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Staphylococcus aureus (S. aureus) ist einer der meist gefürchtetsten pathogenen Mikroorganismen, der verantwortlich ist für eine Vielzahl von nosokomialen Infektionen und Krankheiten. S. aureus ist in der Lage, sich an verändernde Umweltbedingungen auf Ebene der Genexpression anzupassen, was zu unterschiedlichen Proteinzusammensetzungen und somit zu Veränderungen in der Metabolitenkomposition und metabolischen Aktivität führt. Außerdem stellt die Fähigkeit, Resistenzen gegen gegenwärtig genutzte Antibiotika zu entwickeln, eine Gefahr dar und macht diesen Keim in seiner Behandlung so schwierig. Für ein vollständiges Verstehen der Proteom-, Transkriptom- und Metabolomdaten ist die Untersuchung der Enzymaktivitäten ein entscheidendes Hilfsmittel. In der vorliegenden Arbeit wurden die enzymkatalytischen Eigenschaften sowie die spezifischen Enzymaktivitäten der Enzyme des Intermediär- und Fermentationsstoffwechsels untersucht. Aus Zellen der logarithmischen, transienten und stationären Wachstumsphase unter aeroben wie auch anaeroben Bedingungen wurden für die Enzyme das pH-Optimum, die maximale Reaktionsgeschwindigkeit (vmax) und die Substratkonzentration der halbmaximalen Reaktionsgeschwindigkeit (Km) bestimmt. In S. aureus COL wird die Glucose unter aeroben Bedingungen hauptsächlich über die Glycolyse metabolisiert. Glucose-6-phosphat wird weiter zu Pyruvat umgesetzt, welches wiederum durch die Pyruvat-Oxidase zu Acetylphosphat oder durch den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex zu Acetyl-CoA verstoffwechselt wird. Durch die Phosphatacetyl-Transferase wird das Acetyl-CoA im Folgenden ebenfalls zu Acetylphosphat umgesetzt und nicht dem Citrat-Zyklus zugeführt. Die Acetat-Kinase nutzt das Acetylphosphat zur Generierung von ATP. Geringe extrazelluläre Lactat-Konzentrationen weisen auf eine geringere Bedeutung der Lactat-Dehydrogenase unter aeroben Wachstumsbedingungen hin. Gleichwohl wird ein kleiner Teil des Pyruvates zur Regeneration von NAD+ durch die Lactat-Dehydrogenase genutzt. In der transienten und stationären Wachstumsphase werden die Gene der Enzyme für Gluconeogenese und Citrat-Zyklus vermehrt exprimiert. Lactat und Acetat werden als Kohlenstoff- und Energiequelle wieder aufgenommen und dienen der Bildung unterschiedlicher Intermediate, wie beispielsweise der Bildung von NADPH über Glucose-6-phosphat im Pentose-Phosphat-Weg. Lediglich die Citrat-Synthase, Isocitrat-Dehydrogenase und Fumarat-Hydratase des Citrat-Zyklus konnten enzymologisch untersucht werden, was auf eine geringe metabolische Aktivität im Citrat-Zyklus hinweist. Möglicherweise dient der erste Teil des Citrat-Zyklus nur der Einführung von Aminosäuren als Kohlen- und Stickstoffquelle in den Metabolismus. Unter anaeroben Bedingungen wird die Glucose in der Glycolyse und der gemischten Säuregärung zu Lactat und Ethanol umgesetzt. Hohe spezifische Enzymaktivitäten der Lactat- und Alkohol-Dehydrogenase konnten nachgewiesen werden. Die Energie in Form von ATP wird auch in dieser Phase des Wachstums durch Substratkettenphosphorylierung generiert. Bacillus subtilis 168 (B. subtilis 168) ist ein grampositives apathogenes Bakterium, das durch die Zugabe von Pyruvat auch zum Wachstum unter sauerstofffreien Bedingungen befähigt ist. Es exprimiert Enzyme der 2,3-Butandiol- und Lactatfermentation. In der hier vorliegenden Arbeit wurden die enzymkatalytischen Eigenschaften von Enzymen des Intermediär- und Fermentationsstoffwechsels untersucht. In der logarithmischen Wachstumsphase wird die Glucose über die Glycolyse verstoffwechselt. Wie bei S. aureus COL ist der Eintritt des Glucose-6-phosphates in den Pentose-Phosphat-Weg aufgrund einer höheren spezifischen Enzymaktivität der Glucose-6-phosphat-Isomerase limitiert. Die Energie in Form von ATP wird auch hier hauptsächlich über Substratkettenphosphorylierungsreaktionen generiert. Die Bedeutung der Lactat-Dehydrogenase-Aktivität unter aeroben Bedingungen ist noch nicht eindeutig geklärt, jedoch kann davon ausgegangen werden, dass auch hier ein Teil des Pyruvates zur Regeneration von NAD+ durch die Lactat-Dehydrogenase umgesetzt wird. Unter anaeroben Bedingungen wurden hohe Lactat-Dehydrogenasen-Aktivitäten gemessen. Außerdem wird die Glucose zur Regeneration von NAD+ zu D-2,3-Butandiol fermentiert. Zusammenfassend ist zu sagen, dass enzymologische Untersuchungen und die Erforschung der spezifischen Enzymaktivitäten unter bestimmten Bedingungen ein gutes Hilfsmittel für metabolische Studien ist und diese gut mit vorhandenen Proteom- und Metabolomdaten verglichen werden können. Enzymanalysen sind nicht einfach handhabbar, bieten aber die Möglichkeit, einen Blick in die Physiologie von Mikroorganismen zu werfen. Für ein allumfassendes Verständnis ist es wichtig, Enzymaktivitäten zu untersuchen.
Esterasen und Lipasen finden große Anwendung für die organische Synthese, da sie ein breites Substratspektrum besitzen, in organischen Lösungsmitteln oftmals stabil sind und hohe Enantioselektivitäten auch gegenüber nicht-natürlichen Substraten erreichen können. Die Schweineleberesterase (PLE) ist die bedeutenste Esterase für die Feinchemie. Für die biotechnologische Anwendung ist jedoch der Extrakt aus Schweinelebergeweben, aufgrund des tierischen Ursprungs und der Heterogenität (Vorkommen von verschiedenen Isoenzymen), eher ungeeignet. In dieser Arbeit wird die erfolgreiche rekombinante Expression der PLE in E. coli, die Optimierung der Kultivierung und die Etablierung eines Fermentationsprozesses beschrieben. Weitere Isoenzyme wurden ebenfalls identifiziert, charakterisiert und biokatalytische Umsetzungen von pharmazeutisch relevanten Substraten, wobei neben den PLE-Varianten auch Enzyme aus dem Metagenom verwendet wurden, durchgeführt.
Die at-line Expressionsanalyse von Bioprozess-relevanten Markergenen auf der Grundlage von elektrischen Biochip-Verfahren ist eine viel versprechende Strategie für eine prozessbegleitende Beurteilung der Zellphysiologie des Produktionswirtes. Eine derartige direkte Methode für die Bestimmung des physiologischen Status würde zu einer umfassenderen Überwachung und Kontrolle von industriellen Fermentationsprozessen beitragen. Die Expressionsanalyse der Markergene mit den verwendeten elektrischen Biochips beruht auf dem Nachweis der entsprechenden mRNA über eine Sandwich-Hybridisierung und der elektrochemischen Detektion der Hybride. Hierbei sind sowohl Bead-basierte als auch Array-basierte Formate möglich. Der Bead-basierte mRNA-Nachweis nutzt paramagnetische Partikel (Beads) für die Immobilisierung von Gen-spezifischen Fängersonden. Während der Hybridisierung wird die nachzuweisende mRNA auf den Beads gebunden. Gleichzeitig hybridisiert eine Detektionssonde in einem anderen Bereich der mRNA und ermöglicht so die Markierung mit einem Enzym. Dieses setzt para-Aminophenol (pAP) frei, das an den Elektroden des Biochips über zyklische Oxidations- und Reduktionsprozesse (Redox-Recycling) amperometrisch detektiert wird. Der resultierende elektrische Strom dient als Maß für die mRNA-Menge in der Probe. Die Array-basierte mRNA-Detektion nutzt elektrische Biochips mit 16 individuell auslesbaren Elektrodenpositionen. In diesem Format werden die Fängersonden direkt auf der Elektrodenoberfläche immobilisiert. Durch die Hybridisierung wird die nachzuweisende mRNA auf den jeweiligen Elektrodenpositionen gebunden. Die Detektion erfolgt positionsspezifisch über das Enzym-kontrollierte Redox-Recycling von pAP. Der Fokus der vorliegenden Arbeit lag vor allem auf der Verkürzung, Optimierung und Automation der Bead-basierten mRNA-Detektion. Durch erste Optimierungen einzelner Protokollschritte der Bead-basierten Sandwich-Hybridisierung konnte eine Verkürzung des Protokolls von ursprünglich 4 h auf unter 3 h erzielt werden. Der Übergang zu einer Sandwich-Hybridisierung in Lösung führte vor allem zu einer verbesserten Handhabbarkeit und Reproduzierbarkeit des Protokolls. Die Neuanordnung der Sondenbindestellen auf der Ziel-mRNA und die Einführung einer zweiten Detektionssonde resultierten in signifikanten Steigerungen der Hybridisierungssignale. Dies ermöglichte eine Verkürzung der Detektionszeit auf ca. 75 min. Durch weitere Optimierungen einzelner Aspekte des Protokolls konnte schließlich eine mRNA-Detektionszeit von ca. 45 min realisiert werden. Somit wurde das Protokoll für die Bead-basierte mRNA-Detektion mit dem elektrischen Biochip, ausgehend von isolierter Gesamt-RNA, von ursprünglich 4 h auf 45 min verkürzt. Gleichzeitig konnte die Sensitivität des Protokolls um das etwa Fünffache gesteigert werden. Die Automatisierung mithilfe eines Pipettierroboters erlaubte eine parallele Bearbeitung und die automatische, sequentielle Detektion von 8 Proben innerhalb von ca. 1 h. Weiterhin wurde die Array-basierte mRNA-Detektion etabliert und teilweise optimiert. Dies ermöglichte eine parallele, elektrochemische Detektion von derzeit 4 verschiedenen mRNAs in einer Probe isolierter Gesamt-RNA innerhalb von 20 min. Allerdings sind vor der automatischen Messung noch zusätzliche Schritte für die manuelle Bearbeitung der RNA-Proben (ca. 25 min) erforderlich. Die Anwendbarkeit der entwickelten Protokolle wurde jeweils am Beispiel von ausgewählten Markergenen des industriell bedeutsamen Wirtes Bacillus licheniformis getestet. Die mithilfe der elektrischen Biochip gemessenen Expressionsprofile der Markergene korrelierten mit den mittels real-time RT-PCR bestimmten mRNA-Mengen. Somit konnte im Rahmen der vorliegenden Dissertation die Grundlage für eine Bioprozess-begleitende mRNA-Analytik, basierend auf elektrischen Biochips, geschaffen werden.