen.
Anschließend wurde der GlomAssay für das Screening neuer Substanzen verwendet. Dabei wurde zum einen das Glykoprotein Hämopexin untersucht, welches mit der Entstehung der Minimal Change-Glomerulonephritis in Zusammenhang gebracht wird. Es zeigte jedoch keinen Effekt auf die Podozytendedifferenzierung. Zum anderen wurde der Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF) getestet, welcher als prognostischer Marker im Urin von CKD Patienten dient und für die Entwicklung und Integrität der glomerulären Filtrationsbarriere essentiell ist. Jedoch beeinflusste weder die Inkubation der Glomeruli mit BDNF noch mit dem BDNF bindenden TrkB-Fc Fusionsproteins die Differenzierung der Podozyten. Die Blockade des Tropomyosin Rezeptor Kinase B (TrkB) Rezeptors, welcher durch Interaktion mit BDNF aktiviert wird, durch den nichtkompetitiven Inhibitor ANA 12 bewirkte hingegen einen vorzeitigen Abfall der CFP Fluoreszenz mit einer IC50 Konzentration von 19,74 µM. Mit dem allosterischen TrkB Inhibitor Cyclotraxin B ließen sich diese Ergebnisse allerdings nicht bestätigen. Nichtsdestotrotz belegen die mit ANA 12 erzielten Resultate die Relevanz des BDNF für Podozytendifferenzierung.
Insgesamt gelang es mit dem GlomAssay ein neue in vitro Methode zu etablieren, um den Effekt pharmakologischer Substanzen auf die Podozytendifferenzierung schnell, nicht destruktiv und wiederholbar zu untersuchen. Dadurch bietet sich die Möglichkeit, das Screening podozytenprotektiver Wirkstoffe bereits in der präklinischen Phase stärker zu forcieren und so zukünftig die Entwicklung neuer Therapieoptionen zur Behandlung von CKDs voranzutreiben.
Granulosazellen sind involviert in die Steuerung einer Vielzahl von hormonabhängigen Prozessen wie Follikulogenese, Ovulation und Luteinisierung. Die adäquate Funktion der Granulosazellen hängt u.a. ab von der extrazellulären Matrix, Adhäsionsmolekülen und dem Vorkommen von Matrix-Metalloproteinasen. Komponenten der extrazellulären Matrix wie z.B. Laminin und Fibronektin spielen eine wichtige Rolle bei der Follikulogenese und interagieren mit Wachstumsfaktoren, Zytokinen und Integrinen. Integrine sind transmembrane, heterodimere Rezeptoren, die die Übertragung von Informationen der extrazellulären Matrix in die Zelle vermitteln. Sie bestehen aus einer kleinen beta- und einer größeren alpha-Untereinheit, die nicht-kovalent miteinander verknüpft sind. Auch sie spielen eine wichtige Rolle bei der Follikulogenese. Matrix-Metalloproteinasen sind zink- und calciumabhängige Proteine, die eine Bedeutung haben für Zellproliferation, Migration, den programmierten Zelltod (Apoptose), Angiogenese und Tumorprogression. Sie sind involviert in Follikulogenese, Ovulation und Regression des Corpus luteum. Eine Möglichkeit zur weiteren Erforschung dieser Faktoren besteht in der Etablierung permanenter Zelllinien. Vor diesem Hintergrund wurden in der vorliegenden Arbeit immortalisierte Granulosazellen kultiviert und immunhistochemisch auf das Vorkommen von Matrixkomponenten (Laminin, Fibronektin, Tenascin, Kollagen I und IV), Integrinuntereinheiten (alpha 1, 2, 3, 4, 5, 6, beta 1, 4) und Matrix-Metalloproteinasen (1 – 3, 7 - 15) untersucht. Darüber hinaus wurde die Lokalisation der verschiedenen Faktoren an Kulturen niedriger und hoher Passagen ohne sowie nach Stimulation mit 8-bromo-cAMP durchgeführt. Die verwendeten Zellen wurden bereits in einer früheren Arbeit generiert und stammen aus Ovarien von Weissbüschelaffen, deren ovarieller Zyklus viele Gemeinsamkeiten mit dem des Menschen aufweist. Das Wachstumsmuster der Zellen veränderte sich auch nach höherer Passagenanzahl nicht. Immunhistochemisch wurden die Integrinuntereinheiten alpha 1, 3, 4, 5, beta 1, 4, die Matrixkomponenten Kollagen I, Fibronektin und Laminin sowie die Metalloproteinasen 13, 14 und 15 nachgewiesen. Diese Befunde waren in niedrigen und höheren Passagen identisch. Nach Stimulation der Granulosazellen mit 8-bromo-cAMP wurde für die Metalloproteinasen 13 und 15 eine veränderte Immunreaktion im Vergleich zu nicht stimulierten Zellen festgestellt. Bisher liegen Untersuchungen zur Expression von Integrinen, Matrixkomponenten und Metalloproteinasen in Granulosazellen des Weissbüschelaffen in der Literatur nicht vor. Verglichen mit früheren Untersuchungen am Ovar des Weissbüschelaffen fand sich eine Übereinstimmung bezüglich des Vorkommens der Integrinuntereinheit alpha 1 und alpha 3. Im Gegensatz zu den in-vivo-Befunden wurden die Integrinuntereinheiten alpha 1, 4 und auch 5 gefunden, während die Integrinuntereinheiten alpha 2 und 6 nicht in immortalisierten Granulosazellen, aber in vivo vorkamen. Die Unterschiede bezüglich des Nachweises einiger Integrinuntereinheiten könnte auf eine Veränderung der Zellen durch die Immortalisierung oder die Kulturbedingungen zurückzuführen sein. Die Befunde, dass Matrixkomponenten wie Kollagen I, Laminin und Fibronektin in den immortalisierten Granulosazellen vorkamen, stehen in Einklang mit Untersuchungen an Granulosazellen anderer Spezies (Rind, Maus). Ebenso wurden bereits in kultivierten Zellen Metalloproteinasen aus der Gruppe der Gelatinasen (Metalloproteinasen 2 und 9) nachgewiesen. Die Tatsache, dass nach Stimulierung mit 8-bromo-cAMP ein verändertes Reaktionsmuster für die Metalloproteinase 13 und eine deutlich stärkere Immunreaktion bei der Metalloproteinase 15 vorlag, könnte auf eine wichtige Rolle in der Funktion der Granulosazellen hindeuten. Die vorliegende Arbeit zeigt erstmals, dass immortalisierte Granulosazellen des Weissbüschelaffen Matrixkomponenten, Matrixrezeptoren sowie Metalloproteinasen auch noch nach höheren Passagen bilden. Diese Zellen scheinen in der Expression dieser Faktoren stabil zu sein und sich für weitere Methoden wie PCR, Western-Blot und Transfektionsexperimente zu eignen und somit ein Modell zur Untersuchung der Funktionsweise von Granulosazellen darzustellen.
Das Prostatakarzinom (PCA) ist die häufigste Krebserkrankung des Mannes, deren Inzidenz mit dem Alter stark ansteigt. Für die Karzinomentwicklung werden z.B. der epidermale Wachstumsfaktor (EGF), der entsprechende Rezeptor (epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor, (EGF-R), Komponenten der extrazellulären Matrix wie Tenascin (TN-C) und auch Annexine (ANX) verantwortlich gemacht. Ziel dieser Arbeit war es, mittels immunhistochemischer Methoden an Prostatagroßschnitten die Lokalisation von TN-C, EGF-R, EGF und ANX II in gesundem Gewebe (BPE), in gesundem hyperplastischen Gewebe (BPH) und im Prostatakarzinom (PCA) zu untersuchen und einen möglichen Zusammenhang zwischen der Expression dieser vier Proteine zu finden. Es wurden hierfür Prostatagroßschnitte von 32 radikal prostatektomierten Patienten untersucht, die Anteile aller drei Gewebearten (BPE; BPH und PCA) enthielten. Bei der Auswertung wurde zwischen stromaler und zellulärer Immunreaktion der jeweiligen Antikörper unterschieden und ein Score entwickelt, der Färbeintensitäten von 0 (negativ) bis 3 (starke Immunreaktion), sowie den prozentualen Anteil der angefärbten Zellen (a= 0-30%, b= 30-60%, c= >60%) berücksichtigt. Für TN-C, das im adulten Gewebe kaum noch exprimiert wird, zeigte sich eine starke stromale Immunreaktion im PCA, nicht jedoch in der BPE. Dort war TN-C lediglich in den Wänden einiger Gefäße vorhanden. Für den EGF-R wurde im BPE eine starke Immunreaktion beobachtet. Im PCA dagegen war die Expression des EGF-R deutlich schwächer. EGF wurde in den untersuchten Prostatagroßschnitten weder im BPE noch im PCA nachgewiesen. Die ANX II-Expression war in den Epithelzellen des BPE sehr stark. Dagegen wurden eine signifikante Reduktion oder ein Verlust der Immunreaktion im PCA festgestellt. Im Vergleich von PBE und BPH waren die Lokalisationsmuster für alle vier Proteine fast identisch. Aufgrund der Ko-Lokalisationsexperimente, die zeigten, dass EGF-R und ANX II im BPE stark aber im PCA nur schwach oder gar nicht exprimiert werden, ist eine gegenseitige Beeinflussung wahrscheinlich. Ebenso deutet die Reduktion von EGF-R und ANX II im PCA auf eine Beteiligung an der Tumorgenese hin. Dies scheint eine Besonderheit des PCA zu sein, da für die meisten Tumore eine Hochregulation von ANX II sowie von EGF-R beschrieben wird. TN-C zeigte im Vergleich zum BPE eine stärkere Immunreaktion im PCA, wodurch ebenfalls auf eine Mitwirkung bei der Tumorentstehung geschlossen werden kann. Da allerdings ANX II und EGF-R nicht oder nur sehr schwach im PCA exprimiert werden, scheint eine Interaktion zwischen TN-C und ANX II oder EGF-R, wie sie z.B. beim kolorektalen Karzinom beschrieben wurde, im PCA keine Rolle zu spielen.
Obwohl es allgemein bekannt ist, dass viele Tumore oft durch profunde Änderungen der extrazellulären Matrix charakterisiert sind, liegen über die Expression von Matrixkomponenten in Hodentumoren nur sehr wenige Erkenntnisse vor. In der vorliegenden Arbeit wurden Seminome (die häufigsten Keimzelltumore) und embryonale Karzinome (Keimzelltumore mit ungünstiger Prognose) im Vergleich zum nicht-neoplastischen Hoden auf die Expression der Matrixkomponenten LN und TN immunhistochemisch untersucht. Im besonderen Fokus der Untersuchungen stand dabei die TIN, die als Vorstufe der meisten Keimzelltumoren gilt. LN wurde sowohl im EC als auch im Seminom nachgewiesen, wobei die Färbung in Foci vergleichsweise stark war. Zeitweilig war auch eine starke zytoplasmatische Anfärbung deutlich. TN war ebenfalls in EC und Seminomen vorhanden. Bemerkenswert war, dass weder LN noch TN in TIN exprimiert wurden. Die Ergebnisse lassen folgern, dass die TIN als das frühe Stadium des Keimzelltumors nicht durch eine (zumindest immunhistochemisch nachweisbare) Veränderung der Matrixexpression charakterisiert ist. Demnach sind LN und TN als Marker für die TIN bzw. der frühen malignen Transformation ungeeignet. Andererseits deutet die starke Immunreaktivität für LN und TN in Seminomen und embryonalen Karzinomen auf eine wichtige Rolle dieser Matrixkomponenten hin. Die in dieser Arbeit erhobenen Befunde zeigen erstmalig, dass TN in Hodentumoren exprimiert wird und somit, dass sich auch in Keimzelltumoren die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix im Vergleich zum nicht-neoplastischen Gewebe verändert. Es ist zu vermuten, dass TN in Hodentumoren ähnliche Eigenschaften besitzt wie in anderen Tumorarten. In weiteren Studien sollte die Expression von Fibronectin, Kollagenen und verschiedenen LN-Isoformen untersucht werden, um somit weitere Hinweise auf die Rolle von ECM-Komponenten in TIN oder Hodentumoren zu erhalten.
Niemann–Pick type C1 (NPC1) is a lysosomal storage disorder, inherited as an
autosomal-recessive trait. Mutations in the Npc1 gene result in malfunction of the NPC1 protein,
leading to an accumulation of unesterified cholesterol and glycosphingolipids. Beside visceral
symptoms like hepatosplenomegaly, severe neurological symptoms such as ataxia occur. Here,
we analyzed the sphingosine-1-phosphate (S1P)/S1P receptor (S1PR) axis in different brain regions
of Npc1−/− mice and evaluated specific effects of treatment with 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin
(HPβCD) together with the iminosugar miglustat. Using high-performance thin-layer chromatography
(HPTLC), mass spectrometry, quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and western blot analyses, we
Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 4502; doi:10.3390/ijms21124502 www.mdpi.com/journal/ijms
Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 4502 2 of 31
studied lipid metabolism in an NPC1 mouse model and human skin fibroblasts. Lipid analyses
showed disrupted S1P metabolism in Npc1−/− mice in all brain regions, together with distinct changes
in S1pr3/S1PR3 and S1pr5/S1PR5 expression. Brains of Npc1−/− mice showed only weak treatment
effects. However, side effects of the treatment were observed in Npc1+/+ mice. The S1P/S1PR axis
seems to be involved in NPC1 pathology, showing only weak treatment effects in mouse brain. S1pr
expression appears to be affected in human fibroblasts, induced pluripotent stem cells (iPSCs)-derived
neural progenitor and neuronal differentiated cells. Nevertheless, treatment-induced side effects
make examination of further treatment strategies indispensable
Morphological changes of the complex 3-D architecture of podocytes as well as the loss of these post-mitotic cells often result in severe kidney disease. Since currently, there are no curative drugs, we focused on the identification of non-invasive biomarkers, allowing an early detection of the onset of such diseases. Therefore, we analyzed the cellular- and the cell-free fractions of urine samples from patients suffering from chronic kidney disease (CKD), especially for injury markers as well as for exosome-derived miRNAs.
We identified the mRNA of the neuronal protein brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in the cellular fraction of 120 CKD patients and found that the expression was highly correlated with the mRNA expression of the kidney injury marker molecule 1 (KIM-1). Furthermore, we found that both were correlated with the mRNA expression of the podocyte-specific gene Nephrin (NPHS1), suggesting that podocytes are very likely the cellular source.
Beside this, we observed that BDNF is upregulated in biopsies of diabetic patients and seems to be involved in the differentiation of podocytes. Immunofluorescence staining clearly showed that BDNF is localized in the cell body and major processes of podocytes within the glomerulus. Knockdown experiments in zebrafish larvae, a well-established animal model to study kidney function, showed the importance of BDNF on kidney function, morphology and filtration in vivo.
Additionally, we analyzed circulating exosomal microRNAs (miRs) isolated from the cell-free urine fraction. After the optimization of a column-based isolation protocol for exosomes, we identified miR-16 from a pre-selected set of candidates as a suitable endogenous reference gene for data normalization. Subsequently, we analyzed the exosomal levels of miR-21, miR-30a-5p and miR-92a in urine samples of 41 CKD patients and 5 healthy controls. We found significantly enhanced levels of miR-21 in CKD patients that were also negatively correlated with the eGFR, suggesting a negative influence on kidney function. MiR-21 was also highly upregulated in de-differentiated glomeruli and in kidneys of nephrotoxic serum- (NTS-) treated mice as an in vivo kidney injury model.
To summarize, we identified two promising new and non-invasive biomarkers for CKD in the urine of patients which may also have a functional relevance on kidney function.
Chronic kidney disease is a major public health burden associated with a drastically reduced quality of living and life span that lacks suitable, individualized therapeutic strategies. Here we present a human induced pluripotent stem cell line (iPSC, UMGACBi001-A) reprogrammed from urine cells of an acute septic dialysis patient suffering from chronic kidney disease using non-integrating administration of RNAs. The generated iPSCs were positively characterized for typical morphology, pluripotency marker expression, directed differentiation potential, non-contamination, chromosomal consistency and donor identity. This iPSC-line can be a useful source for in vitro disease modelling and individualized therapeutic approaches.
Die Nasennebenhöhlen von sechzehn adulten Tieren der Neuweltaffenspezies Alouatta caraya beiderlei Geschlechts wurden mittels Computertomographie untersucht. Anhand der coronalen CT-Aufnahmen erfolgte die Volumenbestimmung durch die SURFdriver® - Software. Zur Einordnung der Volumina der Nasennebenhöhlen wurden Längen-, Breiten-, und Höhenmaße der Schädel ermittelt und das Gesichtsschädelvolumen berechnet. Bei Alouatta caraya ist der Sinus maxillaris die einzige vorhandene Nasennebenhöhle, die ausgeprägte Recessus aufweist. Besonders auffällig ist die vertikale Septierung im dorsalen Bereich der Kieferhöhlen. Der Sinus maxillaris von Alouatta caraya ist bei den männlichen Tieren doppelt so groß ausgeprägt wie bei den weiblichen Tieren. Zur Darstellung von Merkmalszusammenhängen zwischen Kieferhöhlenvolumen und Gesichtsschädelmorphologie erfolgte eine Korrelationsanalyse. Durch eine einfache lineare Regressionsanalyse wurden diese Beziehungen dargestellt und die Einordnung von Alouatta caraya innerhalb der Neuweltaffen überprüft. Die Bewertung des Geschlechtsdimorphismus und der Asymmetrie der Kieferhöhlen erfolgte anhand von Indizes. Es konnte ein signifikanter Zusammenhang zwischen dem Kieferhöhlenvolumen und den Schädelmaßen – einschließlich des Gesichtsschädelvolumens und mit Ausnahme der Schädellänge – nachgewiesen werden. Bei der Betrachtung der Regressionsgeraden ist bei den weiblichen Tieren eine Werteverteilung im unteren, bei den männlichen Tieren eine Verteilung der Werte im oberen Volumen- und Längenbereich zu erkennen. Dabei weisen die Werte der männlichen Tiere eine wesentlich größere Streuung auf. Im Vergleich zu anderen nicht-menschlichen Primaten und dem Menschen weist Alouatta caraya den größten Geschlechtsdimorphismus für die Kieferhöhlen auf. In der Ausprägung des Geschlechtsdimorphismus zwischen Kieferhöhlenvolumen und den erhobenen Schädelmaßen besteht bei Alouatta caraya kein wesentlicher Unterschied Bei der Betrachtung des Asymmetrieindex zeigt sich für beide Geschlechter eine symmetrische Verteilung der Kieferhöhlenvolumina zwischen rechter und linker Schädelseite. Die beobachteten Asymmetrien treten zufällig auf und werden als fluktuierende Asymmetrien aufgefaßt. Innerhalb der Atelinae deutet die Regressionsanalyse auf einen signifikanten Zusammenhang zwischen Kieferhöhlenvolumen und Gesichtslänge hin. Die Werte von Alouatta caraya im oberen Volumen- und Längenbereich bestätigen ihre Stellung als größte Spezies innerhalb der Atelinae. Bedingt durch die geringe Klinorhynchie des Gesichtsschädels erweist sich das Gesichtsschädelvolumen zur Einordnung von Alouatta caraya innerhalb der Atelinae als wenig aussagekräftige Bezugsgröße. Abschließend bleibt zu erwähnen, daß den Nasennebenhöhlen aus unserer Sicht eine biomechanische Rolle zuzuschreiben ist.
The global prevalence of kidney diseases has been steadily rising over the last decades. Today, around 10% of the world population suffers from relevant chronic kidney disease. Podocytes are highly specialized and terminally differentiated cells residing in the filtering units of the kidneys, the so-called glomeruli. With their interdigitating foot-processes, these cells are a crucial part of the renal filtration barrier. As podocytes are post-mitotic, injury or loss of these cells results in an impairment of the filtration barrier with subsequent loss of global kidney function. Therefore, the question whether a relevant amount of podocytes can be regenerated and if this regeneration can be influenced is crucial for future therapeutic developments. As in vivo microscopic imaging of podocytes in higher animals like mice or rats is rather challenging, larval zebrafish have been applied as an animal model for podocyte development and kidney filtration. 48 hours post fertilization, zebrafish larvae develop a single filtering glomerulus with a similar morphology and molecular construction to that in mammals. For evaluation of podocyte morphology and filtration, we used transgenic zebrafish strains in which podocytes were labeled with fluorescence proteins. Additionally, podocytes expressed the bacterial enzyme nitroreductase fused to the fluorescence protein mCherry. In this model, application of the antibiotic metronidazole leads to podocyte-specific cell death. Through cross-breeding we established strains that additionally express an eGFP-labeled protein in the blood plasma. Using in vivo two-photon microscopy, we could image podocyte-loss induced impairments of the glomerular filtration barrier. Additionally, we tracked characteristic morphological changes of podocyte morphology including podocyte foot process effacement, development of sub-podocyte pseudocysts and finally detachment of whole cells from the glomerular basement membrane. These changes have been before described histologically in different animal models as well as in patient biopsies. Using the in vivo microscopy approach, we could clearly describe the temporal sequence of these alterations. Finally, we also tracked individual, non-detached podocytes over up to 24 hours, and found that these cells were non-migratory. These results show that early podocyte-regeneration through immigration of intra- or extraglomerular cells is unlikely within the first 24 hours of acute glomerular injury.
Podocytes are highly specialized kidney cells that are attached to the outer aspect of the glomerular capillaries and are damaged in more than 75% of patients with an impaired renal function. This specific cell type is characterized by a complex 3D morphology which is essential for proper filtration of the blood. Any changes of this unique morphology are directly associated with a deterioration of the size-selectivity of the filtration barrier. Since podocytes are postmitotic, there is no regenerative potential and the loss of these cells is permanent. Therefore, identification of small molecules that are able to protect podocytes is highly important. The aim of this work was to establish an in vivo high-content drug screening in zebrafish larvae. At first, we looked for a reliable podocyte injury model which is fast, reproducible and easy to induce. Since adriamycin is commonly used in rodents to damage podocytes, we administered it to the larvae and analyzed the phenotype by in vivo microscopy, (immuno-) histology and RT-(q)PCR. However, adriamycin did not result in a podocyte-specific injury in zebrafish larvae. Subsequently, we decided to use a genetic ablation model which specifically damages podocytes in zebrafish larvae. Treatment of transgenic zebrafish larvae with 80 µM metronidazole for 48 hours generated an injury resembling focal and segmental glomerulosclerosis which is characterized by podocyte foot process effacement, cell depletion and proteinuria. Following this, we established an in vivo high-content screening system by the use of a specific screening zebrafish strain. This screening strain expresses a circulating 78 kDa eGFP-labeled Vitamin D-binding fusion protein, which passes the filtration barrier only after glomerular injury. Therefore, we had an excellent readout to follow podocyte injury in vivo. We generated a custom image analysis software that measures the fluorescence intensity of podocytes and the vasculature automatically on a large scale. Furthermore, we screened a specific drug library consisting of 138 compounds for protective effects on larval podocytes using this in vivo high-content system. The analysis identified several initial hits and the subsequent validation experiments identified belinostat as a reliable and significant protective agent for podocytes. These results led to a patent request and belinostat is a promising candidate for a clinical use and will be tested in mammalian podocyte injury models.
Bei der Untersuchung verschiedener chronischer Nierenerkrankungen in den letzten Jahrzehnten zeigte sich, dass Podozyten als Bestandteil der glomerulären Filtrationsbarriere häufig in die Pathomechanismen involviert sind, wobei ein Verlust ihrer besonderen Architektur aus interdigitierenden Fußfortsätzen (effacement) und auch die Ablösung einzelner Podozyten von der glomerulären Basalmembran beobachtet werden können. Da es sich um postmitotische Zellen handelt, kann ein Verlust nur durch eine Hypertrophie verbleibender Zellen ausgeglichen werden. Nach wie vor ist nicht eindeutig geklärt, ob ein Ersatz stattfindet und wenn ja, welche Zellen dafür verantwortlich sind. Seit einigen Jahren sind die PECs in den Fokus der Aufmerksamkeit gerückt und es konnte gezeigt werden, dass sie sich unter bestimmten Bedingungen zu Podozyten-ähnlichen Zellen differenzieren, aber auch einen negativen Einfluss im vorgeschädigten Glomerulum durch ein profibrotisches Potential ausüben können.
In dieser Arbeit wurden drei Transkriptionsfaktoren (Dach1, MafB und Foxc2) in PECs transfiziert. Für alle drei konnte in der Vergangenheit eine Bedeutung in der Nieren-bzw. Podozytenentwicklung gezeigt werden. Es sollte untersucht werden, ob einer der drei Transkriptionsfaktoren eine Differenzierung der PECs zu Podozyten in vitro induzieren könnte. Auch der Einfluss der jeweiligen Faktoren untereinander wurde untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Transfektion mit pMafB-tGFP einen signifikanten Dach1-Anstieg in PECs bedingte. Hinsichtlich der Expression von F Aktin, α-Tubulin und dem Podozyten-spezifischen Transkriptionsfaktor WT-1 in PECs zeigte sich bildmorphologisch kein Hinweis für einen möglichen Einfluss von Dach1, MafB und Foxc2 in PECs. Allerdings konnte durch die Überexpression von Dach1 in PECs ein signifikanter Anstieg des Podozyten-spezifischen Proteins Synaptopodin beobachtet werden. Des Weiteren kam es zu einer Herunterregulation von Pax-2, was insofern bedeutsam ist, als dass auch Podozyten eine verminderte Pax-2-Expression aufweisen. Es zeigte sich außerdem eine verminderte Expression von Caveolin-1 und β-Catenin. Während Ersteres eher als ein Zeichen des profibrotischen und somit negativen Potentials gewertet werden könnte, ähnelt die Herunterregulation von β-Catenin wiederum dem Status von Podozyten.
Zusammenfassend bestätigt die Arbeit das Differenzierungspotential von PECs zu Podozyten und zeigt, dass Dach1 in vitro ein entscheidender Faktor dafür ist.
Im Jahr 2002 wurde bei einer stark mental retardierten Patientin im Rahmen einer Genanalyse ein Strangbruch am kurzen Arm des dritten Chromosoms festgestellt. Das davon betroffene Gen codiert für ein bis dahin unbekanntes Protein, welches als srGAP3 / MEGAP / WRP benannt wurde. Es gehört zur Familie der Rho-GTPasen aktivierenden Proteine. Diese Rho-GTPasen nehmen über verschiedene Signaltransduktionsketten Einfluss auf die Wegfindung, Differenzierung und Verknüpfung von Neuronen während ihrer Entwicklung.
Mit Hilfe eines Knockoutmausmodells konnten in vorangegangenen Forschungsarbeiten starke Veränderungen der Gehirnarchitektur, sowie Schichtverdickungen im Bereich des Hippocampus‘ festgestellt werden. Die Beziehung von srGAP3 zu den Rho-Proteinen und den damit entstehenden Einfluss auf die neuronale Entwicklung ließ den Hippocampus als Region der adulten Neurogenese in den Fokus der Forschungsarbeit rücken.
Die durchgeführten Untersuchungen erfolgten im srGAP3-Knockoutmausmodell mittels Kleintier-MRT, Golgi-Imprägnierung und immunhistochemischen Färbungen (gegen Doublecortin und Phosphohiston 3).
In den Ergebnissen konnte durch den srGAP3-Knockout zwar eine Volumenzunahme des Hippocampus‘, jedoch weder eine signifikante Veränderung der Neuronenanzahl, der Neuronenmorphidität, noch der Spinedichte oder der Spinelänge im Hippocampus festgestellt werden.
Als Erklärung der präsentierten Ergebnisse und möglicher neuer Forschungsansatz wäre die These einer Zunahme an kortikalen Neuronen, welche in den Hippocampus projizieren, denkbar. Dieser Anstieg könnte sowohl eine faserbedingte Volumenzunahme, die gleichzeitig fehlenden neurostrukturellen Veränderungen im Hippocampus, als auch die milden verhaltensbiologischen Auffälligkeiten in den bisher durchgeführten Tests erklären. Die Untersuchung der Tiere in komplexeren Verhaltenstests könnte dahingehend wegweisend sein.
In dieser Arbeit wurde der Einfluss von zwei Angiotensin (1-7) Derivaten TXA301 und TXA302 im Vergleich mit einer Placebo behandelten Kontrollgruppe einer Rattenpopulation mit mittels vorübergehendem Verschluss der Arteria cerebri media (tMCAO) herbeigeführtem Schlaganfall auf die adulte Neurogenese durch Immunfluoreszenzfärbungen untersucht. Beide Derivate, TXA301 und TXA 302, und damit Angiotensin (1-7) haben einen Einfluss auf die adulte Neurogenese, was sich anhand der gegenüber der Kontrollgruppe erhöhten Doublecortin Zahlen beweisen lässt. Diese Neurone scheinen im Fall von TXA301 weniger gut zu überleben wie solche, die mit TXA302 behandelt wurden. Ebenfalls besteht ein messbarer Einfluss auf die Zellteilungsrate 21 Tage nach Applikationsende, da mehr phosphorylierte-Histon-H3 positive Zellen gemessen werden konnten. Die Mikroglia Aktivität wurde durch Angiotensin (1-7) ebenfalls beeinflusst, wie sich in der ionisierten-kalziumbindendes-Adaptermolekül-1 Färbung zeigen ließ. Somit ist die Beeinflussung der adulten Neurogenese nach einem ischämischen Schlaganfall durch die Angiotensin (1-7) Derivate anzunehmen und sollte in größeren Studien weiter untersucht werden.
Staufen2 ist ein mRNA-bindendes Protein (RBP), das in Säugetieren vor allem cerebral exprimiert wird und an der neuronalen Plastizität innerhalb des Hippocampus beteiligt ist. RBPs spielen dabei eine wichtige Rolle in der strengen örtlichen und zeitlichen Regulation der neuroplastischen Vorgänge.
Ziel dieser Arbeit war es, die Auswirkungen eines Knockdowns von Staufen2 auf die Morphologie von Dendriten und dendritischen Dornen im Hippocampus der Ratte erstmalig in-vivo zu untersuchen. Als Grundlage dienten transgene Ratten, in denen durch Tamoxifen-Injektion ein RNA-Interferenz-Mechanismus zum Knockdown von Staufen2 aktiviert werden konnte. Die maximale Wirkung zeigte sich in der CA1-Region des Hippocampus, die in der Folge zum Gegenstand der weiteren Untersuchungen genutzt wurde. Mithilfe der Golgi-Cox-Silberimprägnierung konnte gezeigt werden, dass die Spinelänge und die Spinedichte in der apikalen CA1-Region in den Knockout-Tieren signifikant geringer waren. In den basalen Anteilen sowie bei der Morphologie des Dendritenbaums waren keine signifikanten Unterschiede nachweisbar. Andere Arbeitsgruppen konnten zeigen, dass diese Tiere Defizite im räumlichen Arbeitsgedächtnis sowie im räumlichen und zeitlichen Assoziationsgedächtnis haben. Der Grund hierfür könnte darin liegen, dass das normalerweise ausgewogene Verhältnis zwischen LTP und LTD zugunsten der LTP verschoben erscheint.
Mit seiner Funktion als RBP und einer Assoziation der LTD scheint Staufen2 eine Rolle in der späten, proteinsynthese-abgängigen Phase der LTD zu spielen, wobei die genauen Funktionsweisen des Proteins weiterhin nicht vollständig verstanden sind. Neben Staufen2 gibt es einer Reihe weitere RBPs mit wichtigen Funktionen innerhalb der neuronalen Plastizität. Einige davon sind mit schweren neurologischen Krankheitsbildern wie dem Fragilen-X-Syndrom, AutismusSpektrum-Störungen, amyotropher Lateralsklerose und frontotemporaler Demenz assoziiert. Ein besseres Verständnis der RBPs im Allgemeinen und von Staufen2 im Besonderen kann somit zukünftig zu einem besseren Verständnis von Lernen und Gedächtnis sowie der Pathogenese schwerer neurologischer Erkrankungen beitragen und möglicherweise auch zu neuen Therapiemöglichkeiten führen.