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Während des Replikationszyklus der Herpesviren vermittelt ein heterodimerer Proteinkomplex, welcher als nuclear egress complex (NEC) bezeichnet wird, den Transport neu synthetisierter Nukleokapside vom Zellkern ins Zytoplasma. Ziel dieser Arbeit war es, die molekularen Grundlagen des viralen Kernaustritts weiter aufzuklären und funktionelle Domänen in den NEC-Komponenten, welche beim Pseudorabies Virus als pUL31 und pUL34 bezeichnet werden, zu ermitteln. Bereits durchgeführte Analysen konnten zeigen, dass die Transmembrandomäne des pUL34, die für die Verankerung des NEC an der Kernmembran verantwortlich ist, bei HSV-1 und PrV durch heterologe Sequenzen ausgetauscht werden kann, ohne dass dabei die Proteinfunktion während des viralen Kernaustritts inhibiert wird. Beim PrV pUL34 kann sogar eine Substitution der 50 C-terminalen Aminosäuren toleriert werden, wohingegen die Substitution 100 C-terminaler Aminosäuren zum Funktionsverlust des Proteins führt. Zur Identifikation möglicher funktioneller Domänen im C-Terminus des PrV pUL34 wurde das Protein in der vorliegenden Arbeit zwischen 50 und 100 C-terminalen Aminosäuren schrittweise verkürzt. Dabei konnte gezeigt werden, dass eine Deletion von 85 C-terminale Aminosäuren keine Beeinträchtigung der Proteinfunktion verursachte, wohingegen die weitere Deletion und Substitution von 90 Aminosäuren den viralen Kernaustritt blockierte. Somit konnte ein funktionell wichtiger Bereich des Proteins auf die Aminosäuren 172 bis 176 eingegrenzt werden. In dieser Region befindet sich die Sequenz 173RQR175, die einem RXR-Motiv entspricht, das als Signalsequenz für den Transport von Membranproteinen an die innere Kernmembran beschrieben wurde. Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführte Analyse konnte jedoch zeigen, dass es sich hierbei um ein Arginin basierendes ER-Lokalisierungssignal handelt, welches die Anreicherung von Proteinen im endoplasmatische Retikulum (ER) und der damit verbundenen Kernmembran vermittelt. Neben der konservierten C-terminalen Hälfte des PrV pUL34 wurde in dieser Arbeit auch der N-Terminus analysiert. Bereits durchgeführte Studien beim PrV pUL34 ergaben dabei, dass die ersten 161 Aminosäuren für die Interaktion mit pUL31 und damit für die NEC-Bildung verantwortlich sind. In der vorliegenden Arbeit konnte die pUL31-Interaktionsdomäne auf den Bereich von Aminosäure 5 bis 161 eingegrenzt werden. Zur Analyse wichtiger Aminosäuren oder Motive innerhalb der Interaktionsdomäne beim PrV pUL34 wurden in der vorliegenden Arbeit gezielt konservierte Aminosäuren zu Alanin ausgetauscht und die Auswirkungen auf die Bildung des NEC und der Funktion während einer Infektion analysiert. Dabei konnten zwei konservierte Motive identifiziert werden, die für die NEC-Bildung wichtig sind. Zum Einen wurde ein Motiv bestehend aus einer Glutaminsäure (E) und einem Tyrosin (Y) (EY-Motiv) detektiert, welches bereits in anderen pUL34-Homologen als essentiell für die Bildung eines funktionellen NEC beschrieben wurde. Für ein zweites Motiv bestehend aus einem Asparagin (N), einem Threonin (T) und einem Glycin (G) (NTG-Motiv) zeigte sich, dass N und G für die Funktion des NEC wichtig sind. Zusätzlich zu diesen beiden Motiven konnte ein konserviertes Asparagin an Position 103 identifiziert werden, welches zwar nicht für die Bildung des NEC benötigt wird, aber für die Funktion während des Kernaustritts essentiell ist. In dieser Arbeit wurde auch die zweite Komponente des NEC, das pUL31, untersucht. Dabei konnte die Funktion eines vorhergesagten Kernlokalisierungssignals (nuclear localization signal, NLS) im N-Terminus des Proteins bestätigt werden. Außerdem wurde ein Kernexportsignal (nuclear export signal, NES) identifiziert, welches eine wichtige Rolle bei der Knospung der Nukleokapside an der inneren Kernmembran während des Kernaustritts spielt. Hierfür wurden in dieser Studie die entsprechenden Bereiche im N- bzw. C-Terminus von pUL31 deletiert, was die Bildung eines funktionellen NEC und somit den Transport der Kapside aus dem Kern verhinderte. Ausgehend von vorherigen Untersuchungen am PrV pUL31, kann dabei spekuliert werden, dass der Bereich des NLS im N-Terminus neben der Lokalisierung im Zellkern möglicherweise auch für eine Funktion bei der Oligomerisierung von NECs bzw. pUL31-Molekülen wichtig ist. Der Bereich im C-Terminus, welcher das NES beinhaltet, scheint hingegen für die Komplexbildung mit pUL34 relevant zu sein. Zusammenfassend führten die hier durchgeführten Analysen in den beiden NEC-Komponenten pUL31 und pUL34 zu einem besseren Verständnis der molekularen Grundlagen des herpesviralen Kernaustritts. Da es bisher noch nicht gelungen ist eine Kristallstruktur des NEC zu ermitteln, sind Mutagenesestudien eine wichtige Methode funktionelle Domänen zu identifizieren. Die Aufklärung der NEC-Struktur kann in Kombination mit den bereits durchgeführten Mutagenesestudien das Verständnis der Funktion dieses Komplexes weiter komplettieren.
Der Kernaustritt der Nukleokapside stellt einen essentiellen Schritt im Replikationszyklus der Herpesviren dar. Aufgrund seiner Größe kann das Kapsid den Kern nicht durch die Kernporen verlassen, sondern wird durch die Kernmembranen transportiert. Die viralen Proteine pUL34 und pUL31 bilden den NEC (nuclear egress complex), der virale und zelluläre Kinasen an die Kernmembran rekrutiert. Diese phosphorylieren die Lamine, wodurch sich die Lamina partiell auflöst und das Nukleokapsid Zugang zur Kernmembran erhält. Die Deletion einer oder beider Komponenten des NEC bewirkt zwar eine deutliche Reduktion der viralen Titer, jedoch wird eine geringe Menge infektiöser Nachkommenviren freigesetzt, die für eine Reversionsanalyse genutzt wurde. Dafür wurde zuerst das UL34-negative Virus und später auch das UL31-negative Virus, auf Kaninchennierenzellen (RK13) seriell passagiert, bis im Überstand Wildtyp-ähnliche Titer erreicht wurden. Aus diesen Überständen wurden Virusmutanten isoliert, die ohne den NEC effizient replizierten und als PrV-ΔUL34Pass bzw. PrV-ΔUL31Pass bezeichnet wurden. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten, dass die passagierten Viren nicht mehr wie der PrV-Wildtyp durch die Kernmembran transportiert, sondern durch eine partiell aufgelöste Kernmembran ins Zytoplasma freigesetzt wurden. Das Ziel dieser Arbeit war zu untersuchen, wie die Freisetzung der Kapside aus dem Kern ohne den essentiellen NEC abläuft. Um zu ermitteln, welche viralen Proteine für die Auflösung der Kernmembran von Bedeutung sein könnten, wurde zunächst das komplette Genom von PrV-ΔUL34Pass sequenziert und mit dem des Wildtyps (PrV-Ka) und der nicht passagierten UL34-Deletionsmutante (PrV-ΔUL34) verglichen. Die mutierten Gene wurden anschließend in PrV-ΔUL31Pass sequenziert. Zu den sieben Genen, die in beiden passagierten Viren verändert sind, gehören u.a. UL21, UL26, UL46 und UL49. Jedoch konnte durch Deletion der einzelnen mutierten Gene nicht geklärt werden, welches Genprodukt für die Kernmembran-Fragmentierung in PrV-ΔUL34Pass- oder PrV-ΔUL31Pass infizierten Zellen bzw. für die Stabilisierung der Kernmembran während der Wildtyp-Infektion verantwortlich ist. Mit Hilfe von Inhibitorstudien wurde untersucht, welche zellulären Prozesse von den passagierten Viren manipuliert werden könnten, um die Kernmembran-Fragmentierung zu induzieren. Der Cdk (Cyclin dependent kinase) 1, Cdk2 und Cdk5-Inhibitor Roscovitin, der in höheren Dosen auch ERK1/2 (extracellular regulated kinase 1/2) hemmt, reduzierte die Titer der passagierten Viren deutlich, während der PrV-Wildtyp kaum beeinflusst wurde. Einen ähnlichen Effekt konnte auch mit einem Inhibitor für die ERK1/2 vorgeschaltete Kinase MEK1/2 (mitogen activated protein kinase/ERK kinase 1/2) erzielt werden. Spezifische Inhibitoren von ERK1/2, Cdk1, Cdk2 oder Cdk5 zeigten jedoch keinen spezifischen Einfluss auf die passagierten Virusmutanten oder den Wildtyp. Zur selben Zeit konnte eine andere Arbeitsgruppe zeigen, dass das Varizella Zoster Virus pUL46 Homolog ORF12 die Aktivierung von ERK1/2 induziert (Liu et al., J. Virol. 86, 2012). Basierend auf dieser Studie wurde untersucht, ob PrV pUL46 ebenfalls ERK1/2 aktivieren kann und ob diese Aktivierung für die Auflösung der Kernmembran von Bedeutung ist. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl PrV-Wildtyp als auch PrV-ΔUL34Pass pUL46 ERK1/2 und die entsprechenden Zielgene aktivierte. Die Deletion von UL46 aus dem Genom der passagierten Viren resultierte außerdem in einem deutlich höheren Anteil von Zellen mit einer fragmentierten Kernmembran, wobei dies nicht ausschließlich auf die Aktivierung von ERK1/2 durch pUL46 zurückgeführt werden kann, da sich die beiden passagierten Viren in ihrem ERK-Aktivierungspotential unterscheiden. Während PrV-ΔUL31Pass ERK1/2 vergleichbar zum Wildtyp induzierte, war die Aktivierung durch PrV-ΔUL34Pass deutlich geringer. Diese Abweichung lässt sich nicht auf die unterschiedlichen pUL46-Proteine der beiden passagierten Virusmutanten zurückführen, da der Austausch der jeweiligen UL46 Sequenzen gegen Wildtyp UL46 das ERK1/2-Aktivierungsmuster nicht veränderte. Somit scheint pUL46 einen Einfluss auf die Stabilität der Kernmembran und die Aktivierung von ERK zu haben. Beide passierte Viren bilden verstärkt Synzytien im Vergleich zum PrV-Wildtyp oder den nicht-passagierten Vorläufern aus. Um zu untersuchen, ob diese Deregulierung der Membranfusion auch die Kernmembranen betrifft und möglicherweise eine Ursache für die Fragmentierung sein könnte, wurden die Glykoproteine gB und gH aus den Genomen der passagierten Virusmutanten deletiert. Elektronenmikroskopische Aufnahmen sowie Untersuchungen von Replikationsverhalten und Plaquebildung ergaben, dass die Fragmentierung der Kernmembran auch in Abwesenheit von gB oder gH stattfindet. Dagegen sind beide Glykoproteine, wie auch im PrV-Wildtyp, für die Virusreplikation essentiell.
Die Serin/Threonin Proteinkinase pUS3 ist innerhalb der Alphaherpesvirinae konserviert. Für pUS3-Homologe der Subfamilie wurden bereits zahlreiche Funktionen bei der Beeinflussung des Zellstoffwechsels und der Virusreplikation gezeigt, dennoch ist pUS3 für die Virusreplikation in vitro nicht essentiell. PrV exprimiert zwei unterschiedlich lange Isoformen dieses Proteins in unterschiedlicher Menge, so dass das kürzere pUS3S im Vergleich zu pUS3L die abundante Isoform darstellt. Während die carboxyterminalen Sequenzen beider Isoformen identisch sind, weist der Amino-Terminus der langen Form 54 zusätzliche Aminosäuren auf. Innerhalb der Wirtszelle liegt pUS3S vor allem im Nukleus vor, wohingegen pUS3L vorwiegend im Zytoplasma, der Plasmamembran und den Mitochondrien lokalisiert ist. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der möglichen unterschiedlichen Funktionen der beiden pUS3-Isoformen und der Bedeutung des Expressionsniveaus dieser Isoformen während der Virusmorphogenese. Im Vordergrund stand dabei die Analyse von Virusmutanten, bei denen die Expression von pUS3S bzw. pUS3L auf unterschiedliche Weise manipuliert wurde oder bei denen eine Inaktivierung der enzymatischen Aktivität erfolgte. Diese wurden auf empfänglichen Zelllinien dreier Tierarten phänotypisch charakterisiert und auf Unterschiede hinsichtlich ihres Replikationsverhaltens untersucht. Ein weiterer Teil dieser Arbeit umfasste Untersuchungen zur Identifizierung potentieller Substrate der Proteinkinase pUS3 mittels 32P-Radioimmunpräzipitation und Proteomanalytik, die eine weitere Analyse der Strukturkomponenten von PrV-Partikeln sowie die Prüfung einer Methode zur Präparation nukleärer Proteine einschloss.
Herpesviren nutzen zwei unterschiedliche Zellkompartimente für die Morphogenese. Während der Kapsid-Zusammenbau und die DNA Verpackung im Zellkern stattfinden, erfolgt die weitere Assemblierung im Zytoplasma. Um dorthin zu gelangen muss die Kernmembranbarriere überwunden werden. Hierfür knospen die Nukleokapside an der inneren Kernmembran und erhalten dort eine primäre Virushülle, die allerdings nach Fusion mit der äußeren Kernmembran wieder verloren geht. Für diesen als envelopment-deenvelopment bezeichneten Vorgang ist ein Komplex aus zwei viralen Proteinen notwendig. Er besteht aus pUL34, einem Membranprotein der Kernmembran und dessen Interaktionspartner pUL31. Beide Proteine allein reichen aus, um Membranvesikel von der inneren Kernmembran abzuschnüren. Ziel dieser Arbeit war, diesen nuclear egress weiter zu charakterisieren. Hierfür sollte zunächst geklärt werden, welche Domänen von pUL34 für dessen korrekte Lokalisierung in der Kernmembran und der Interaktion mit dem Komplexpartner pUL31 notwendig sind. Dazu wurden chimäre Proteine aus Teilen des pUL34 und zellulären Proteinen der inneren Kernmembran hergestellt. Die Ergebnisse zeigten, dass die pUL34-Transmembrandomäne keine virusspezifische Funktion besitzt und durch entsprechende Bereiche zellulärer Proteine ausgetauscht werden kann. Auch die Erweiterung der Substitution auf 50 C-terminale Aminosäuren führte zu einem funktionellen Protein, während ein Konstrukt mit einem Austausch von 100 C-terminalen Aminosäuren durch entsprechende Lap2ß Sequenzen den Defekt der PrV-deltaUL34-Deletionsmutante nicht mehr komplementieren konnte. Dennoch war noch immer eine Interaktion mit dem Komplexpartner möglich. Dies zeigte, dass zwischen den C-terminalen Aminosäuren 50 und 100 ein virusspezifischer, funktionell wichtiger Bereich liegt, der in nachfolgenden Arbeiten weiter eingegrenzt werden muss. In früheren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass die Aminosäuren 1-162 des PrV pUL34 für die Interaktion mit pUL31 ausreichen. Für das engverwandte HSV-1 konnte dieser Bereich jedoch auf die Aminosäuren 137 und 181 eingegrenzt werden. Um dies für PrV pUL34 näher zu untersuchen wurde das Konstrukt pUL34-LapNT hergestellt, bei dem die 100 N-terminalen Aminosäuren durch Lap2ß Sequenzen ersetzt wurden. Hier zeigte sich jedoch, dass pUL34-LapNT das pUL31 nicht mehr an die innere Kernmembran rekrutieren konnte und folglich den Defekt der PrV-delta UL34-Deletionsmutante nicht mehr komplementierte. Im Gegensatz zu HSV-1 scheinen hier auch die N-terminalen 100 Aminosäuren für die Interaktion mit pUL31 notwendig zu sein. Da die Expression von pUL34 und pUL31 allein ausreicht, um die Bildung von Membranvesikeln von der inneren Kernmembran abzuschnüren, sollte im Weiteren getestet werden, ob auch Kapside in diese Vesikel aufgenommen werden. Da bei Herpesviren die Kapside autokatalytisch gebildet werden und dies bereits für einige Herpesviren über Expression in rekombinanten Baculoviren nachgestellt werden konnte, sollte versucht werden, dies auch für PrV zu etablieren. Dabei sollte die Kapsidbildung über Transduktion in Säugerzellen unabhängig von einer PrV Infektion nachgestellt werden. Hierbei sollte geklärt werden, welche weiteren viralen Proteine, neben den eigentlichen Kapsidproteinen, wie z.B. das pUL17 und pUL25, für den nuclear egress notwendig sind. Obwohl alle Kapsidkomponenten kloniert und auch in Zellen exprimiert werden konnten, konnte keine Kapsidbildung nachgewiesen werden. Die Ursachen hierfür konnten nicht geklärt werden. Auffällig war, dass das Triplexprotein pUL38 in den Baculovirus-transduzierten Zelllysaten ein etwas anderes Laufverhalten als das in Zelllysaten PrV-infizierter Zellen aufwies, dessen Ursache nicht auf der Verwendung eines downstream lokalisierten Startkodons beruhte. Mit Hilfe dieser rekombinanten Baculovirusvektoren konnte jedoch gezeigt werden, dass das Hauptkapsidprotein pUL19 mit dem Gerüstprotein (pUL26 bzw. pUL26.5) und die Triplexproteine pUL18 und pUL38 gemeinsam in den Kern transportiert werden. Die Beteiligung zellulärer Proteine am nuclear egress sollte über siRNA Experimente untersucht werden. In einer vorangegangen Arbeit war gezeigt worden, dass p97, eine zelluläre AAA+ATPase, nach Infektion vermehrt exprimiert wurde. Ziel war es, die p97 Expression über siRNA zu reduzieren und den Effekt auf die Virusinfektion zu untersuchen. Eine erfolgreiche siRNA Studie war bereits für p97 in Rattenzellen publiziert und sollte hier angewandt werden. Leider waren die zur Verfügung stehenden Rattenzelllinien nur sehr ineffizient transfizierbar und zusätzlich auch schlecht mit PrV infizierbar. Das eigene Design und die Anwendung von p97 spezifischer siRNA für Kaninchenzellen zeigte zwar die gewünschte Reduktion der p97 Expression, war jedoch nur sehr schlecht reproduzierbar und konnte daher nicht für aussagekräftige Infektionsversuche verwendet werden.
Der effiziente intrazelluläre Transport viraler Nukleokapside ist eine grundlegende Voraussetzung für eine erfolgreiche Virusinfektion. Aufgrund seiner engen Verwandtschaft zum humanpathogenen Herpes Simplex Virus 1 (HSV-1) und seiner Eigenschaft zur einfachen gentechnischen Veränderung stellt das Pseudorabies Virus (PrV) ein geeignetes Modell zur Untersuchung molekularer Mechanismen der Replikation und des Neurotropismus von Herpesviren dar. Der intrazelluläre Transport herpesviraler Kapside erfolgt aktiv entlang von Mikrotubuli durch zelluläre Motorproteinkomplexe. Die hieran beteiligten viralen Proteine konnten bisher jedoch nicht eindeutig identifiziert werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Funktionen viraler Proteine im intrazellulären Transport von PrV. In erster Linie wurde die Rolle von PrV pUL35 und pUL37 untersucht, die auf intrazytoplasmatischen Kapsiden an der Oberfläche liegen und der Interaktion mit zellulären Proteinen zugänglich sind. Neben der Charakterisierung der Virusreplikation nach Deletion der einzelnen Gene in vitro und in vivo wurde auch der intrazelluläre Transport von GFP-markierten Mutanten zum Zellkern untersucht. In einem weiteren Teil der Arbeit wurden Kapsid- und eng mit dem Kapsid assoziierte Proteine in yeast two-hybrid Studien analysiert, um virale und zelluläre Interaktionspartner zu identifizieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen sich wie folgt zusammenfassen: (1) PrV pUL35 und pUL37 sind für die Virusreplikation in vitro nicht essentiell. Die Replikation von UL35- bzw. UL37-Mutanten war jedoch vermindert. In Abwesenheit von funktionellem pUL35 und pUL37 gleichzeitig trugen die beiden Mutationen unabhängig voneinander zu einem verstärkten Phänotyp bei. Beide Proteine scheinen demnach in unterschiedliche Prozesse der Virusreplikation involviert zu sein. (2) Die N-terminale EGFP-Fusion von pUL35 zum Zweck der Fluoreszenzmarkierung viraler Kapside resultierte im Funktionsverlust des Proteins. Die Inkorporation in Kapside wurde aber nicht beeinträchtigt. Für die Interaktion von PrV pUL35 mit dem Kapsid könnte der konservierte C-Terminus des Proteins relevant sein. (3) Auch in Abwesenheit eines funktionellen pUL35 werden PrV Kapside effizient transportiert. PrV pUL35 kommt somit keine entscheidende Rolle beim intrazellulären Transport viraler Nukleokapside zu. Die verzögerte Neuroinvasion von UL35-Mutanten in vivo lässt jedoch eine möglicherweise akzessorische Funktion von pUL35 vermuten. (4) PrV pUL37 ist für den intrazellulären Transport viraler Nukleokapside nicht essentiell, erhöht jedoch deutlich dessen Effizienz. Der positive Einfluss auf den retro- und anterograden Transport viraler Kapside lässt darauf schließen, dass pUL37 in Transportprozesse während des Viruseintritts und der Freisetung involviert ist. (5) Der N-Terminus von PrV pUL36 interagierte im yeast two-hybrid System mit den Untereinheiten Rp3, LC8 und Tctex1 des Dynein-Motorproteinkomplexes. PrV pUL36 könnte daher für den MT-abhängigen Transport viraler Nukleokapside relevant sein.
Funktionelle Charakterisierung des essentiellen Tegumentproteins pUL36 des Pseudorabies Virus
(2008)
Das Pseudorabies Virus ist der Erreger der Aujeszkyschen Erkrankung, einer fieberhaften Allgemeinerkrankung mit neurologischen Symptomen beim Schwein. Aufgrund seiner biologischen Eigenschaften und unkomplizierten Kultivierung in Zellkultur sowie der Verfügbarkeit eines Mausmodells hat sich PrV als geeignetes Modellsystem zur Untersuchung der alphaherpesviralen Replikation etabliert. Das Tegument stellt den komplexesten und noch am wenigsten verstandenen Teil des Herpesviruspartikels dar. Für PrV konnten mehr als 15 dem Tegument zugeordnete Proteine identifiziert werden, die neben ihrer strukturellen Bedeutung auch regulatorische Funktionen erfüllen. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung und Charakterisierung funktioneller Domänen des essentiellen Tegumentproteins pUL36 des Pseudorabies Virus. Mit Hilfe eines Transkomplementationsassays konnten verschiedene rekombinante UL36-Proteine auf ihre Fähigkeit, den letalen Replikationsdefekt einer UL36-Deletionsmutante zu komplementieren, überprüft werden. Bei positiver Komplementation wurden stabile Virusrekombinanten isoliert und diese auf ein möglicherweise verändertes Replikationsverhalten in der Zellkultur (in vitro) oder im Mausmodell (in vivo) untersucht. Negative Komplementationsergebnisse weisen auf eine essentielle Funktion dieser Region innerhalb des UL36-Proteins hin. Die durchgeführten Primärsequenzvergleiche homologer UL36-Proteine zeigten einen geringen Grad an Sequenzhomologie. Jedoch konnten mehrere konservierte Domänen und putative Motive identifiziert werden. Dem im N-Terminus gelegenen Modul konnte die für HSV-1 sowie Vertretern aller drei Unterfamilien beschriebene Deubiquitinylierungsaktivität zugeordnet werden. Weiterhin zeigte sich, dass die 62 C-terminalen Aminosäuren innerhalb der Alphaherpesviren stark konserviert sind, was auf eine wichtige Bedeutung dieser Region für die Funktion des UL36-Proteins hindeutet. Eine große prolinreiche Domäne im C-terminalen Bereich spricht für eine extreme Flexibilität des Proteins und eine mögliche Konformationsänderung während des Replikationszykluses. Leucin-Zipper-Motive könnten eine pUL36-Homodimerisierung oder eine bisher noch nicht beschriebene Interaktion mit viralen oder zellulären Proteinen vermitteln. Nach Charakterisierung verschiedener rekombinanter UL36 Proteine lässt sich Folgendes zum essentiellen Tegumentprotein pUL36 des Pseudorabies Virus sagen: 1) Es konnten verschiedene Domänen innerhalb des PrV-UL36-Proteins identifiziert werden, die für die Replikation sowohl in der Zellkultur als auch im Tiermodell von unterschiedlich wichtiger Bedeutung sind. Insgesamt wurden fast 50% des Proteins deletiert, ohne einen letalen Funktionsverlust zu bewirken. 2) Der C-Terminus des UL36-Proteins des Pseudorabies Virus ist für die Funktion des Proteins im Replikationsgeschehen essentiell, was auf eine mögliche Interaktion mit Kapsid- und/oder kapsidassoziierten Proteinen zurückzuführen sein könnte. 3) Die reifen Virionen der Mutanten zeigen keine Veränderungen hinsichtlich ihrer Morphologie. Auch biochemisch wurden keine Veränderungen in der Proteinzusammensetzung der untersuchten Virionen festgestellt. 4) Keine der charakterisierten Mutanten wies einen Defekt bei der Freisetzung neugebildeter Kapside aus dem Zellkern auf, d. h., die deletierten Bereiche haben keine Bedeutung während der nukleären Phasen der Virusmorphogenese. 5) PrV-pUL36 könnte weiterhin für den Ablauf der Infektion des Nervensystems von Bedeutung sein, da eine deutliche Einschränkung der Neuroinvasion einiger Mutanten im Mausmodell beobachtet wurde.