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Das Wissen über fledermausassoziierte Lyssaviren in Hinblick auf die Diversität, Abundanz, geographische Verbreitung, Wirtsspezifität, Pathogenität und mögliche Übertragungswege ist lückenhaft. In Europa wird zur Überwachung der Fledermaustollwut die Untersuchung von moribunden oder toten Tieren (passive Surveillance) und/oder die Beprobung von freilebenden Fledermauspopulationen (aktive Surveillance) empfohlen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den derzeitigen Kenntnisstand zum Vorkommen von fledermausassoziierten Lyssaviren in Deutschland zu erweitern und mit Daten anderer europäischer Länder zu vergleichen. Die Untersuchungen stützten sich dabei auf drei Teilprojekte: 1) Die initiale Statuserhebung und Analyse der Fledermaustollwut-Surveillance in Europa hat gezeigt, dass trotz internationaler Empfehlungen die Tollwut-Überwachung bei Fledermäusen uneinheitlich durchgeführt wird. Diese Unterschiede sind unter anderem die Folge (i) fehlender Zusammenarbeit zwischen Fledermausbiologen und Veterinär- sowie Gesundheitsbehörden, (ii) fehlender Netzwerke von Fledermaussachverständigen, (iii) länderspezifischer Regelungen, aber auch (iv) fehlenden Bewusstseins sowie Kenntnisstandes für die Fledermaustollwut in der Bevölkerung. 2) In Deutschland wurde zusätzlich zur Tollwut-Routinediagnostik eine intensivierte passive Tollwut-Surveillance (retrospektive Studie, 1998 – 2013) durchgeführt, bei der 5478 Tiere aus insgesamt 21 einheimischen Arten akquiriert und auf das Vorliegen einer Lyssavirusinfektion untersucht wurden. Insgesamt konnten 52 EBLV-1 Infektionen (E. serotinus (n=49), P. pipistrellus, P. nathusii, Pl. auritus) sowie drei EBLV-2 Infektionen (M. daubentonii) diagnostiziert werden. Die Untersuchungen verdeutlichen, dass diese retrospektive Studie im Vergleich zur Routinediagnostik entscheidende Vorteile in Bezug auf den Stichprobenumfang, das Artenspektrum sowie die Fehlerfreiheit von artbezogenen biologischen und epidemiologischen Daten und somit entscheidende Voraussetzungen für eine gezielte Risikobewertung einer potentiellen Gesundheitsgefährdung des Menschen durch fledermausassoziierte Lyssaviren bietet. 3) Im Rahmen der aktiven Tollwut-Surveillance (1998 – 2012) erfolgte an 42 Standorten in Deutschland die Beprobung von Fledermauspopulationen. Es wurden 4546 Maultupfer- und 1226 Serumproben von 18 Fledermausspezies untersucht. EBLV-1-spezifische RNA wurde in Maultupfern von fünf Breitflügelfledermäusen, einer Fransen- und einer Mopsfledermaus detektiert. In dieser Arbeit konnte erstmalig EBLV-1 aus einer RT-PCR-positiven Maultupferprobe von einer scheinbar gesunden Breitflügelfledermaus isoliert werden. Bei der serologischen Testung von Serumproben gegen EBLV-1 wurden virus-neutralisierende Antikörper in acht verschiedenen Spezies festgestellt, wobei hauptsächlich Seren von Breitflügelfledermäusen höhere Titer aufwiesen. Ein Vergleich von Ergebnissen verschiedener Sero-Surveillance-Studien ist durch das Fehlen standardisierter Testverfahren und durch kreuzneutralisierende Antikörper gegenüber Lyssaviren gleicher Phylogruppen kaum möglich. Die Daten der aktiven Surveillance liefern im Gegensatz zur passiven Surveillance nur begrenzte Erkenntnisse zum Vorkommen, der Prävalenz und Dynamik von Fledermaustollwut in einheimischen Fledermauspopulationen. Die Form der intensivierten passiven Surveillance sollte daher als Standard für eine zukünftige Surveillance der Fledermaustollwut in Deutschland und anderen europäischen Ländern betrachtet werden. Darüber hinaus wurde bei natürlich infizierten Fledermäusen (E. serotinus, M. daubentonii, P. nathusii) die Virusverteilung und -last in Geweben verschiedener Organe unter dem Aspekt möglicher Ausscheidungswege untersucht. Virus-spezifische RNA wurde in allen untersuchten Organen nachgewiesen; bedingt durch die neurotropen Eigenschaften der Lyssaviren wurde die höchste Viruslast im Gehirn festgestellt. Signifikant hohe Viruslasten waren zudem in der Speichel¬drüse nachweisbar. Zusätzlich zur Speicheldrüse scheint die Zunge ein Organ zu sein, in dem Virusreplikation und -ausscheidung stattfindet, da in verschiedenen zellulären Strukturen des Zungengewebes Lyssavirusantigen bzw. virale RNA histologisch nachgewiesen wurden. Die Ausscheidung und Übertragung von fledermausassoziierten Lyssaviren über den Harntrakt oder die Atemwege ist wissenschaftlich umstritten und konnte in dieser Studie immunhistochemisch nicht bestätigt werden.
Lyssavirus Matrixproteine (M) sind essentielle Komponenten im Virus-Assembly. Zusätzliche Virus RNA-Synthese regulierende und wirtszellmanipulierende Funktionen machen das M Protein zu einem zentralen Faktor der wirtszellabhängigen Virusreplikation und Pathogenese im infizierten Organismus. Damit könnte das M Protein einen wesentlichen Faktor bei der Anpassung von Lyssaviren an bestimmte Wirtsspezies darstellen und als Pathogenitätsdeterminante die spezifische Virulenz unterschiedlicher Lyssavirus Isolate begründen. Inwieweit Lyssavirus M Proteine sich tatsächlich in grundlegenden Funktionen der Virusreplikation und Wirtszellmanipulation unterscheiden, ist bisher nur unzureichend geklärt. Hier wurden M Proteine aus einem attenuierten Rabies Virus Stamm (RABV M) und aus einem fledermausassoziierten Lyssavirus (Europäische Fledermaus Lyssavirus Typ 1; EBLV 1 M) hinsichtlich funktioneller Unterschiede im Virus-Assembly und ihrer intrazellulären Lokalisation in virusinfizierten Zellen verglichen. Zusätzlich wurde durch die gezielte Insertion von Mutationen in das RABV M Protein ein stark attenuiertes RABV generiert, das eine wichtige Grundlage für die weitere Erforschung M abhängiger Mechanismen der Pathogenese und Viruseliminierung aus dem zentralen Nervensystem (ZNS) darstellt. Tatsächlich wurden mit chimären RABV M und EBLV 1 M exprimierenden Viren M abhängige Unterschiede in der Virusmorphogenese bestätigt. Eine RABV M abhängige Akkumulierung von Viruspartikel-ähnlichen Strukturen im rauen Endoplasmatischen Retikulum (rER) wurde mit der Kombination unterschiedlicher RABV und EBLV 1 M Sequenzen auf fünf C terminale Aminosäuren an den Positionen 187, 190, 192, 196 und 197 eingegrenzt. Mit der Identifizierung dieser Positionen konnte postulierte werden, dass es sich bei den beobachteten ultrastrukturellen Unterschieden nicht um Virusspezies sondern um Isolat-spezifische Unterschiede handelt, die möglicherweise einen Einfluss auf in vivo Virusreplikation und Pathogenese haben. Die vergleichende fluoreszenzmikroskopische Analyse infizierter Zellen zeigte, dass EBLV 1 M Protein im Gegensatz zum RABV M Protein an Membranen des Golgi-Apparates akkumulierte. Im Gegensatz zur Akkumulierung von Viruspartikel-ähnlichen Strukturen im rER konnte die EBLV 1 M spezifische Golgi-Apparat Lokalisation nicht auf einzelne Bereiche des M Proteins eingegrenzt werden, weshalb davon ausgegangen werden muss, dass hier die Integrität des gesamten EBLV 1 M Proteins notwendig ist. Erstmals wurden Lyssavirus M Proteine in viralen Einschlusskörpern und Zellkernen infizierter Zellen nachgewiesen. Während die Präsenz in den Einschlusskörpern ein wichtiges Element bei der Erforschung RNA-Synthese regulativer M Funktionen darstellt, können mit dem Nachweis von Lyssavirus M Proteinen im Zellkern wirtszellmanipulierende Funktionen auf nukleärer Ebene postuliert werden. Neben dem Nachweis der Proteine im Nukleus wurde mit fluoreszenzmarkiertem M Protein gezeigt, dass die Kernmembran eine Diffusionsbarriere für das M Protein darstellt und dass ein aktiver Transport in den Zellkern stattfinden muss. Zusammenfassend werden mit dieser Arbeit wichtige Erkenntnisse zu Unterschieden und Gemeinsamkeiten von Lyssavirus M Proteinen bezüglich Virusmorphogenese und wirtszellmanipulierender M Funktionen vorgelegt, die das aktuelle Verständnis der Lyssavirus Replikation vertiefen und weiterführende Arbeiten zu molekularen Mechanismen der Virusreplikation und Pathogenese ermöglichen.
The virosphere comprises all known and unknown viruses in our ecosystems. Advanced sequencing technologies in combination with metagenomic analysis have become a key tool for exploring this global diversity of viruses. However, discovery of novel viruses and comparative analyses are often based on small sequence fragments or lack biological context, which restricts a proper classification. In this study advanced genomic methods were used that included comprehensive knowledge of viral genomes along with supporting biological metadata in order to identify and classify viruses at different levels of genetic relationships. In a first example, the genetic background of vaccine-induced rabies cases was revealed by analyzing and comparing the genetic diversity of viral populations. Furthermore, the fundament for a taxonomic reclassification of orthopoxviruses was established on basis of a wide scale genomic analysis. In addition, novel neurotropic mamastroviruses from sheep and cattle were classified as members of a single species that provided evidence of interspecies transmission. Finally, two putative novel species of alphaherpesviruses and orthopoxviruses were identified. These examples are based on field cases that provide substantial corresponding clinical metadata and information of host-pathogen interactions. The analyses, therefore, puts taxonomic classification into biological and epidemiological context, rather than addressing generic phylogenetic relationships. Furthermore, the presented work demonstrates that a universal approach for virus classification is neither feasible nor reasonable as analyses must be adjusted the nature of the addressed virus. All results with impact on the current taxonomic classification will be or are already reported to the International Committee on Taxonomy of Viruses. In conclusion, this thesis contributed to the classification concepts of viruses and expanded the knowledge of virosphere diversity.
Rabies virus (RABV) is an ancient, highly neurotropic rhabdovirus that causes lethal encephalitis. Most RABV pathogenesis determinants have been identified with laboratory-adapted or attenuated RABVs, but details of natural RABV pathogenesis and attenuation mechanisms are still poorly understood. To provide a deeper insight in the cellular mechanism of pathogenies of field RABV, this work was performed to assess virus strain specific differences in intra-neuronal virus transport, to identify cell culture adaptive mutations in recombinant field viruses and to explore shRNA-expressing RABVs as research tools for targeted host manipulation in infected cells.
Comparison of chimeric RABVs with glycoprotein (G) ecto-domains of different lyssaviruses, together with field RABVs from dog and fox in dorsal root ganglion (DRG) neurons revealed no detectable differences in the axonal accumulation of the viruses. This indicates that previously described G-dependent transport of newly formed RABV in axons can occur both in laboratory-adapted and field RABV. Moreover, partial overlap of nucleoprotein (N) and G protein particles in field virus infected DRG axons supported the hypothesis of the “separate model” for anterograde RABV transport.
Serial passages of recombinant dog and fox field clones in different cell lines led to the identification of general (D266N) and cell line specific (K444N) adaptive mutations in the G ecto-domain of both viruses. In BHK cells, synergistic effects of D226N, K444N and A417T on field dog virus G protein surface localization led to the loss of endoplasmic reticulum (ER) retention of G and increased virus titers in the supernatant, indicating that limited virus release by ER retention is a major bottleneck in cell culture adaptation. In addition, selection of mutations within the C-terminus of the RABV phosphoprotein (P) (R293H and R293C in fox and dog viruses, respectively) led to the hypothesis of altered binding affinities to nucleoprotein and RNP complexes. Identification of the above mentioned amino acid substitutions together with alterations in a suboptimal transcription stop signal in the P/M gene border indicated that adaptation to cell culture replication occurs on both levels, RNA transcription/replication and virus release.
To evaluate the possibility of an expression of a functional microRNA-adapted short-hairpin RNAs (miR-shRNA) expressing RABV, recombinant RABVs encoding miR-shRNAs against cellular Dynein Light Chain 1 (DYNLL1) and Acidic Nuclear Phosphoprotein 32 family member B (ANP32B) were generated. In spite of cytoplasmic transcription of the respective mRNAs, downregulation of DYNLL1 and ANP32B mRNA and respective protein levels in infected cells revealed correct processing to functional shRNAs. Specific downregulation of the cellular genes at 2, 3 and 4 days post infection further demonstrated feasibility of the approach in standard cell lines. However, it remained open whether miR-shRNA expressing RABV can be used to study neuro-infection in vivo. Since first attempts in primary rat neuron cultures failed, it has to be clarified in further experiments whether this strategy can be used in mature, non-dividing neurons or whether breakdown of the nucleus in the course of cell division is a requirement for the processing of cytoplasmically expressed miR-RNA by nuclear RNases.
By providing novel insights in axonal RABV transport and cell culture adaptive mutations this work extends the current understanding of RABV pathogenesis in natural and non-natural cell environments. Moreover, it provides a basis for further pathogenicity studies in which the impact of cell culture adaptation through increased virus release on RABV virulence can be investigated. With successful expression of functional miR-shRNAs from RABV vectors, this work also provides a tool for RABV gene targeting in infected cell lines and thus may contribute to the further investigation of RABV-host-cell-interactions.
Bats are ancient mammals that evolved more than 50 million years ago. There are 1,240 different species (> 20% of mammalian species) described so far, which represent one of the most abundant, diverse and widely distributed mammalian groups. Bats are the only mammals which actively fly and therefore can migrate to different areas of the world. It has been increasingly recognized that bats are reservoirs for more than 100 virus species, and several are associated with animal and human epidemics. As natural hosts of rabies virus (RABV) and related lyssaviruses, bats have become a focus of research not only in South America and Africa, but also in Europe and North America. Bats are also considered to be unique in their potential to host emerging and re-emerging zoonotic viruses. To evaluate and reduce the potential risk of rabies transmission to humans or carnivore hosts (like fox, raccoon and dog etc.), active and passive surveillance studies of bat have been performed. Using these approaches diverse lyssaviruses have been detected in bats. However, these studies did not explain the rarely discovered epidemics and the underlying resistance or immune mechanisms in bats as natural hosts for lyssaviruses. Probably, bats are more resistant to lyssavirus infections than other animals. This hypothesis is introducing the research questions of the present thesis: (1) How do the innate immune responses protect bats from fatal outcome of lyssavirus infections? Interferon (IFN) responses which can be induced by the recognition of viruses by pattern recognition receptors act as the first line of defense against lyssavirus infections. Therefore, type I and type III IFNs from European bats were cloned and functionally characterized in this thesis (Chapter 2 and 4). (2) How do the lyssaviruses adapt to escape the host defenses by counteracting the IFN-mediated immune responses? And how do the bats control the viral replication via the IFN responses? To explore the complicated interactions and understand how European bats (Eptesicus serotinus, Myotis myotis and Nyctalus noctula) interact with European bat lyssaviruses (EBLV-1 and 2), a natural host related model for investigations of the bat´s immune system and the virus-host interactions has to be established. Since all of 52 identified European bats species are endangered and strictly protected, stable cell lines from different tissues of M. myotis for in vitro studies were developed and used for molecular and functional studies (Chapter 3 and 4). The data obtained from this thesis revealed that: (a) European bat IFNs do have similar but also distinct molecular characteristics compared with other mammalian IFNs (Chapter 2 and 4); (b) Both investigated bat type I IFNs, IFN-Kappa; and IFN-Omega; present potent anti-lyssaviral activities and display a pathogen associated pattern in the tested cell line (Chapter 2); (c) The established immortalized M. myotis cell lines are differently susceptible to lyssaviruses and contain a functional IFN-mediated signaling cascade (Chapter 3); (d) Bat type III IFN-Lambda;s display cell-type specific functions due to the distinct expression of the IFN-Lambda; receptor (Chapter 4); (e) In bat cell lines a possible evasive strategy of lyssavirus is based on the counteraction of IFN production and/or IFN-mediated defensive pathways (Chapter 3); (f) The higher resistance of brain derived cell line MmBr compared to other cell lines to lyssavirus infection indicates the natural ability of bat´s central nervous system to control the growth of neurotropic virus, which might be an essential reason for the nonclinical outcome (Chapter 3). Overall, the present thesis provides first insights into IFN-mediated innate immune responses against RABV and EBLVs infection in their natural reservoir hosts and an useful toolbox for comparative analysis of virus-host interactions.
Molekular-epidemiologische Untersuchungen veterinärmedizinisch relevanter Pathogene beruhen auf der Auswertung und Einordnung verlässlicher und detailreicher Sequenzinformationen. In den letzten Jahren haben sich die Sequenziermethoden des sogenannten Next-Generation Sequencing (NGS) kontinuierlich weiterentwickelt, so dass nun Nukleinsäureproben unterschiedlichster Herkunft zur Volllängensequenzierung viraler Genome herangezogen werden können. Des Weiteren sind Metagenomanalysen möglich geworden, d.h. die Untersuchung der Zusammensetzung der Organismenpopulation in einer Probe durch Sequenzierung der gesamten Nukleinsäurepopulation. Letzteres erlaubt auch die Untersuchung viraler Varianten in einer Probe (Quasispeziesanalysen). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden NGS-Methoden und Arbeitsabläufe zur Ausnutzung metagenomischer Datensätze optimiert, verfeinert und nachfolgend in praxisrelevanten Studien zu Lyssa- und Coronaviren erprobt. In einer ersten Studie zur Charakterisierung des neu entdeckten Bokeloh Fledermaus-Lyssavirus konnte gezeigt werden, dass es möglich ist, akkurate Volllängensequenzinformationen direkt aus Zellkulturüberständen zu generieren, die nicht nur die mittels der klassischen Kettenabbruch-Synthese generierten Daten bestätigen, sondern darüber hinaus auch virale Varianten aufzeigen. Eine detaillierte, hochauflösende Variantenanalyse (Tiefensequenzierung) lag im Fokus einer weiteren Studie zu Lyssaviren. Hier wurden kommerzielle Oralimpfstoffe gegen die Tollwut und ihre Ausgangsvirusstämme hinsichtlich ihrer Quasispezieszusammensetzung untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Tiefensequenzierung einen wichtigen Beitrag zur Qualitätskontrolle (Stammidentität und -stabilität) eines Lebendimpfstoffes liefern kann, der in den Lizensierungsprozess eingebunden werden könnte. Dabei ist die Analyse auf Ebene der viralen Gesamtpopulation der Auswertung auf Konsensusebene überlegen. Metagenomische Datensätze erlauben nicht nur die Analyse viraler Populationen, es sind auch Wirtsinformationen ableitbar. Die kombinierte Auswertung viraler und wirtsspezifischer Informationen erlaubte eine phylogeographische Studie zur genetischen Diversität arktischer Tollwutviren und ihrer Reservoirwirte. Die Methode konnte erfolgreich angewendet werden um zu zeigen, dass es zwar eine räumliche Populationsstruktur bei den untersuchten Polarfüchsen gibt, diese jedoch nicht mit unabhängigen Tollwutvirusvarianten assoziiert werden können. Neben den oben genannten Lyssavirusprojekten waren zwei Studien zum Virus der porzinen epidemischen Diarrhoe Teil der vorliegenden Arbeit. Metagenomische Datensätze wurden verwendet, um Volllängensequenzen abzuleiten und diese phylogenetischen Detailanalysen und Netzwerk-Untersuchungen zu unterziehen. Außerdem konnten die Datensätze verwendet werden, um virale und bakterielle Koinfektionen zu untersuchen, die möglicherweise einen Einfluss auf die Schwere der Erkrankung gehabt haben könnten. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass uns die optimierten NGS-Methoden in die Lage versetzen, metagenomische Datensätze zu nutzen, um nicht nur unverfälschte Volllängensequenzen für phylogenetische Detailanalysen zu generieren, sondern auch Quasispezies-Analysen durchzuführen sowie Wirts- und Virusfaktoren vergleichend zu untersuchen.
Objektive Eingruppierung sequenzierter Tollwutisolate mithilfe des Affinity Propagation Clusterings.
(2018)
Das International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) reguliert die Nomenklatur von Viren sowie die Entstehung neuer Taxa (dazu gehören: Ordnung, Familie, Unterfamilie, Gattung und Art/Spezies). Dank dieser Anstrengungen ist die Einteilung für verschiedenste Viren in diese Kategorien klar und transparent nachvollziehbar. In den vergangenen Jahrzehnten sind insgesamt mehr als 21.000 Datensätze der Spezies „rabies lyssavirus“ (RABV) sequenziert worden. Eine weiterführende Unterteilung der sequenzierten Virusisolate dieser Spezies ist bislang jedoch nicht einheitlich vorgeschlagen. Die große Anzahl an sequenzierten Isolaten führte auf Basis von phylogenetischen Bäumen zu uneindeutigen Ergebnissen bei der Einteilung in Cluster. Inhalt meiner Dissertation ist daher ein Vorschlag, diese Problematik mit der Anwendung einer partitionierenden Clusteringmethode zu lösen. Dazu habe ich erstmals die Methodik des affinity propagation clustering (AP) für solche Fragestellungen eingesetzt. Als Datensatz wurden alle verfügbaren sequenzierten Vollgenomisolate der Spezies RABV analysiert. Die Analysen des Datensatzes ergaben vier Hauptcluster, die sich geographisch separieren ließen und entsprechend als „Arctic“, „Cosmopolitain“, „Asian“ und „New World“ bezeichnet wurden. Weiterführende Analysen erlaubten auch eine weitere Aufteilung dieser Hauptcluster in 12-13 Untercluster. Zusätzlich konnte ich einen Workflow generieren, der die Möglichkeit bietet, die mittels AP definierten Cluster mit den Ergebnissen der phylogenetischen Auswertungen zu kombinieren. Somit lassen sich sowohl Verwandtschaftsverhältnisse erkennen als auch eine objektive Clustereinteilung vornehmen. Dies könnte auch ein möglicher Analyseweg für weitere Virusspezies oder andere vergleichende Sequenzanalysen sein.