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Als Teil der TRP-Ionenkanalfamilie handelt es sich bei dem TRPV4 um einen nicht selektiven Kationenkanal mit einer höheren Spezifität gegenüber Kalziumionen im Ver-gleich zu anderen Kationen. Dieser Kanal ist bereits in einer Vielzahl von Geweben mit unterschiedlichen Funktionen beschrieben worden, über seine genaue Funktion in der quergestreiften Muskulatur ist jedoch bisher wenig bekannt. Untersuchungen an Dystrophin-defizienten-Mausmuskelfasern – einem Modell für die Muskeldystrophie vom Typ Duchenne – zeigten einen erhöhten intrazellulären Kalzi-umgehalt auf, der für die pathogenetischen Veränderungen wie Muskelzellnekrosen und verstärkter Fibrosierung im Rahmen dieser Erkrankung verantwortlich gemacht wird. Durch seine hohe Ionenselektivität und dadurch bedingte Einflussnahme auf die Kalzi-umhomöostase ist eine Beteiligung des TRPV4 in diesem Zusammenhang denkbar. Pritshow et. al. konnten zudem zeigen, dass der TRPV4 Kanal in quergestreifter Musku-latur eines Wildtyp-Mausmodells unter gezielter Stimulation positiven Einfluss auf die maximale Kraftentwicklung und Ermüdungserscheinungen nimmt. Auf Basis dieser Erkenntnisse sind in der vorliegenden Arbeit elektrophysiologische Untersuchungen des TRPV4 Kanals mit den spezifischen Kanalaktivatoren 4α-PDD und GSK1016790A an isolierten TRPV4 Wildtyp-und Knockout-Skelettmuskelfasern der Maus durchgeführt worden. Untersuchungsgegenstand waren dabei mittels Kalium-chlorid induzierte Kalziumtransienten, die sich unter dem Einfluss der TRPV4 Kanalak-tivität veränderten. Die Ergebnisse zeigten, dass 4α-PDD in Wildtyp-Skelettmuskelfasern zu einer höheren Offenheitswahrscheinlichkeit des TRPV4 und damit auch zu einem vermehrten Ein-strom an Kalziumionen, erkennbar am langsameren Abklingen des Transienten, führt. Im Gegensatz dazu führte die Stimulation mit 4α-PDD in TRPV4 Knockout-Skelettmuskelfasern zu einem schnelleren Abklingen des Transienten im Vergleich zur Kontrolle – ein Effekt, der bis dato in der Literatur nicht erklärt werden kann. Des Wei-teren erreichten die induzierten Kalziumtransienten schneller das Maximum, Grund hierfür könnte eine mögliche Gegenregulation anderer TRP-Kanäle sein. Die Anwendung des selektiven TRPV4 Kanalaktivators GSK1016790A ergab keine signifikanten Veränderungen im Vergleich zur unstimulierten Situation. Da es bisher keine Daten zur Verwendung von GSK1016790A im Zusammenhang mit Skelettmus-kelfasern gibt, die zum Vergleich herangezogen werden konnten, sind Aussage-und Interpretationsmöglichkeiten bezüglich Validität und Reliabilität begrenzt. Die Einflussnahme des TRPV4 auf die gemessenen Kalziumtransienten und der dadurch erzielten Modulation der Kalziumhomöostase in isolierten Skelettmuskelfasern ist durch die Ergebnisse belegt. Welche Interventionsmöglichkeiten sich damit bezüglich der Duchenne Muskeldystrophie ergeben, sollte Gegenstand weiterer Untersuchungen sein.
Sowohl für die Leistungsausprägung als auch die Gesundheit landwirtschaftlicher Nutztiere ist die relative Verteilung von Skelettmuskel- und Fettgewebe ein entscheidender Faktor. Entwicklungs- und Wachstumsprozesse werden neben gewebespezifischen Faktoren auch durch Wechselwirkungen zwischen beiden Geweben beeinflusst. Beim Menschen sind das Auftreten von Adipositas und die damit verbundene geringere Ausprägung der Muskulatur und Veränderung metabolischer Prozesse entscheidende Risikofaktoren für die Entwicklung von Krankheiten. Die Aufklärung der Regulation der Entwicklung von Muskel- und Fettgewebe ist daher ein wichtiges Anliegen der Nutztierforschung, aber auch der humanmedizinischen Forschung. Adiponectin und Leptin gehören zu den am besten untersuchten Adipokinen, wobei der Fokus hauptsächlich auf der Regulation der Fettsäureoxidation, des Glucosestoffwechsels und der Insulinsensitivität lag und liegt. Beide Faktoren können sowohl von Fett- als auch Skelettmuskelgewebe synthetisiert und sezerniert werden und somit physiologische Prozesse in beiden Geweben beeinflussen. In wenigen Studien, hauptsächlich durchgeführt am Muskel von Nagern, wurden unterschiedliche Ergebnisse gezeigt, die auf widersprüchliche Effekte (positiv, negativ oder nicht nachweisbar) der Adipokine auf das Muskelwachstum hinweisen. Die Wirkung beider Adipokine auf den Proteinstoffwechsel porciner Muskelzellen wurde bisher noch nicht beschrieben. Ebenso gibt es bislang keinen Nachweis für das Vorhandensein der spezifischen Rezeptorproteine für Adiponectin (ADIPOR1, ADIPOR2) und Leptin (LEPR) im Skelettmuskel des Schweins. Das Ziel der Untersuchungen dieser Arbeit bestand in der Erforschung zellulärer und molekularer Prozesse der Regulation des Wachstums porciner Skelettmuskelzellen durch Adiponectin und Leptin. Es sollten erstmals 1) die direkte Wirkung beider Adipokine auf das Wachstum und die Differenzierung porciner Skelettmuskelzellkulturen und 2) die zugrundeliegenden Regulationsmechanismen unter Beteiligung wichtiger Signalwege des Energie- und Proteinstoffwechsels beschrieben werden. Aufgrund der Genexpression der spezifischen Rezeptoren für Adiponectin kann der porcine Skelettmuskel als Adiponectin-sensitives Gewebe betrachtet werden. Bei den Untersuchungen zeigte sich, dass die Wirkungen von Adiponectin und Leptin auf proliferierende porcine Skelettmuskelzellen von den vorherrschenden Kulturbedingungen abhängig sind. Die Behandlung mit Adiponectin bei der Verwendung von serumfreiem aber Wachstumsfaktor-supplementiertem Medium resultierte in einer verminderten DNA-Syntheserate, welche auf Wechselwirkungen zwischen dem Adipokin und dem im Medium vorhandenen Wachstumsfaktor bFGF zurückzuführen war. Für Leptin konnte unter diesen Bedingungen nur eine kurzzeitige Hemmung der Proliferation porciner Muskelzellen beobachtet werden. Des Weiteren wurde die Wirkung von Adiponectin, aber nicht Leptin, auf die Prolfiferation porciner Myoblasten durch Ölsäure moduliert. Weiterhin zeigte sich, dass die Vitalität adipokinbehandelter Zellen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen unter serumfreien, wachstumsfaktor-supplementierten Bedingungen leicht verbessert war. Unter Niedrigserumbedingungen führten beide Adipokine zu einer gesteigerten DNA-Syntheserate, welche bei Leptin mit einer Verminderung der Zellzahl einherging. Im Gegensatz zu serumfreien Kulturbedingungen, unter denen die vorhandenen Wachstumsfaktoren die Zellen offensichtlich vor einem negativen Einfluss der Adipokine schützen, wurde bei der Verwendung von Medium mit niedrigem Serumgehalt eine verminderte Zellvitalität adipokinbehandelter Zellen beobachtet. Ein Einfluss von Adiponectin und Leptin auf den Proteinstoffwechsel differenzierender Kulturen konnte unter den verwendeten Kulturbedingungen nicht gezeigt werden. Weiterhin erhöhten Adiponectin und Leptin zwar den Differenzierungsgrad porciner Myoblasten in Form eines erhöhten Fusionsgrades, aber nicht bezüglich der Aktivität des Markerenzyms Creatinkinase. Die Untersuchungen verschiedener intrazellulärer Schlüsselsignalmoleküle zeigen erste Hinweise auf eine Beteiligung des p44/42 MAPK Signalweges an der Vermittlung der Adipokineffekte, obwohl dessen Aktivierung möglicherweise zu kurz ist, um eine langfristige stimulierende Wirkung auf downstream targets und somit auf physiologische Prozesse zu haben. Die Ergebnisse dieser Arbeit leisten zum einen einen wichtigen Beitrag zur Aufklärung der Regulation von Wachstums- und Entwicklungsprozessen des Muskel- und Fettgewebes durch wechselseitige Beeinflussung. Zum anderen sind die beim Schwein gewonnenen Erkenntnisse aufgrund der dem Menschen ähnlichen Physiologie durchaus auf die Humanforschung übertragbar und somit ebenfalls für die Erforschung adipositas-assoziierter Erkrankungen beim Menschen relevant.
Der TRPC6 Kanal ist Teil einer Familie nicht selektiver Kationenkanäle, den Transient-Receptor-Potential-Canonical Kanälen. Der TRPC6 Kanal ist durch Diacylglycerol (DAG), ein Spaltprodukt der Phospholipase C, aktivierbar. Durch den Kinaseinhibitor ML-9 kann er inaktiviert werden. In der Skelettmuskulatur von Wildtyp-Mäusen und Dystrophin-defizienten mdx-Mäusen wird der TRPC6 Kanal stark exprimiert. Eine Beteiligung des TRPC6-Kanals am Store-Operated-Calcium-Entry (SOCE) wurde ebenso diskutiert wie ein Vorliegen als Rezeptor-gesteuerter Ionenkanal (ROC). In dieser Arbeit wurde der Kalziumeinstrom des Sarkolemms mit Hilfe der Mangan-Quench-Technik an Mäuseskelettmuskelzellen untersucht. Der TRPC6 Kanal wurde mittels ML-9 inhibiert mit dem Ziel einen möglichen Einfluss auf den Kalziumeinstrom in die Skelettmuskelzellen der Mäuse zu untersuchen. Dies geschah sowohl in Ruhe als auch nach Entleerung der intrazellulären Kalziumspeicher. Es konnte nachgewiesen werden, dass der TRPC6 Kanal nicht zum Ruhekalziumeinstrom in der Skelettmuskulatur beiträgt. Er ist dort zwar hoch exprimiert, jedoch unter Ruhebedingungen nicht aktiv. Da der Kanal durch DAG und auch Hyperforin aktivierbar ist, spricht dies für ein Vorliegen als Rezeptor-gesteuerter Kanal in Skelettmuskelzellen. Durch die Anwendung des SERCA-Inhibitors Thapsigargin konnte der SOCE sowohl in Wildtyp- als auch mdx-Skelettmuskelzellen dargestellt werden. Nach Vorinkubation mit Thapsigargin zeigte sich jeweils ca. eine Verdoppelung der Quenchraten im Vergleich zu den Ruhebedingungen. Auch nach Entleerung der Kalziumspeicher blieb der TRPC6 Kanal inaktiv. Der TRPC6-Kanal ist am SOCE-Mechanismus, zumindest in Mäuseskelettmuskelzellen, nicht beteiligt. Eine Beteiligung anderer Mitglieder der TRPC-Familie bleibt jedoch denkbar. Für eine mögliche Beteiligung des Kanals am pathologisch erhöhten Kalziumeinstrom des Sarkolemms, wie sie im Rahmen der Pathogenese der Duchenne-Muskeldystrophie diskutiert wird, konnten in dieser Arbeit keine Hinweise gefunden werden. Hinsichtlich der getesteten Parameter unterschieden sich die Muskelfasern von Wildtyp-Mäusen nicht von den Zellen Dystrophin-defizienter mdx-Mäuse.
Soja gehört aufgrund seines hohen Proteingehaltes seit Jahrtausenden zu den Grundnahrungsmitteln des Menschen. Daneben wird Soja sowohl in Europa als auch in Asien als Ergänzungsfutter in der Tierernährung verwendet. Die enthaltenen Isoflavone verursachen in vivo möglicherweise positive, systemische Effekte, was aus erhöhten Geburtsgewichten sowie dem verbesserten postnatalen Wachstum von Ferkeln abgeleitet wurde. In weiteren Studien, in denen nach Fütterung im Blut der Tiere eine Daidzeinmenge von ca. 1 µmol/l zirkulierte, wurde das Wachstum der Ferkel nicht beeinflusst. Ferner zeigten die Isoflavone Genistein und Daidzein in vitro häufig ambivalente Effekte auf das Wachstum von Maus oder Ratte abgeleiteten Muskelzellkulturen in Abhängigkeit von der Dosis und Einwirkzeit. Die direkte Wirkung der Isoflavone auf das Wachstum und die Differenzierung von Skelettmuskelzellen wurde bisher für das Hausschwein nicht untersucht, obgleich es über sojahaltiges Futter einer kontinuierlichen Zufuhr von Isoflavonen ausgesetzt und eine Beeinflussung des Wachstums aufgrund der zuvor genannten Studien denkbar ist. Zudem wurde bisher die Expression der Östrogenrezeptoren, als mögliche Bindungsorte für Isoflavone, weder auf Protein- noch auf mRNA-Ebene im Skelettmuskel des Schweins beschrieben. Die vorliegende Arbeit verfolgte daher das Ziel, ein in vitro-Modell in Form einer Satellitenzellkultur aus dem M. semimembranosus für die Untersuchung des Muskelwachstums beim Hausschwein zu etablieren. Erstmals sollte daran die direkte Wirkung der Isoflavone Genistein und Daidzein in physiologischen sowie nicht-physiologischen Konzentrationen auf Basisprozesse des exponentiellen Wachstums und der Differenzierung unter Berücksichtigung möglicher wachstumsfaktorvermittelter Regulations¬mechanismen beschrieben werden. Die Isoflavonwirkung auf die DNA-Synthese der Muskelzellen wurde im Vergleich mit den Östrogenen 17beta-Östradiol und Östron sowie in weiteren Versuchen in Kombination mit den Wachstumsfaktoren IGF-I und EGF betrachtet. Für die Bestimmung der Einflüsse von Genistein und Daidzein auf die Proliferation porciner Skelettmuskelzellen wurden die DNA-Syntheserate, der Zellzyklus, Zelltod sowie DNA-Schäden und deren Reparatur nach Entzug der Isoflavone gemessen. Um den Einfluss der genutzten Isoflavone und 17beta-Östradiol auf die Differenzierung der Skelettmuskelzellen zu untersuchen, erfolgte die Bestimmung des Fusionsgrades sowie die Messung der Creatinkinase-Aktivität. Zusätzlich wurde der Proteinmetabolismus als Einbau bzw. Freisetzung von [3H]-Phenylalanin betrachtet. Ferner erfolgte die Untersuchung der Expression der Östrogen- und Tyrosinkinaserezeptoren, EGF-R und IGF-1R, mithilfe der RT-PCR, des Immunoblots und der Immunhistochemie während der Proliferations- und/oder der Differenzierungsphase. Aus dem porcinen M. semimembranosus wurde erfolgreich ein Satellitenzellpool etabliert und erstmals die Expression der Östrogenrezeptoren alpha und beta im porcinen Skelettmuskel und dem davon abgeleiteten Zellpool gezeigt. Die Ergebnisse lassen weiterhin negative Wirkungen der getesteten Isoflavone auf das Muskelzellwachstum in Ferkeln vor allem ab zirkulierenden Serumkonzentrationen von > 1 µmol/l, jedoch keine Effekte der Östrogene auf die Zellproliferation erwarten. IGF-I und EGF erwiesen sich als wirkungsvolle Stimulatoren des porcinen Muskelzellwachstums, was für EGF in der Zellkultur mit serum- und wachstumsfaktorfreiem Medium erstmals gezeigt wurde. Darüber hinaus wirken IGF-I und EGF scheinbar den toxischen Effekten hoher Isoflavondosen entgegen. Dennoch erniedrigte Genistein (100 µmol/l) deutlich die wachstumsfaktorvermittelte DNA-Synthese in porcinen Satellitenzellkulturen. Interessanterweise war unter dem Einfluss nahrungstypischer Daidzeinkonzentrationen (1 und 10 µmol/l) in Kombination mit IGF-I eine signifikante Erhöhung der Zellzahl zu beobachten. In der differenzierenden porcinen Muskelzellkultur verringerten sowohl Östrogene als auch Isoflavone dosisabhängig die Proteinabbaurate. Obgleich Östrogene allgemein beim Schwein nicht als Förderer des Muskelwachstums gelten, haben Östrogene und nahrungstypische Isoflavonkonzentrationen das Potential, den Protein¬metabolismus des porcinen Skelettmuskels zu beeinflussen. Auf der anderen Seite führten hohe Isoflavonkonzentrationen (20; 100 µmol/l) zu einer Abnahme der Proteinmenge und wirkten als Toxine auf die differenzierenden Skelettmuskelzellen. Da das Schwein eine dem Menschen ähnliche Physiologie und einen für die Isoflavone vergleichbaren Metabolismus besitzt, sind die Ergebnisse dieser Arbeit nicht nur für die Tierernährung bedeutsam, sondern ebenso für die Beurteilung der Auswirkungen sojabasierter Babynahrung auf Entwicklungsprozesse beim menschlichen Neugeborenen, was in zukünftigen Untersuchungen zu den Wirkungen der Sojaisoflavone berücksichtigt werden sollte.