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MRP4 (multi drug resistance protein 4) ist ein Transporter aus der ATP-binding-cassette Familie (ABCC4) und verfügt über ein sehr breites Substratspektrum. Dieses beinhaltet Xenobiotika u.a. Cephalosporine, Diuretika und Zytostatika sowie endogene Substanzen wie Gallensäuren, Steroide, Eicosanoide und auch Nukleotide, wie den second messenger zyklisches AMP (cAMP). MRP4 wird in einer Vielzahl von Geweben exprimiert u.a. in der Niere, in der Leber, im Gehirn, in Blutzellen und in vaskulären glatten Muskelzellen. Über die Regulation von MRP4 ist weniger bekannt, daher war es das Ziel dieser Arbeit die transkriptionelle Regulation von MRP4 näher zu betrachten. Zur Bearbeitung dieser Zielstellung wurde die Promoter-Region des ABCC4/MRP4-Gens in ein Luciferase-Reporter-System kloniert. Anschließend wurde in Zellversuchen mit HeLa und HepG2-Zellen der Einfluss verschiedener Substanzen auf die Transkription von MRP4 untersucht. Zusätzlich wurde mittels Western Blot und quantitativer RealTime-PCR die Expression von MRP4 auf Protein- und mRNA-Ebene betrachtet. Keine bzw. nur geringe Effekte auf die Promoteraktivität wurden in den erwähnten Zelllinien u.a. nach Behandlung mit Glucocorticoiden, Zytokinen, cGMP, Nrf2-/AhR-Aktivatoren und unter dem Einfluss verschiedener Glucose-Konzentrationen beobachtet. Dagegen zeigte sich ein signifikanter Einfluss des zellulären cAMP-Spiegels. MRP4 vermittelt physiologisch einen Auswärtstransport von cAMP. Bei Inkubation mit dem membranpermeablen cAMP-Analogon Dibutyryl-cAMP zeigte sich eine signifikante Steigerung der Promoter-Aktivität von MRP4. Auch auf mRNA- und Protein-Ebene konnte eine signifikante Steigerung der Expression nach Behandlung mit cAMP detektiert werden. Durch Ko-Inkubation mit Inhibitoren der Proteinkinase A (PKA) und der Extracellular signal-regulated kinases 1/2 (Erk1/2) konnte weiterhin gezeigt werden, dass dieser Effekt nicht über die PKA, dem häufigsten Effektor von cAMP, sondern über Erk1/2 vermittelt wird. Die Induktion von MRP4 durch cAMP, welches selbst Substrat des Transporters ist, könnte eine Art Feedback-Mechanismus darstellen und darauf hinweisen, dass MRP4 eine größere Rolle im zellulären cAMP-Stoffwechsel zukommt, als bisher angenommen. Der zelluläre Export stellt neben dem Abbau von cAMP durch Phosphodiesterasen einen alternativen Mechanismus der Signalregulation dar, der entweder nur als Ventilmechanismus bei hohen cAMP-Spiegeln oder Zelltyp- und Kompartiment-abhängig möglicherweise auch als hauptsächlicher Eliminationsweg dient. MRP4 könnte somit neben der Inhibition der Phosphodiesterasen einen weiteren Angriffspunkt zur Erhöhung zellulärer cAMP-Spiegel z.B. im Rahmen der Therapie von Erkrankungen wie der pulmonalen Hypertonie darstellen.
Eine Thrombose ist eine Gefäßerkrankung, bei der eine lokalisierte, intravasale Blutgerinnung zur Bildung eines Thrombus in einem Gefäß führt. Die Aktivierung der
Blutgerinnungskaskade und damit der Gerinnungsfaktoren führt zu einer Bildung sowie Quervernetzung von Fibrin und so zur Entstehung eines Thrombus. Dieser wird
physiologisch über die Fibrinolyse abgebaut. Die Serinprotease PAI-1 inhibiert diese und wirkt somit prothrombotisch. Jüngste Studien haben gezeigt, dass S1P als Schlüsselmolekül des Immunsystems und des Metabolismus auch das Gerinnungssystem beeinflusst und in einer wechselseitigen Beziehung mit dem Gerinnungsfaktor Thrombin und seinen PARs steht. Die S1P-Konzentration im Körper korreliert dabei eng mit dem BMI. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Wirkung des Signallipids S1P auf die PAI-1-Expression von Fettzellen und damit die Stellung der Adipozyten bei S1P-vermittelten thrombotischen Ereignissen in vitro. Weiterhin wurde
erstmalig die Wechselwirkung von Thrombin und S1P bei der Produktion von PAI-1 in Fettzellen untersucht. Hierfür wurden 3T3-L1-Fibroblasten in Adipozyten differenziert
und mit S1P stimuliert. Es zeigte sich eine konzentrationsabhängige Steigerung der PAI-1-mRNA. Diese Ergebnisse wurden ebenfalls von anderen Arbeitsgruppen
bestätigt. Der S1P-Effekt ließ sich auch mittels Western Blot-Analyse auf Proteinebene darstellen. Dabei zeigte sich eine starke Steigerung der PAI-1-Expression und
Sekretion von 3T3-L1-Zellen. S1PR-2- und S1PR3-Inhibitoren senkten den S1Pvermittelten Anstieg, sodass S1P über eine S1PR-2- und, bisher in der Literatur noch
nicht beschrieben, auch über eine S1PR-3-Aktivierung einen prothrombotischen Einfluss ausübt. Weiterhin konnte nach Stimulation mit S1P erstmalig eine Expressionssteigerung von PAR-1 und damit eine Wechselwirkung zwischen dem Signalweg von Thrombin und S1P in Adipozyten beobachtet werden. Es wurde die
Hypothese aufgestellt, dass Thrombin über den PAR-1 die Aktivität der Enzyme des S1P-Metabolismus steigert und so über eine endogene S1P-Produktion zu einer zusätzlichen Steigerung von PAI-1 führt. Diese konnte bisher noch nicht bestätigt werden, da lediglich eine geringe, jedoch nicht signifikante Steigerung von PAI-1 nach Thrombin-Stimulation beobachtet werden konnte. Somit ist das Fettgewebe ein wichtiges Bindeglied zwischen dem inflammatorischen Lipid S1P sowie dem Enzym PAI-1 und damit als Gewebe ein bisher stark unterschätzter Einflussfaktor bei der Entstehung und Aufrechterhaltung thrombotischer Ereignisse.
Die Sicherheit und Wirksamkeit der Arzneimitteltherapie wird maßgeblich von Transportproteinen beeinflusst. Die zelluläre Lokalisation von Transportern hat hierbei wesentlichen Einfluss darauf, ob diese als funktionelle Aufnahme- oder Effluxtransporter fungieren. Für den menschlichen Darm ist die Lokalisation einiger Transporter noch unklar. Ein Beispiel hierfür ist der organic cation transporter (OCT1), welcher für die intestinale Aufnahme zahlreicher kationischer Arzneistoffe, wie beispielsweise Morphin verantwortlich gemacht wird. Bisher gibt es allerdings widersprüchliche Aussagen über die exakte Lokalisation dieses Transporters in der Zellmembran von Enterozyten. Folglich ist die tatsächliche Bedeutung dieses Proteins für die Absorption von Arzneistoffen bis heute ungeklärt.
Daher war das Ziel dieser Arbeit die Expression, Lokalisation und Funktion von OCT1 in Enterozyten anhand verschiedener labortechnischer Methoden näher zu charakterisieren.
Mittels Immunfluoreszenzfärbung wurde versucht die Lokalisation von OCT1 im Zellmodell zu bestimmen. Ebenfalls im Zellmodell erfolgte die Untersuchung des vektoriellen Transportes von Morphin mittels Transwellassay. Diese, sowie entsprechende Analysen vitalen intestinalen Gewebes in der Ussing-Kammer, wurden genutzt, um indirekt Rückschlüsse auf die Transporterlokalisation zu ziehen.
Trotz eindeutiger und der Hypothese entsprechender Expression und Funktion in MDCKII-OCT1/P-gp-Zellen, konnten im Rahmen dieser Arbeit keine eindeutigen Ergebnisse bezüglich der Lokalisation von OCT1 in Caco-2-Zellen generiert werden.
Caco-2-Zellen sollten als Zellmodell für Enterozyten, insbesondere hinsichtlich der Charakterisierung von OCT1, neu bewertet werden, da aktuellen Erkenntnissen entsprechend möglicherweise keine signifikante Expression von OCT1 in diesen Zellen vorliegt. Auch das genutzte OCT1-Modellsubstrat Morphin ist möglicherweise problematisch. Es ist darauf hinzuweisen, dass es sich bei den vorliegenden Daten aufgrund der geringen Versuchszahl nur um vorläufige Ergebnisse handeln kann, welche in zukünftigen Arbeiten verifiziert werden sollten.
Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass die vorliegende Arbeit zwar keine neuen Erkenntnisse bezüglich der Lokalisation von OCT1 in Enterozyten erbringen konnte, jedoch die Bedeutung eines kritischen Umgangs mit etablierten Methoden und deren Ergebnissen unterstreicht.
Die orale Einnahme stellt für Patienten die einfachste und unkomplizierteste Möglichkeit dar, ein Arzneimittel zu applizieren und ist das angestrebte Ziel der Arzneimittelentwicklung. Dem entgegen stehen jedoch die evolutionär entstandenen Möglichkeiten des Körpers, aufgenommene Fremdstoffe zu inaktivieren und zu eliminieren. Ein Zusammenspiel aus anatomischen Gegebenheiten und den Enzymen des Fremdstoffmetabolismus sorgt dafür, dass ein Teil der oral applizierten Dosis bereits verstoffwechselt wird, bevor er über das arterielle System an den Wirkort gelangen kann (first-pass-Effekt). Als Ort dieses Metabolismus wurde, neben der Leber, auch der Darm identifiziert. Um das Ausmaß des first- pass-Effektes abschätzen zu können, werden Daten über den Gehalt der arzneistoffmetabolisierenden Enzyme in diesen Organen benötigt. Als Methode der Wahl bietet sich dazu die LC-MS/MS an, da mit ihr verschiedene Enzyme in einem analytischen Lauf bestimmt werden können und sie sich durch eine hohe Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und Spezifität auszeichnet.
Mit der vorliegenden Arbeit wurde das analytische Spektrum der bisher publizierten Methoden zur Bestimmung von CYP- und UGT-Enzymen erweitert. Mit der neuen Methode können nun zwei Carboxylesterasen, 17 CYP-Enzyme und fünf UGT-Enzyme quantifiziert werden. Weiterhin wurde die Methode anhand von Richtlinien für bioanalytische Methoden umfassend validiert. Durch die Verwendung von rekombinant hergestellten arzneistoffmetabolisierenden Enzymen konnte der gesamte analytische Prozess, von der Probe bis zum Endergebnis, erstmalig umfassend charakterisiert werden. Dabei zeigte sich eine, für einen derart komplexen Prozess bemerkenswerte Präzision von maximal 15,5% Variation nach sechsmaliger Durchführung.
Die entwickelte Methode wurde dann auf gepaarte Proben aus Leber und Jejunum von elf gesunden Organspendern angewendet. Im Jejunum wurden CES1, CES2, CYP2C9, CYP2C18, CYP2C19, CYP2D6, CYP2J2, CYPA4, CYP3A5, CYP4F2, CYP4F12, UGT1A1, UGT1A3, UGT2B7 und UGT2B17 gefunden. In der Leber konnten alle untersuchten Enzyme (CES1, CES2, CYP1A1, CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C18, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP2J2, CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7, CYP4F2, CYPF12, UGT1A1, UGT1A3, UGT2B7, UGT2B15 und UGT2B17), bis auf CYP4A11 nachgewiesen werden. Für einige Enzyme (CES2, CYP2C18, CYP2C19, CYP2J2, CYP3A4, CYP4F2, CYP4F12) wurden im Jejunum Enzymgehalte gemessen, die mit denen in der Leber vergleichbar sind, was noch einmal unterstreicht, dass der Darm auch als klinisch relevanter Ort des Arzneistoffmetabolismus betrachtet werden muss. Auffällig war hier zudem die deutlich höhere Variabilität in den Darmproben, verglichen mit den Leberproben, die ihre Ursache in Umwelteinflüssen oder dem Mikrobiom des Darms haben könnten. Außerdem wurde die Expression der zugehörigen Gene mittels quantitativer real-time PCR untersucht. Hier bestand nur in einigen Fällen eine signifikante Korrelation zwischen Genexpression und Proteingehalt, was für zwischengeschaltete regulatorische Mechanismen spricht.
Weiterhin wurden mit dieser Methode Leberproben einer Kohorte von Patienten mit Krankheitsbildern, die mit einer Einschränkung der Leberfunktion einhergehen, untersucht. Dazu wurden die Patienten nach der verbleibenden Leberfunktion (Child-Pugh-Score) und nach der zugrundeliegenden Erkrankung eingeteilt. Es zeigt sich eine generelle Abnahme des Gehaltes an arzneistoffmetabolisierenden Enzymen mit fortschreitender Verschlechterung der Leberfunktion, wobei sich CYP2E1 als besonders anfällig erwiesen hat und bereits in Child- Pugh-Klasse A signifikant erniedrigt war. Bei den verschiedenen Erkrankungen zeigt sich ein uneinheitliches Bild, die prozentuale Verteilung der Enzyme ist jedoch bei allen Erkrankungen gegenüber den gesunden Kontrollproben verändert.
Über die Regulation der Expression von arzneistoffmetabolisierenden Enzymen ist bisher noch wenig bekannt. Es gibt aber Hinweise aus der Literatur, dass bestimmte nukleäre Rezeptoren an der Regulation der Enzyme beteiligt sein können. Deshalb wurde eine LC-MS/MS-basierte targeted-proteomics-Methode zur Quantifizierung von nukleären Rezeptoren in Darm- und Lebergewebe entwickelt und validiert. Im Gewebe konnten nur AhR und HNF4α nachgewiesen werden, da die Empfindlichkeit des verwendeten experimentellen Ansatzes vermutlich nicht ausreichend ist. Dabei war HNF4α in Darmgewebe deutlich höher exprimiert als AhR. Außerdem wurde die Expression der nukleären Rezeptoren auf Genebene durch quantitative real-time PCR untersucht. Dabei wurde eine höhere Expression von CAR in der Leber gefunden, während PXR in Darm stärker exprimiert wird. Dies entspricht den Erkenntnissen aus der Literatur, nach denen CAR einen regulatorischen Effekt auf arzneistoffmetabolisierende Enzyme in der Leber hat, während dies für PXR in Darm zutrifft. Diese Arbeit kann einen Beitrag zum weitergehenden Verständnis der Regulation von arzneistoffmetabolisierenden Enzymen durch nukleäre Rezeptoren beitragen.
Bei allen diesen Arbeiten gilt es zu beachten, dass das Vorhandensein eines Proteins nicht zwangsläufig mit seiner Aktivität gleichzusetzen ist. Jedoch zeigen zahlreiche Beispiele aus der Literatur, dass sich mit den Daten aus Proteomics-Studien PBPK-Modelle aufstellen lassen, die die in klinischen Studien erhobenen Daten mit beeindruckender Genauigkeit reproduzieren können.
Thrombozyten sind von zentraler Bedeutung sowohl für die Blutstillung als auch für die Regulation von Entzündungsprozessen. Nach der Aktivierung setzen sie proinflammatorische Mediatoren wie Sphingosin-1-Phosphat (S1P) frei. Die spezifischen Mechanismen der S1P-Freisetzung aus Thrombozyten sind jedoch noch weitgehend unbekannt. In der vorliegenden Arbeit konnte anhand eines vesikulären Transportassays bestätigt werden, dass ein ATP-abhängiges Transportsystem für S1P in Thrombozytenmembranen vorliegt. Der ATP-abhängige Transport von fluoreszenzmarkiertem S1P (F-S1P) in inside-out-Membranvesikel von humanen Thrombozyten wurde durch das organische Anion MK571, einen Inhibitor von ABC-Transportern der Multidrug Resistance Protein (MRP)-Subfamilie, gesenkt. Anhand von Transportversuchen mit inside-out-Membranvesikeln von MRP4 (ABCC4)-überexprimierenden Sf9-Insektenzellen und MRP5 (ABCC5)-überexprimierenden V79-Fibroblasten konnten MRP4 und MRP5 als S1P-Transporter identifiziert werden. Die Untersuchung von MRP4-defizienten Mäusen ergab signifikante Abnahmen der S1P-Spiegel im plättchenreichen Plasma dieser Tiere. Die S1P-Spiegel der MRP5-defizienten Männchen glichen dem WT, während die Weibchen nahezu eine Verdopplung des S1P-Gehalts im plättchenarmen Plasma im Vergleich zum Wildtyp zeigten. Die Ergebnisse bei den genetisch veränderten Mäusen lassen vermuten, dass der Transporter MRP4 auch physiologisch an der S1P-Speicherung und -Freisetzung aus Thrombozyten beteiligt ist, während MRP5 die S1P-Plasmaspiegel eher unabhängig von den Thrombozyten zu beeinflussen scheint. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass der MRP4-vermittelte Transport von F-S1P durch Fluvastatin mit einer IC50 von 52 µM und Rosuvastatin mit einer IC50 von 32 µM gehemmt wird. Darauf aufbauend konnte mittels Massenspektrometrie (LC-MS/MS) nachgewiesen werden, dass die Vorinkubation mit Fluvastatin bzw. Rosuvastatin die endogene stimulierte S1P-Freisetzung aus humanen Thrombozyten ex vivo senkt. Diese inhibitorische Wirkung der Statine auf den Transport des proinflammatorischen S1P stellt einen neuen möglichen Mechanismus dar, mit dem die Statine pleiotrope entzündungshemmende Effekte ausüben können. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass MRP4 als S1P-Transporter identifiziert wurde und Statine den MRP4-vermittelten Transport beeinträchtigen.
Das Blasenspasmolytikum Propiverin war aus der Literatur als Induktor von CYP- Enzymen in der Rattenleber bekannt. Die vorliegenden Daten gestatteten keine Aussagen zu den beeinflussten CYP-Subfamilien und zur Dosisabhängigkeit der Induktion. In dieser Studie wurde die Beeinflussung der mikrosomalen Ethylresorufin-0- Deethylase (EROD), Ethoxycumarin-0-Deethylase (ECOD), Pentylresorufin-0- Depentylase (PROD), Diazepam-N-Demethylase (DNDM), Dextromethorphan-0- Demethylase (DXDM), p-Nitrophenolhydroxylase (NPH) und Erythromycin-N- Demethylase (ERDM) in der Leber männlicher Ratten nach Behandlung mit 0,6-60 mg/kg Propiverin über 5 Tage im Vergleich mit den bekannten CYP- Induktoren Phenobarbital, ß-Naphthoflavon und Dexamethason untersucht. Es zeigte sich, dass Propiverin in einer Dosierung bis 2 mg/kg weder die untersuchten Monooxygenaseaktivitäten noch den Gesamt-CYP-Gehalt beeinflusst. Das Induktionsmuster nach der Behandlung mit Propiverin hatte mit einer herausragenden Induktion der PROD (33fach) sowie einer geringeren Erhöhung der EROD, ECOD, DNDM und ERDM den Charakter einer Phenobarbital-Typ-lnduktion. Die vermehrte CYP2B-Expression nach Gabe von 60 mg/kg Propiverin konnte mittels Western Blot nachgewiesen werden. Die DXDM als Maß für die CYP2D-Aktivität änderte sich durch Propiverin- behandlung im untersuchten Dosisbereich nicht. Zusätzlich zeigten Propiverin und Despropylpropiverin in vitro eine Hemmung der PROD (halbmaximale Hemmkonzentration IC50 ca. 0,5 µmol/l Propiverin); die EROD und ERDM blieben in vitro unbeeinflusst. Zur Induktion der untersuchten Enzyme kam es erst nach Gabe des Vielfachen der empfohlenen Menge für den therapeutischen Gebrauch.
Untersuchungen zum Mechanismus der oralen Absorption von Trospiumchlorid an gesunden Probanden
(2017)
In Deutschland leiden ca. 15 % der über 40-jährigen am Syndrom der überaktiven Blase (overactive bladder, OAB), welches durch plötzlich auftretenden, nicht aufhaltbaren Harndrang definiert wird. Trospiumchlorid (TC) ist ein kationischer, wasserlöslicher, antimuskarinerger Arzneistoff mit einer stark variablen Bioverfügbarkeit von ca. 10 %, der häufig zur Behandlung der OAB eingesetzt wird. Aufgrund seiner quartären Ammoniumstruktur überwindet er die Hirnschranke nicht und löst somit keine kognitiven Nebenwirkungen aus, was einen entscheidenden Vorteil gegenüber anderen Anticholinergika darstellt. Zielsetzung dieser Arbeit war die Optimierung seines schlechten oralen Absorptionsverhaltens.
TC überwindet die Enterozytenmembran als Substrat des Efflux-Carriers P-glycoprotein (P-gp) und des Aufnahmetransporters organic cation transporter 1 (OCT1). Durch die geringe Expression von P-gp in den proximalen Dünndarmabschnitten und einer gleichmäßigen Expression von OCT1 im gesamten Darm vermuteten wir ein „Absorptionsfenster“ für TC in diesem proximalen Dünndarmareal.
In zwei nach ähnlichem Design durchgeführten kontrollierten, randomisierten, cross-over Studien der Phase I versuchten wir dieses vermutete „Absorptionsfenster“ mit der Simulation gastroretentiver Darreichungsformen für TC gezielt zu bedienen. Das TC sollte dabei mit Hilfe der Antrum-Motilität über einen längeren Zeitraum, in portionierten Mengen aus dem Magen in den Dünndarm befördert werden. In der offenen, vier-armigen GI-Studie (gastric infusion) benutzten wir dafür eine Magensonde über die 30 mg in Wasser gelöstes TC in einem Zeitraum von 6 h in den Magen infundiert wurden (GI). Im Vergleich dazu stand die orale Einnahme einer 30 mg schnell freisetzenden TC-Filmtablette (immediate release, IR). Die Applikationen erfolgten jeweils im nüchternen Zustand (fasted) und nach dem Verzehr einer standardisierten fettreichen Mahlzeit (FDA; fed).
In der NaHCO3-Studie (Natriumbikarbonat) simulierten wir unter Ausnutzung der verzögerten Magenentleerung nach Verzehr einer fettreichen Mahlzeit eine physiologische Form der gastroretentiven Darreichung von TC. Durch Zugabe einer NaHCO3-Kapsel zu TC (IR-TC + NaHCO3) als Brausesubstanz in Kontakt mit Magensäure, sollte TC gleichmäßig mit dem Mageninhalt vermischt werden, um interindividuelle Unterschiede in der TC-Bioverfügbarkeit zu verringern. Im Vergleich standen die intravenöse Gabe von TC (IV-TC) und die Komedikation eines NaHCO3-Placebos (IR-TC + NaHCO3-Placebo).
Die geplanten Ansätze zur Verbesserung des Absorptionsverhaltens von TC gelangen in beiden Studien leider nicht.
Mit Hilfe von pharmakokinetischem modelling der aus der GI-Studie gewonnenen Daten, postulierten wir mögliche Gründe. So fanden wir heraus, dass es im menschlichen Darm zwei „Absorptionsfenster“ für TC geben muss. Ein schmaleres mit geringerer Permeabilität im Jejunum und ein breiteres mit höherer Permeabilität im Caecum/Colon ascendens. Ursächlich hierfür könnten die lokale Häufigkeit und das Wechselspiel der in diesen Arealen vorkommenden Transportproteine P-gp und OCT1 sein. Der Versuch durch Gastroretention ein proximales „Absorptionsfenster“ zu bedienen erwies sich daher nach pharmakokinetischer Modellanalyse als Fehlkonzept. In zukünftigen Studien sollten weitere Darreichungsformen erprobt werden, die insbesondere auf eine Freisetzung des TCs im zweiten „Absorptionsfenster“ mit einer höheren Permeabilität für TC abzielen.
Das Glioblastoma multiforme zählt bis heute trotz multimodaler Therapieansätze zu den prognostisch ungünstigsten malignen Neoplasien des Menschen. Ein mittleres Überleben von etwa 15 Monaten unter der derzeitigen Standardtherapie konnte trotz intensiver Forschung bislang nicht wesentlich gesteigert werden. Die hohe Proliferationsrate und das ausgeprägte infiltrative Wachstum sowie die fehlende Radio- und Chemosensitivität dieser Tumorentität limitieren bis dato die therapeutischen Optionen. Vor diesem Hintergrund ist die Etablierung alternativer Therapieansätze eine vordringliche Forschungsaufgabe. In Glioblastomen konnte eine erhöhte Expression von Komponenten der Endothelin-Achse sowie der Cystein-Protease Cathepsin B nachgewiesen werden. In anderen malignen Neoplasien wie dem Kolon-, Mamma- oder Prostatakarzinom vermochte die Hemmung dieser Hormone/Enzyme die proliferative und migratorische Aktivität der Tumorzellen zu vermindern, wobei gewebespezifische Differenzen sowie Ambivalenzen der Inhibitionsresultate zu beobachten waren. In dieser Dissertation sollte unter in vitro-Bedingungen das Expressionsverhalten der Glioblastomzelllinien LN 18 und U 87 MG hinsichtlich obig genannter Systeme sowie der Einfluss einer dualen Blockade der Endothelin-Rezeptoren A und B durch Bosentan bzw. der selektiven Inhibition von Cathepsin B durch CA-074 Me auf die zelluläre Proliferation und Migration untersucht werden. Mittels quantitativer RT-PCR konnte in beiden Zelllinien – verglichen mit gesundem Hirngewebe – eine erhöhte mRNA-Expression sowohl der Endothelin-Achse als auch von Cathepsin B nachgewiesen werden. Die Western-Blot- und ELISA-Untersuchungen bestätigten eine erhöhte Expression von Endothelin-1, dem ETAR und dem ETBR sowie von Cathepsin B in beiden Zelltypen. Im Weiteren wurde der Einfluss der Inhibitoren Bosentan und CA-074 Me auf die Proliferation der beiden Zelllinien im Resazurin- und Kristallviolett-Assay sowie auf die Migration im xCelligenceTM-System und im Wundheilungs-Assay untersucht. Ein signifikanter Einfluss von Bosentan konnte in den durchgeführten Experimenten in beiden Zelllinien weder für die Proliferation noch die Migration nachgewiesen werden. Für CA-074 Me zeigte sich jedoch in einer Konzentration von 10 µM ein hemmender Einfluss auf die Zellviabilität sowie die Migration der Zelllinien LN 18 und U 87 MG. Längere Inkubationszeiten und höhere Konzentrationen der verwendeten Inhibitoren, wie in der Fachliteratur beschrieben, sollten in weiterführenden Analysen in die Experimente eingeschlossen werden. Die ebenfalls in die Untersuchungen eingeschlossenen Zytostatika Doxorubicin, Teniposid und Vincristin bewirkten eine signifikante Reduktion der Zellviabilität beider Glioblastomzelllinien, während Carmustin, Lomustin und Temozolomid kaum Einfluss auf diese Zellen nahmen. Weder Bosentan noch CA 074 Me führten dabei zu einer signifikanten Modulation der Zytostatika-Wirkungen. Alle untersuchten Zytostatika verursachten zudem eine verminderte Migration der Glioblastomzellen in vitro, jedoch war das Ausmaß dieser Migrationshemmung sehr unterschiedlich. Auch hier konnte kein Einfluss von Bosentan oder CA 074 Me auf die durch die Zytostatika verursachte Hemmung der Zellmigration beobachtet werden. Die Komplexität und Multifunktionalität beider Hormon-/Enzymsysteme innerhalb verschiedener Zellkompartimente und Gewebetypen machen weitere Untersuchungen in vitro und in vivo notwendig, um das Potenzial beider Systeme für einen gezielten Einsatz in der Tumortherapie bzw. der Behandlung des Glioblastoms vollends zu klären. Zudem muss berücksichtigt werden, dass bei Verwendung pharmakologischer Hemmstoffe unspezifische bzw. pleiotrope Effekte nicht gänzlich ausgeschlossen werden können, weshalb weiterführende Analysen mit gezielter, genetischer Ausschaltung der Zielgene, beispielsweise mittels siRNA oder CRISPR/Cas9-Technologie, sinnvoll erscheinen.
Zusammenfassung In der basalen Populationsstudie SHIP-0 (Study of Health in Pomerania) zeigten sich Assoziationen zwischen dem Zustand parodontaler Gewebsschädigung und dem Magnesiumserumspiegel. Außerdem ließen sich in SHIP-0 bei Einnahme magnesiumhaltiger Medikamente auch positive Wirkungen auf den Zahnhalteapparat erkennen. Ziel dieser Arbeit sollte es daher sein, diese Tendenzen im Rahmen der 5-Jahres-Folgestudie SHIP-1 zu verifizieren. Zu diesem Zwecke wurden die an SHIP-1 teilnehmenden Probanden zur Beziehung ihres basalen Magnesium/Kalzium-Verhältnisses zur Progression ihres parodontalen Zustands untersucht. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: 1. Bei einem hohen Magnesiumserumspiegel findet eine Verlangsamung der parodontalen Gewebedestruktion statt. 2. Es bestehen deutliche Dosis-Wirkungsbeziehungen des Magnesium/Kalzium-Verhältnisses im Serum zum parodontalen Status. 3. Der Magnesium-Effekt tritt unabhängig von vorhandenen zusätzlichen Risikofaktoren auf. Dies betrifft vor allem Bildung, Diabetes, Rauchen und das Alter. 4. Die Kombination aus weiblichem Geschlecht und Diabetes ist die wichtigste Ursache für ein geringes Magnesium/Kalzium-Verhältnis. 5. Ein hohes Gesundheitsbewusstsein, gekennzeichnet durch eine hohe Bildung und Nichtrauchen, ist mit einem hohen Magnesium/Kalzium-Status assoziiert. 6. Es nahmen von 4290 Probanden der SHIP-0 nur noch 3300 an SHIP-1 teil, deren Risikofaktorenverteilung sich verändert hat. Das follow-up ist daher nicht mehr bevölkerungs-repräsentativ, da besonders risikobelastete Patienten fernblieben. Diese Arbeit gibt damit einen Ausblick auf die möglichen Wirkungen des Magnesium/Kalzium-Verhältnisses und dessen Einfluss auf den Zahnhalteapparat. Ob sich durch Magnesiumeinnahme ein positiver Effekt auf die parodontale Situation erreichen lässt, muss durch weitere Untersuchungen geklärt werden.
Das Glioblastom ist ein WHO Grad 4-Tumor und einer der häufigsten und zugleich agressivsten Hirntumoren im Erwachsenenalter. Trotz multimodaler Therapie, die eine neurochirurgische Resektion sowie eine adjuvante Radiochemotherapie und als neuen Therapieansatz eine Kombination aus Temozolomid und tumor treating fields umfasst, ist die Prognose weiterhin schlecht, sodass der Suche nach neuen therapeutischen Zielstrukturen eine maßgebliche Bedeutung zukommt. Für verschiedene Tumorentitiäten konnte gezeigt werden, dass die Überexpression einzelner onkogener Kinasen die Tumorprogression vorantreibt, wobei bei Glioblastomen gezeigt werden konnte, dass die Serin-Threonin-Kinase Pim1 eine wichtige Rolle in der Pathogenese einnimmt.
In den Fokus rücken zunehmend auch stammzellähnliche Tumorzellen, die eine Subpopulation innerhalb von Glioblastomen darstellen und das aggressive biologische Verhalten sowie die Resistenz gegenüber der Standardtherapie und eine hohe Rezidivrate vermitteln können.
In dieser Arbeit sollte dementsprechend basierend auf den bisherigen Erkenntnissen zu Pim1 sowie zur Bedeutung von Tumorstammzellen im malignen Geschehen der Einfluss der Serin-Threonin-Kinase Pim1 auf das Stammzellverhalten von Glioblastomzellen näher untersucht werden.
Durch den Vergleich von adhärent wachsenden Tumorzellen der Glioblastomzelllinie LN-18 mit stammzellähnlichen LN-18 Neurosphären konnte eine erhöhte relative mRNA-Expression von Pim1 und EGFR sowie der potentiellen Stammzellmarker Nestin, CD44, CD133 und Musashi-1 nachgewiesen werden. Die relative Proteinexpression von Pim1 sowie der Stammzellmarker Nestin, CD44, CD133 und Sox2 war in den Neurosphären im Vergleich zu den adhärent wachsenden LN-18 Zellen ebenfalls gesteigert. Diese Daten konnten durch die Immunfluoreszenz-Färbungen bestätigt werden.
Ein effizienter siRNA-vermittelter knockdown von Pim1 auf Proteinebene konnte in dieser Arbeit nicht erzielt werden, sodass keine Aussagen zu einer Regulation von Stammzell- und Differenzierungsmarker nach zielgerichteter genetischer Abschaltung von Pim1 getroffen werden konnten. Hier sind weiterführend Optimierungen notwendig oder der Einsatz spezieller CRISPR-Cas9-Verfahren zur genetischen Ausschaltung sinnvoll.
Die pharmakologische Inhibition von Pim1 mit LY294002 und TCS Pim1-1 führte zu einer signifikanten Reduktion der Neurosphärenformation sowie der Zellviabilität bei LN-18 Zellen, wodurch die in Vorarbeiten an adhärenten Glioblastomzellen gewonnenen Daten um Untersuchungen an stammzellartigen Glioblastomzellen erweitert wurden.
Zusammenfassend legen die in dieser Arbeit erhobenen Daten nahe, dass Pim1 das Stammzellverhalten von Glioblastomzellen beeinflusst, indem Pim1 Einfluss auf die Expression von Stammzellmarkern nimmt und seine Inhibition die Aufrechterhaltung einer Glioblastomstammzellpopulation beeinträchtigt, indem die Neurosphärenformation und die Viabilität der Zellen stark reduziert werden. Somit stellt Pim1 eine geeignete Zielstruktur für eine zielgerichtete Therapieoption beim Glioblastom dar, beispielsweise in Kombination mit der klassischen Radiochemotherapie. Zukünftige Studien müssen zeigen, inwieweit eine selektive Pim1-Inhibition tatsächlich Einfluss auf die Prognose von Patienten mit Glioblastom nimmt.
Untersuchungen zum Einfluss des Endothelinsystemes auf die Doxorubicin-induzierte Kardiomyopathie
(2012)
Das Zytostatikum Doxorubicin besitzt nach wie vor einen hohen Stellenwert in der Therapie maligner Erkrankungen. Die schwerste und gleichzeitig dosislimitierende Nebenwirkung, die bei der Therapie mit Doxorubicin auftreten kann, ist eine Kardiomyopathie. Die Prävention dieser Doxorubicin-induzierten Kardiomyopathie könnte eine effektivere Gestaltung der zytostatischen Therapie ermöglichen, allerdings sind dafür detaillierte Kenntnisse über den Pathomechanismus der Entstehung dieser Herzschädigung unabdingbar. Basierend auf der kardioprotektiven Wirkung des dualen Endothelinrezeptorantagonisten (ETA) Bosentan gegenüber einer Doxorubicin-Kardiotoxizität im Mausmodell, war das primäre Ziel der vorliegenden Arbeit, die Wirkung von Bosentan vergleichend zu einer selektiven Endothelinrezeptor-A- bzw. -B-Blockade mittels Sitaxentan bzw. BQ-788 zu analysieren und zugrunde liegende Mechanismen der Kardioprotektion aufzuklären. Dazu wurde das Konduktanzkatheter-System zur Messung und Auswertung hämodynamischer Parameter von C57/BL6-Mäusen am Institut für Pharmakologie etabliert, mit Literaturdaten verglichen und mittels Magnetresonanztomographie verifiziert. Nach Herausarbeitung der zur Induktion einer Herzschädigung geeigneten Doxorubicin-Dosis von 20 mg/kg KG, wurde im folgenden Tierversuch der Einfluss einer Endothelinrezeptor-Blockade durch die ETAs Bosentan, Sitaxentan und BQ-788 auf hämodynamische Parameter vergleichend analysiert. Dabei konnte bei allen ETAs ein kardioprotektiver Effekt gegenüber der Doxorubicin-Kardiotoxizität nachgewiesen werden. Sitaxentan als hochselektiver Endothelinrezeptors-A-Blocker zeigte eine nur geringfügig schlechtere Wirkung auf die Hämodynamik der Versuchstiere. Interessanterweise konnte auch der Endothelinrezeptors-B-Antagonist BQ-788 die Herzfunktion der Doxorubicin-behandelten Mäuse in ähnlichem Ausmaß wie Bosentan und Sitaxentan verbessern, was auf der zusätzlichen Endothelin-A1-Rezeptorblockade beruhen könnte. In einem weiteren Schritt konnte der Doxorubicin- und Doxorubicinolgehalt verschiedener Organe der Maus mittels HPLC bestimmt werden. Dabei zeigte sich, dass der kardioprotektive Effekt der ETAs nicht auf einer verringerten Akkumulation von Doxorubicin oder Doxorubicinol im Myokard beruht, da deren kardiale Spiegel unter ETA-Co-Medikation keine signifikanten unterschiede zeigten. Lediglich BQ-788 beeinflusste den Doxorubicin- und Doxorubicinol-Gehalt in manchen Organen etwas stärker, was die geringfügig schlechtere Hämodynamik erklären könnte. Um der kardioprotektiven Wirkung der ETAs zugrunde liegende molekulare Prozesse aufzuklären, wurden ausgewählte Gene und Proteine hinsichtlich ihrer Expression und Lokalisation im Myokard bzw. in Kardiomyozyten untersucht. Für das mitochondriale Protein ANT1, welches sowohl physiologische als auch pathophysiologische Effekte vermittelt, konnte auf Proteinebene eine verringerte Expression nach Doxorubicingabe ermittelt werden, während die ETAs die ANT-Expression wieder normalisierten bzw. erhöhten, was in der Literatur als kardioprotektiv beschrieben wird. Die ebenfalls kardioprotektiv wirksamen Kinasen Pim-1 und AKT1 zeigten eine gegensätzliche Regulation unter Doxorubicin. Der kardiale Gehalt an phosphorylierten AKT1 (pAKT1) wurde durch Doxorubicin signifikant vermindert und durch Bosentan sowie BQ-788 wieder auf das Kontrollniveau angehoben, was bei Sitaxentan nicht zu verzeichnen war. Demnach könnte AKT1 in die kardioprotektive Wirkung von Bosentan und BQ-788 involviert sein. Pim-1 L (44 kDa-Isoform) wurde durch Doxorubicin im murinen Myokard signifikant hoch reguliert, was durch Co-Medikation mit ETAs nahezu vollständig revertiert wurde und durch den Transkriptionsfaktor STAT3 vermittelt sein könnte. Auch die Lokalisation von Pim-1 unterlag in einem in vitro Kardiomyozyten-Modell (H9c2) einer Regulation durch Doxorubicin mit nukleärer Akkumulation der Kinase, was durch die ETAs in unterschiedlichem Ausmaß moduliert wurde. Die Pim-1-Regulation unter Doxorubicin-Gabe könnte dabei einen Schutzmechanismus der Zellen gegen die kardiotoxische Wirkung des Zytostatikums darstellen, welcher unter Co-Medikation mit ETAs nicht mehr nötig war, da diese die kardiale Pumpfunktion wieder herstellten. Zusätzliche in vitro Untersuchungen zur Viabilität von H9c2-Kardiomyozyten unter Doxorubicin, ETAs und Hemmung von AKT1 und Pim-1 bestätigten die in vivo Ergebnisse im Mausmodell jedoch nicht. Die vorliegende Arbeit bietet interessante Ansätze zur pharmakologischen Prävention der Doxorubicin-induzierten Kardiotoxizität. In einem in vivo murinen Kardiomyopathie-Modell konnte der therapeutische Nutzen von ETAs zur Prophylaxe einer Herzschädigung unter Doxorubicin deutlich herausgestellt sowie mögliche zugrunde liegende Mechanismen aufgeklärt werden. Damit bietet diese Arbeit vielversprechende Ansätze für weiterführende Untersuchungen zum Einsatz von ETAs als Kardioprotektiva.
Die Sepsis und der septische Schock stellen die häufigste Todesursache auf chirurgischen Intensivstationen dar. Viele Studien haben gezeigt, dass die Barriere-funktion in sekretorischen Organen, wie z. B. Leber, Gehirn und Darm, durch das septische Krankheitsbild beeinflusst wird. Wichtige Determinanten dieser Organbarrieren sind die Effluxtransporter multidrug resistance protein 1 (kodiert durch Mdr1) und das multidrug resistance-associated protein 2 (Mrp2). Sie haben großen Einfluss auf die Absorption und Verteilung sowie Ausscheidung von potentiell toxischen Xenobiotika, unter anderem auch Arzneimittel. Unser Ziel war es, mit der vorliegenden Arbeit einerseits die Expression, anderseits die Funktion der Membran-Transporter Mdr1 und Mrp2 in verschiedenen Organen mit und ohne Sepsis zu untersuchen. Des Weiteren sollte geklärt werden, inwieweit Talinolol als probe drug neben dem bereits gut charakterisierten Transport über Mdr1 auch ein Substrat für Mrp2 ist. Hierzu wurden jeweils 12 männliche Lew.1W-Ratten des Wildtyps und 12 des Mrp2-defizienten Stamms mit Talinolol vorbehandelt. Je sechs Tieren beider Rattenstämme wurde ein Röhrchen in die Darmwand implantiert (colon ascendens stent peritonitis – CASP), die Kontrolltiere wurden scheinoperiert. Nach drei Tagen wurde die Mdr1b- und Mrp2-mRNA-Expression über die real time reverse transcription- Polymerasekettenreaktion im Jejunum, Ileum, Leber, Niere, Gehirn und Hoden analysiert. Weiterhin bestimmten wir sowohl aus den oben genannten Organen als auch aus dem Blut sowie dem gesammelten Urin und Stuhl die Talinololkonzentrationen mittels high pressure liquid chromatography (HPLC) und Fluoreszenzdetektion. Septische Ratten des Wildtyps zeigten gegenüber ihrer Kontrolle eine nominal gesunkene jejunale Mdr1b-mRNA-Expression mit einer gleichzeitig um 20% verminderten Talinololausscheidung über den Stuhl als möglichen Ausdruck der gestörte Absorptionsbarriere des Darms. Weiterhin waren die Mdr1b-mRNA-Level in der Leber erhöht, jedoch ließ sich die zu erwartende Reduzierung der intrahepatische Talinololkonzentration nicht bestätigen. Die Konzentrationen von Talinolol im Gehirn sanken während der Sepsis auf fast ein Drittel der Kontrollgruppe bei unveränderter Mdr1-Expression. Mrp2 scheint hingegen keinen Einfluss auf die Talinololkinetik während der Sepsis zu haben.
Kardioprotektive Wirkung von Antagonisten am Mineralokortikoidrezeptor nach akutem Myokardinfarkt
(2013)
Der akute Myokardinfarkt ist eine der häufigsten Todesursachen in den Industrienationen. Dieser entsteht überwiegend durch artherosklerotische oder entzündliche Veränderungen der Herzkranzgefäße, welche zu einem thrombotischen Verschluss einer oder mehrerer Koronararterien und damit zu plötzlicher Unterbrechung der Blutversorgung, der sogenannten Ischämie, führen. Um die entstehende Herzmuskelschädigung möglichst klein zu halten, ist die schnelle Wiedereröffnung des Koronargefäßes notwendig. Heute ist bekannt, dass diese gewünschte Reperfusion aber auch irreversible Herzschäden verursachen kann. Mit dem Verfahren der ischämischen Postkonditionierung durch kurze Intervalle der Ischämie und Reperfusion nach Wiederöffnung des Koronargefäßes kann die Infarktgröße deutlich gesenkt werden. Für den klinischen Einsatz ist dieses Verfahren jedoch technisch zu aufwändig, sodass der Wunsch nach pharmakologischen Interventionen, die ein hohes Potenzial zur Reduktion der Myokardschädigung nach einem Infarkt bieten, steigt. Aus diesem Grund besteht ein großes Interesse daran, neue Therapien zu entwickeln, ihre kardioprotektiven Signalwege zu erforschen und in den klinischen Alltag einzubringen. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich daher mit der Untersuchung der kardioprotektiven Wirkung der Mineralokortikoidrezeptor-Antagonisten (MR-Antagonisten) Eplerenon und Canrenoat sowie der Charakterisierung wichtiger Elemente der Signalkaskade. Hierfür wurde in dem Modell der isolierten Rattenherzen die kardioprotektive Wirkung dieser MR-Antagonisten während der Reperfusion und die mögliche Beteiligung bekannter Elemente der Signalkaskade für Prä- und Postkonditionierung untersucht. Des Weiteren wurde ein in situ Mausmodell etabliert, um die Infarktgrößen im Gesamtorganismus zu bestimmen. Zur Charakterisierung der Rolle der Adenosinrezeptoren wurden CD73-/-- und A2bAR-/--Mäuse verwendet. Die CD73-/--Mäuse können durch die fehlende 5-Ektonukleotidase (CD73) kein endogenes Adenosin bilden, welches ein wichtiger Mediator für den Myokardschutz ist. Dagegen wurde bei den A2bAR-/--Mäusen der Adenosin-A2b-Rezeptor deletiert, welcher bei der Reperfusion eine Schlüsselrolle spielt. In einem in situ Kaninchenmodell haben weitere Untersuchungen des Canrenoats stattgefunden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Eplerenon während der Reperfusion die Infarktgröße nach einem Myokardinfarkt signifikant reduziert und dass dieser Schutzmechanismus von PKC, PI3-Kinase und den weiteren Kinasen Akt und ERK 1/2 abhängig ist. Weiterhin konnte sowohl bei der Infarktgrößenbestimmung in isolierten Rattenherzen als auch im in situ Mausmodell, in den CD73-/--Mäusen, die Beteiligung des Adenosins bei dem durch Eplerenon vermittelten Myokardschutz nachgewiesen werden. Mit Hilfe des in situ Mausmodells konnte gezeigt werden, dass Canrenoat ebenfalls eine Myokard schützende Wirkung zeigt. Dabei wurde die maximale Reduktion der Infarktgröße mit einer Konzentration von 1 mg/kg erreicht, wenn das Canrenoat 5 min vor Beginn der Reperfusion injiziert wurde. Anhand der Untersuchungen an den CD73-/-- und A2bAR-/--Mäusen konnte gezeigt werden, dass das extrazelluläre Adenosin und der Adenosin-A2b-Rezeptor für den durch Canrenoat vermittelten Myokardschutz essenziell sind. Canrenoat hat sich im in situ Kaninchenmodell ebenfalls als kardioprotektiv erwiesen und zeigte keine Veränderungen der hämodynamischen Parameter. In dem Modell der isolierten Rattenherzen konnte die kardioprotektive Wirkung des Canreonats erneut bestätigt werden und der Schutzmechanismus war von den Kinasen Akt und ERK 1/2 abhängig. Die beiden MR-Antagonisten haben die Fähigkeit, die negative Wirkung von Aldosteron zu unterbinden und damit die Infarktgröße nach einem akuten Myokardinfarkt zu senken. Die Untersuchungen zeigten, dass erst mit einer höheren Aldosteron-Konzentration die kardioprotektive Wirkung dieser MR-Antagonisten aufgehoben und die Phosphorylierung der Akt- und ERK 1/2-Kinase reduziert werden konnte. Die in dieser Arbeit vorliegenden Ergebnisse liefern neue Ansätze für pharmakologische Interventionen zur Behandlung des akuten Myokardinfarktes.
Kardiovaskuläre Erkrankungen sind zur häufigsten Todesursache in der BRD geworden. Wir untersuchten anhand eines funktionell bedeutsamen Polymorphismus der endothelialen NO-Synthase, inwiefern ein Zusammenhang zwischen einer genetischen Variante zu diesen Erkrankungen besteht. In einer großen populationsbasierten Querschnittsstudie in Nord- und Ostvorpommern stellten wir keine signifikante Assoziation des eNOS Glu298Asp-Polymorphismus zu kardiovasculären Erkrankungen wie arterielle Hypertonie oder Myokardinfarkt fest.
Hämatopoetische Stammzellen und zahlreiche reife periphere Blutzellen exprimieren Effluxtransporter vom ABC-Typ, darunter auch die Vertreter MRP4 und MRP5. Weiterhin sind Nukleosidtransporter wie hENT1 in vielen Blutzellen nachgewiesen worden. Über die Regulation dieser an der Vermittlung von Zytostatikaresistenzen beteiligten Transporter im Verlauf der hämatopoetischen Differenzierung ist bisher nur wenig bekannt. Um diesen Prozess genauer zu studieren, wurden zunächst CD34-postive Blutzellvorläufer aus Nabelschnurblut und reife Monozyten und Granulozyten aus peripherem Blut isoliert und hinsichtlich ihrer Transporterexpression charakterisiert. Anschließend wurden die leukämischen Modellzelllinien HL-60, U-937 und M-07e in vitro zur myelomonozytären beziehungsweise megakaryozytären Differenzierung angeregt und die Expression, Lokalisation und Funktion von MRP4, MRP5 und hENT1 während dieses Vorgangs per Real-Time PCR, Western Blot, Immunfluoreszenzmikroskopie und Zytotoxizitäts-Assay untersucht. Der Erfolg der Differenzierung wurde durchflusszytometrisch mittels spezifischer Oberflächenmarker überprüft. Es konnte gezeigt werden, dass MRP4, MRP5 und hENT1 in CD34-positiven hämatopoetischen Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut sowie in reifen Monozyten und Granulozyten exprimiert sind. In den Progenitorzellen konnte eine signifikant höhere MRP4-Expression als in den reifen Blutzellen gefunden werden. Dementsprechend ging auch die modellhafte myelomonozytäre Differenzierung der Zelllinien HL-60 und U-937 mit einer signifikanten Reduktion der MRP4-Expression einher. Im Zuge der megakaryozytären Ausreifung der Zelllinie M-07e hingegen konnte ein signifikanter Anstieg der MRP4-Expression beobachtet werden. Die hENT1-Expression war nach Induktion von Differenzierung signifikant vermindert. Weiterhin konnte nach Induktion von Differenzierung eine signifikante Veränderung der Sensitivität gegenüber 6-Mercaptopurin und Cytarabin beobachtet werden. MRP5 blieb unter Differenzierungsbedingungen im Wesentlichen unverändert. Die Ergebnisse legen den Schluss nahe, dass insbesondere MRP4 im Zuge der hämatopoetischen Differenzierung spezifisch reguliert wird. Der beobachtete Anstieg während der Megakaryopoese unterstützt die Vorstellung einer Beteiligung von MRP4 bei der Thrombozytenfunktion. Weiterhin scheint sich die Expression von MRP4 und hENT1 im Zuge der myelomonozytären Differenzierung zu verringern, was sich auch in Resistenzveränderungen gegenüber 6-Mercaptopurin und Cytarabin niederschlägt. Diese Effekte sollten bei der Entwicklung von neuen Therapieschemata zur Behandlung einer AML berücksichtigt werden, falls eine Applikation von Differenzierungsagenzien in Kombination mit konventionellen Zytostatika vorgesehen ist.
Das MRP4 ist ein Mitglied der ABCC-Subfamilie der ATP-binding cassette transporters. Es transportiert eine große Vielfalt an endogenen und xenobiotischen Verbindungen aus der Zelle. Des Weiteren vermittelt MRP4 den Transport von Signalmolekülen wie z.B. zyklische Nukleotide. Das einzigartige Substratspektrum, die Regulation und die zelluläre Lokalisation des MRP4 stehen in Verbindung mit seiner möglichen Funktion beim Zell-Schutz und dem zellulären Signaling. MRP4 ist abhängig vom Zelltyp entweder in der basolateralen (Prostata, Leber) oder apikalen (Nieren, Kapillaren des Gehirns) Membran von polarisierten Zellen lokalisiert. Des Weiteren wird MRP4 auch in Thrombozyten und Erythrozyten exprimiert. Protein-Protein-Interaktionen können die Funktion, Lokalisation und Expression von Transportern in der Plasmamembran beeinflussen. Viele Interaktionen beinhalten die stabile Assoziation von Proteinen innerhalb von Multi-Untereinheitskomplexen sowie die vorübergehende Assoziation von regulatorischen Proteinen. MRP4 weist u.a. ein sogenanntes PDZ-Bindemotiv auf, welches durch die Aminosäuren ETAL charakterisiert wird und die Interaktion mit PDZ-Adaptorproteinen vermitteln kann. Speziell in Thrombozyten ist MRP4 neben der Plasmamembran auch in den δ-Granula lokalisiert. Hier könnten interagierende Proteine eine wichtige Rolle spielen. Änderungen in diesen Proteinen könnten eine Ursache für Störungen der Thrombozytenfunktion mit einer Fehllokalisation von MRP4 sein. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung möglicher Interaktionspartner von MRP4, insbesondere in Thrombozyten. Dafür wurde ein Fusionsprotein aus einem c-terminalen Fragment (117 Aminosäuren) des MRP4 mit der Glutathion-S-Transferase (GST) generiert. Nach Aufreinigung des Fusionsproteins (GST-MRP4) mittels Glutathion-Sepharose wurden pull-down-Experimente mit Thrombozytenlysat durchgeführt. Mittels Western Blot und LC-MS/MS-Analyse konnten als mögliche Interaktionspartner das EBP50/NHERF1, das PSD95, SNX27, die β-Untereinheit des AP3B1 und das HSP90 identifiziert werden. Durch indirekte Immunfluoreszenz konnte außerdem eine partielle Ko-Lokalisation der genannten möglichen Interaktionspartner und MRP4 in den Thrombozyten dargestellt werden. Ein weiterer Ansatz zur Untersuchung der Protein-Interaktion war die Ko-Präzipitation des MRP4 und der daran gebundenen Proteine mittels eines anti-MRP4-Antikörpers, der an magnetische beads gebunden war. Mithilfe der Ko-Immunpräzipitation konnten SNX27, HSP90, AP3B1, EBP50 und PSD95 unterschiedlich stark ko-präzipitiert werden. Es wurde untersucht, inwiefern das PDZ-Bindemotiv des MRP4 für die Interaktion der detektierten Interaktionsproteine essentiell ist. Dafür wurde ein GST-MRP4-Konstrukt ohne das C-terminale PDZ-Motiv generiert. Damit konnte gezeigt werden, dass das PDZ-Bindemotiv nur für die Interaktion mit SNX27, EBP50 und PSD95 notwendig ist, während die Bindung von AP3B1 und HSP90 unabhängig davon erfolgte. Nachdem auf Proteinebene mit verschiedenen Versuchen dargestellt werden konnte, welche Adaptorproteine mit dem MRP4 interagieren, sollte im letzten Abschnitt auf funktioneller Ebene gezeigt werden, inwiefern sich die Lokalisation des MRP4 verändert, sofern das Bindemotiv des MRP4 nicht mehr vorhanden ist bzw. die Adaptorproteine herunterreguliert werden. In Bezug auf das Herunterregulieren der Adaptorproteine wurde die megakaryoblastische Leukämie-Zelllinie M07e als Modell für Thrombozyten-Vorläuferzellen verwendet. Des Weiteren lag das Interesse bei den Interaktionsproteinen AP3, PSD95 und SNX27. Nach Transfektion der M07e-Zellen mit der entsprechenden siRNA und der sich anschließenden Immunfluoreszenz konnte gezeigt werden, dass die Ko-Lokalisation des MRP4 mit den Adaptorproteinen nach knock-down verringert und die Plasmamembran-Lokalisation von MRP4 signifikant gesteigert war. Umgekehrt sollte die Überexpression dieser Adaptorproteine die Plasmamembran-Lokalisation verringern. Dies wurde exemplarisch für SNX27 in MDCK-Zellen untersucht. Dabei sollte auch nochmals die Rolle des PDZ-Bindungsmotivs für die MRP4-Lokalisation gezeigt werden. Dafür wurden die Fluoreszenz-markierten Fusionsproteine CFP-MRP4, SNX27-YFP und das CFP-MRP4(-PDZ) synthetisiert, in MDCK-Zellen transfiziert und ihre Lokalisation mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Es zeigte sich, dass nach Ko-Transfektion des CFP-MRP4 mit SNX27-YFP das MRP4 hauptsächlich im Zell-Inneren lokalisiert war. Außerdem wurde verdeutlicht, dass das PDZ-Bindemotiv für die Internalisierung des MRP4 in das Innere der Zelle durch das Interaktionsprotein SNX27 essentiell ist. Zusammenfassend liefert diese Arbeit wichtige grundlegende Erkenntnisse zu möglichen Protein-Interaktionen von MRP4 und deren Einfluss auf die Lokalisation des Transporters. Deren mögliche physiologische und pathophysiologische Rolle für die MRP4-Funktion in Thrombozyten sollte in weiterführenden Studien näher untersucht werden.
Das Prostatakarzinom ist in den westlichen Ländern der häufigste Krebs des Mannes und verantwortlich für einen beträchtlichen Teil der von Krebs verursachten Todesfälle. Es ist in fortgeschrittenen Stadien einer Zytostatikatherapie nur schwer zugänglich, neue Therapieansätze sind deshalb notwendig. In dieser Hinsicht ist „tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand“ (TRAIL) ein aussichtsreicher Kandidat, da er selektiv toxisch auf Tumorzellen wirkt. Allerdings entfaltet TRAIL allein in vielen Tumorzellen keine ausreichende Wirkung. Die Beeinflussung intrazellulärer Resistenzfaktoren zur Sensibilisierung der Tumorzellen ist hier ein vielversprechender Ansatzpunkt. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass die spezifische Herabregulation der Proteinkinase C(eta); in PC3-Prostatakarzinomzellen durch chimäre Zweitgenerations-Antisense-Oligonukleotide die zytotoxischen Effekte von TRAIL signifikant verstärkt. Nach „Knock-down“ der PKC(eta); zeigt sich ein deutlicher Anstieg der TRAIL-induzierten Apoptose-typischen Veränderungen, wie Caspase 3-Aktivierung und nukleosomale DNA-Fragmentierung. Außerdem kommt es zur Verstärkung der TRAIL-induzierten Störung des mitochondrialen Membranpotentials und einer erhöhten Cytochrom c-Freisetzung, was dafür spricht, dass die PKC(eta); innerhalb des Apoptosesignalweges oberhalb der Mitochondrien wirksam ist. Die PKC(eta); kann in Bezug auf TRAIL somit als ein bedeutender Resistenzfaktor in Prostatakarzinomzellen angesehen werden und ist damit ein vielversprechender Angriffspunkt zur Verstärkung der antineoplastischen Effekte von TRAIL. Im weiteren werden in dieser Arbeit mit Bcl-2 und Bcl-xL zwei bekannte antiapoptotische Proteine mit der Fragestellung untersucht, ob sie als Resistenzfaktoren in der TRAIL-induzierten Apoptose von PC3-Prostatakarzinomzellen eine wichtige Funktion besitzen. Gegen die Erwartungen hat der „Knock-down“ von Bcl-2 jedoch keinerlei Auswirkungen auf den TRAIL-induzierten Zelltod. Anders Bcl-xL: dessen Herabregulation führt zu einer signifikanten Verstärkung der Störung der Mitochondrienfunktion, der Caspase 9- und 3-Aktivitäten und des apoptotischen Zelltodes nach TRAIL-Behandlung. Die beiden Proteine scheinen in Prostatakarzinomzellen also unterschiedliche Funktionen in Bezug auf den TRAIL-aktivierten Apoptoseweg zu haben, wobei Bcl-xL als vielversprechendes Zielmolekül zur Potenzierung der zytotoxischen Effekte von TRAIL genannt werden kann. Zusammengenommen legen diese Befunde nahe, dass PKC(eta); und Bcl-xL erfolgversprechende Zielmoleküle zur Verbesserung der Therapie des Prostatakarzinoms, vor allem im Hinblick auf eine mögliche therapeutische Anwendung von TRAIL, darstellen.
Die Pflanze Pittosporum angustifolium („GymbiGymbi“) wird von der indigenen Bevölkerung Australiens für verschiedene medizinische Indikationen verwendet. Anwendungsbeobachtungen und erste zellbiologische Untersuchungen geben Hinweise auf den potentiellen Nutzen dieser Pflanze für die Therapie maligner Neoplasien. Ziele dieser Arbeit: Erkenntnisse zu den zellbiologischen Interaktionen zwischen Pittosporum angustifolium und der Tumorzelllinie (U-5637). Material: vier alkoholische, ein wässriger und ein mit Amylase behandelter Extrakt, außerdem sieben isolierte Reinsubstanzen. Methoden: Neutralrottest, Durchflusszytometrie. Wichtige Ergebnisse: Neutralrottest: IC50-Werte zwischen 10 µg/ml (Hydrolysat des Aq.EtOH-Extraktes ) und 66 µg/ml (Amylase-Extrakt). Substanz 4 mit IC50 : 4 µg/ml, Substanz 6 mit IC501 µg/ml. Durchflusszytometrie: Keine Zellphasenarretierung durch die Extrakte. Als Wirkmechanismus zeigten sich sowohl Apoptose- als auch Nekroseinduktion sowohl durch die Extrakte als auch durch Substanz 4 [12 µg/ml] und Substanz 6 [1 µg/ml].
Transportproteine spielen für viele Arzneistoffe eine bedeutende Rolle bei der Absorption, Verteilung und Elimination und können folglich auch maßgeblich über die Anflutung eines Wirkstoffs am Ort der Wirkung und / oder Nebenwirkung(en) entscheiden. Ziel dieser Arbeit war es, die Affinität von Tigecyclin zu hepatischen Aufnahme- und Effluxtransportern zu bestimmen. Aus pharmakokinetischen Studien war bekannt, dass das Glycylcyclin hauptsächlich hepatisch ausgeschieden wird, wobei die zugrundeliegenden molekularen Transportmechanismen unbekannt waren, d.h. wie Tigecyclin von den Hepatozyten aufgenommen wird und wieder in die Galle bzw. in das Blut abgegeben wird. Die physikochemischen Eigenschaften der Substanz (logP-Wert: 0,8; pKs-Wert: 0,25/ 8,76) sprechen gegen eine rein passive Diffusion über biologische Membranen.
Um den hepatozellulären Aufnahmetransport aufzuklären, wurden Kompetitionsversuche und direkte Aufnahmeversuch mit Hilfe von stabil transfizierten HEK293-Zellmodellen, die Transportproteine der SLC- und SLCO-Familie stabil überexprimieren, durchgeführt. Unter Verwendung von inside-out-Vesikeln wurde der Effluxtransport von Tigecyclin über MRP2- und MRP3-Transporter untersucht. Um sicher zu gehen, dass die Zellmodelle funktionstüchtig sind, wurde deren Funktionalität vor jedem Versuch mittels bekannter Standardsubstrate und Standardinhibitoren bestätigt. Die direkten Aufnahmeversuche wurden mittels LC-MS/MS analysiert.
Tigecyclin zeigte im verwendeten Konzentrationsbereich und den angewendeten Inkubationszeiten keine zytotoxische Wirkung auf die Versuchszellen. Mit den Kompetitionsassays konnte nachgewiesen werden, dass Tigecyclin einen hemmenden Einfluss auf den Transport von bekannten OATP1B3- und OATP2B1-Referenzsubstraten hat, jedoch keine Beeinflussung von OATP1B1 und NTCP zeigte. Des Weiteren konnte in direkten Aufnahmeversuchen gezeigt werden, dass Tigecyclin ein Substrat des ubiquitär exprimierten Transporters OATP2B1 ist. Ein signifikanter Nachweis, dass Tigecyclin ein Substrat von OATP1B1-, OATP1B3- und NTCP-Transportern ist, gelang jedoch nicht.
Im Bezug auf Effluxtransporter konnte eine Kompetition von Tigecyclin mit dem MRP2- und MRP3-vermittelten Transport in inside-out-Vesikeln nachgewiesen werden. Ein direkter Transport von Tigecyclin über die Vesikel ließ sich jedoch nicht beweisen. Aufgrund methodischer Schwierigkeiten und der sehr begrenzten Bearbeitungszeit, konnten die Versuche nicht oft genug durchgeführt und keine entsprechend belastbaren Daten generiert werden.
Zusammenfassend kann aus den durchgeführten Untersuchungen abgeleitet werden, dass Tigecyclin ein Substrat von OATP2B1 ist und OATP2B1 somit möglicherweise für die hepatische Aufnahme des Arzneistoffes verantwortlich ist. Ob noch andere Transporter eine Rolle spielen, bleibt weiterhin unbekannt. Auch die konkrete Transportkinetik mit der Affinität (Km) und der Transportkapazität (vmax), bleibt nach diesen Versuchen noch unklar. Des Weiteren legen die Ergebnisse dieser Arbeit nahe, dass bei gleichzeitiger Tigecyclin-Gabe ein gewisses Risiko für unerwünschte pharmakokinetische Interaktionen mit Substraten der Transporter OATP1B3, OATP2B1, MRP2 und MRP3 besteht.
Als Fazit kann gesagt werden, dass mit dieser Arbeit ein Beitrag zur Aufklärung des Arzneimitteltransports und der Transporteigenschaften von Tigecyclin in den Hepatozyten geleistet werden konnte. Zusätzlich konnten weitere Erkenntnisse zur Kompetition gewonnen werden. In wie weit die in vitro Resultate auf in vivo Mechanismen übertragbar sind, ist unklar und bietet Möglichkeiten für weiterführende Untersuchungen.
Bis zum jetzigen Zeitpunkt wurden in der Plazenta über 30 membranständige Transportproteine identifiziert, die zum einen in der maternal zugewandten (apikalen) oder zum anderen in der fetal zugewandten (basalen) Membran der Synzytiotrophoblasten lokalisiert sein können. Trotz vieler Hinweise auf die Existenz plazentarer Transportproteine verfügen wir bis heute über kein umfassendes Wissen über ihre Funktion und Expression. Die vorliegende Arbeit wurde initiiert, um die Kenntnisse über plazentare Transportproteine zu vervollständigen und ein möglichst komplexes Wissen über ihre Expression und Funktion in der Plazenta zu gewinnen. Dazu wurden die Transportproteine ABCB1 (P-glycoprotein) und ABCC2 (multidrug resistance protein 2, MRP2) als Vertreter der Effluxtransporter einerseits und OCT3 (organic cation transporter 3) als Vertreter der Aufnahmetransporter anderseits zur weiteren Charakterisierung ausgewählt. Zuerst wurden die Untersuchungen zur plazentaren Expression der Transportproteine ABCB1, ABCC2 und OCT3 durchgeführt und der Einfluss von intrauteriner Entwicklung, schwangerschaftsassoziierten Erkrankungen und Genotyp auf die Expression geprüft. Anschließend wurde die Funktion von ABCB1, ABCC2 und OCT3 mittels Modellsubstraten und selektiver Hemmer untersucht. Die Expression wurde auf mRNA-Ebene mittels real-time RT-PCR (TaqMan®) und auf Protein-Ebene mittels quantitativer Western Blot-Analyse bestimmt. Die funktionellen Untersuchungen wurden an OCT3 überexprimierenden MDCKII-Zellen, plazentaren Membranvesikel, mittels der dualen ex vivo Perfusion der Rattenplazenta und des dualen in vitro Perfusionsmodells der menschlichen Plazenta durchgeführt. Die plazentare ABCC2-Expression in der Spätschwangerschaft war deutlich höher als die Expression von ABCB1. In Untersuchungen zur intrauterinen Entwicklung wurde ein signifikanter gestationsaltersabhängiger Anstieg der OCT3-Expression auf mRNA- und Protein-Ebene beobachtet. Die schwangerschaftsassoziierten Erkrankungen Präeklampsie und Gestationshypertonie verminderten signifikant die OCT3-Expression auf mRNA- und Protein-Ebene. In Untersuchungen zur Veränderungen der Expression in Abhängigkeit vom Genotyp waren die Polymorphismen C3435T und G2677T im ABCB1-Gen und C3972T und C24T im ABCC2-Gen mit einer veränderte Expression der Transporter verbunden. In den funktionellen Untersuchungen wurde zuerst der Einfluss von pharmakologisch relevanten Substanzen auf die Aufnahme des OCT3-Modellsubstrats 1-Methyl-4-phenyl-pyridinium (MPP) in die MDCKII-OCT3-Zellen getest. Einen signifikanten Hemmeffekt auf die MPP-Aufnahme zeigten Imipramin, Fluoxetin, Ecstasy, Nikotin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) und der bekannte OCT3-Inhibitor Disprocynium 24 (D24). Um die Funktion von OCT3 näher zu charakterisieren, wurde die MPP-Aufnahme in die apikalen und basalen Membranvesikel der menschlichen Plazenta untersucht. In den apikalen Vesikel zeigten Fluoxetin, Amphetamin und MPTP eine signifikante Hemmung des MPP-Transports. In den basalen Vesikel haben D24, Imipramin und Ecstasy die MPP-Aufnahme gehemmt. Im nächsten Schritt wurde die Funktion von Abcb1 und Abcc2 mit Hilfe der dualen ex vivo Perfusion der Rattenplazenta an Abcc2-defizienten- und Wildtyp-Ratten untersucht. Die Abwesenheit eines funktionsfähigen Abcc2-Transporters führte bei Abcc2-defizienten-Ratten zu einer erhöhten materno-fetalen Permeabilität des Modellsubstrats Talinolol, die durch Zugabe des Abcb1-Hemmers PSC833 weiter anstieg. Bei den Wildtyp-Ratten verursachte die Zugabe von PSC833 und dem Abcc2-Hemmer Probenecid einen Anstieg der materno-fetalen Permeabilität von Talinolol. Dies spricht für Beteiligung beider Transportproteine an der Plazentabarriere. Im dualen in vitro Perfusionsmodell der menschlichen Plazenta wurde ein unidirektionaler feto-maternaler Transfer des ABCB1- und ABCC2-Modellsubstrats Talinolol bewiesen. Dieser Transfer war durch den ABCC2-Inhibitor Probenecid und den unselektiven Inhibitor Verapamil modulierbar. Der ABCB1-Inhibitor PSC833 hatte dagegen keinen Einfluss auf die diaplazentare Permeabilität von Talinolol. Dies und die hohe ABCC2-Expression in der Terminplazenta spricht für eine größere Bedeutung von ABCC2 in der Spätschwangerschaft. Weitere Untersuchungen mittels des dualen in vitro Perfusionsmodells der menschlichen Plazenta wurden zur Beschreibung der Funktion von OCT3 durchgeführt. In der vorliegenden Arbeit wurde eine höhere materno-fetale Permeabilität des OCT3-Modellsubstrats MPP festgestellt. Der selektive OCT3-Hemmer D24 verminderte die materno-fetale Permeabilität des Modellsubstrats MPP signifikant. Daraus folgern wir, dass OCT3 in den diaplazentaren Transfer von organischen Kationen in fetale Richtung involviert sein muss. Psychopharmaka wie Fluoxetin, Imipramin oder illegale Drogen wie Ecstasy können die Funktion von OCT3 beeinflussen und damit den diaplazentaren Transfer von kationischen Substanzen verändern.
Auswirkungen der Körperposition auf die Magenentleerung und Pharmakokinetik von oralen Arzneiformen
(2023)
Kenntnisse über die Physiologie des humanen GITs und dessen Einfluss auf orale Arzneiformen sind essenziell für die Sicherheit der Pharmakotherapie. Das Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss unterschiedlicher Körperpositionen auf das Anfluten von Koffein als Modell für eine Substanz der BCS Klasse I bei der Einnahme als Tablette und Kapsel sowie die Magenentleerung des mitgetrunkenen Wassers zu untersuchen und untereinander zu vergleichen. Die Erhebung der Daten erfolgte durch Speichelproben von 12 gesunden Probanden nach Einnahme von jeweils 240 mL Wasser zusammen mit einer Koffein enthaltenden Eiskapsel als Markierung für das Wasser, sowie je einer ebenfalls Koffein enthaltenden Hartkapsel und einer Tablette in aufrechter Körperposition, Rückenlage, Rechts- und Linksseitenlage im Crossover-Design. Zur Unterscheidung wurde für die Eiskapsel 13C3-isotopenmarkiertes Koffein, für die Kapsel 13C1-isotopenmarkiertes Koffein und für die Tablette natürliches (12C) Koffein verwendet.
Die Magenentleerung von Wasser im nüchternen Zustand ist abhängig von dem hydrostatischen Druck, der auf den Pylorus drückenden Wassersäule. Abhängig von der Körperposition wird demnach unterschiedlich viel zusätzliche mechanische Arbeit des Magens benötigt, um das Wasser gegen die Schwerkraft zu transportieren. Da diese Arbeit in allen Positionen in Abhängigkeit des MMC ohnehin durch aktive Kontraktionen und Motilität aufgebracht wird, ist bei zusätzlich vorliegendem hydrostatischen Druck die Wasserentleerung schneller. Die Magenentleerung von Wasser ähnelt sich in aufrechter Körperposition und Rechtsseitenlage, da in diesen Körperpositionen keine zusätzliche mechanische Arbeit benötigt wird, um das Wasser gegen die Schwerkraft zu transportieren. Im Gegensatz dazu entleert der Magen in Rückenlage und in Linksseitenlage langsamer Wasser, da in diesen Körperpositionen das Wasser gegen die Schwerkraft aus dem Pylorus herausgedrückt werden muss. So war in Linksseitenlage statistisch signifikant die AUC0-61 um 25% und die Cmax um 18% kleiner als in aufrechter Körperposition. Auch in Rückenlage war die AUC0-61 und die Cmax im Trend kleiner als in aufrechter Körperposition. Das durchschnittliche tmax wurde in Rückenlage und Linksseitenlage im Trend erst später erreicht.
Die Ergebnisse der Tablette und Kapsel spiegelten größtenteils die Ergebnisse der Wasserentleerung wider, wodurch die enorme Bedeutung der Magenentleerung als geschwindigkeitsbestimmender Schritt der Pharmakokinetik verschiedener schnell zerfallender Darreichungsformen abermals belegt wurde. Die durchschnittliche AUC0-61 in Linksseitenlage war um 33% und statistisch signifikant kleiner als in aufrechter Körperposition. Auch die AUC0-61 in Rechtsseitenlage war signifikant größer als in Linksseitenlage. Im Trend wurde das durchschnittliche tmax nach Einnahme der Hartkapsel in Linksseitenlage erst später erreicht und das durchschnittliche Cmax war kleiner. Im Trend flutete die Hartkapsel in Rückenlage langsamer an als in aufrechter Körperposition und Rechtsseitenlage und schneller als in Linksseitenlage.
Die Tablette flutete, im Gegensatz zur Magenentleerung von Wasser, im Trend geringgradig schneller in Rechtsseitenlage an als in aufrechter Körperposition. Der Grund für diese besonders schnelle Wirkstoffanflutung in Rechtsseitenlage war vermutlich, dass die Tablette direkt ins Antrum fiel, aufgrund der Motilität dort schneller desintegrierte oder sogar in den Dünndarm entleert wurde, was wiederum zu noch steileren Profilen führte. Statistisch war die durchschnittliche AUC0-61 dementsprechend in Rechtsseitenlage signifikant größer als in Rücken- und Linksseitenlage. Auch die maximal erreichte Konzentration (Cmax) war statistisch signifikant höher in Rechtsseitenlage als in Linksseitenlage. Die AUC0-61 in Linksseitenlage war ebenfalls statistisch signifikant um durchschnittlich 41% kleiner als in aufrechter Körperposition. Das durchschnittliche tmax wurde in Rücken- und Linksseitenlage im Trend später erreicht als in aufrechter Körperposition und Rechtsseitenlage.
Die Daten der Studie zeigten, dass auch die Lag time von Darreichungsformen körperpositionsabhängig waren. Statistisch war die durchschnittliche Lag time nach Einnahme der Tablette in Rechtsseitenlage signifikant kürzer als in Linksseitenlage.
Die Daten zeigten außerdem, dass die Körperposition vor allem für Darreichungsformen mit langer Desintegrationszeit einen wichtigen Einflussfaktor auf das Anflutungsverhalten hatte, da zum Zeitpunkt des Starts der Desintegration bereits vermehrt Wasser aus dem Magen entleert wurde. Besonders bei schlechter löslichen Arzneistoffen könnte demnach der Einfluss der Körperposition noch deutlich gravierender ausfallen. Die Daten zeigten dennoch, dass auch gut lösliche Arzneistoffe teilweise über Stunden im Magen verweilen und zu Doppelpeaks führen können.
Für biopharmazeutische Modellierungen, wie beispielsweise PBPK Modelle, ist der Unterschied zwischen der Magenentleerung in aufrechten Körperposition und in Rückenlage besonders von Bedeutung, da die Modelle häufig auf MRT Daten basieren, welche in Rückenlage akquiriert werden. Die durchschnittliche AUC0-61 nach Einnahme der Hartkapsel war in aufrechter Körperposition um 24% größer als in Rückenlage. Die durchschnittliche AUC0-61 nach Einnahme der Tablette war in aufrechter Körperposition um 52% größer als in Rückenlage. Da die im Rahmen dieser Arbeit gemessenen Unterschiede den potenziell enormen Einfluss der Körperposition für Modellierungen bei der Arzneimittelentwicklung sowie für die klinische Praxis mit liegenden Patienten unterstreichen, ist eine weitere Abklärung des Einflusses der Körperposition unter anderem auch im postprandialen Zustand empfehlenswert.
Das Das Verständnis zellulärer Signaltransduktionswege ist ein zentrales pharmakologisches Forschungsthema. Dabei ist die Interaktion von Arzneimitteln mit Rezeptorproteinen, entweder als Agonisten oder Antagonisten, essentiell für die Wirkung vieler Arzneimittel. Die Aufklärung der sich daran anschließenden Signaltransduktionswege ist für das molekulare Verständnis vieler Arzneimittelwirkungen deshalb von besonderem Interesse. Viele Forschungsanstrengungen in der Vergangenheit haben sich intensiv mit der Aufklärung solcher Signaltransduktionsvorgängen beschäftigt. Während die Grundzüge solcher Signalwege häufig sehr gut erforscht sind, fällt auf, dass von vielen Signalproteinen zahlreiche Isoformen existieren, die vermutlich am Zustandekommen von Rezeptor-und Effektorspezifitäten beteiligt sind und häufig gewebespezifisch exprimiert werden. Über die Bedeutung solcher Isoformen – insbesondere für Signaltransduktionsvorgänge in vivo – ist wenig bekannt. So kennt man 5 G-Protein beta-Untereinheiten und 12 G-Protein gamma- Untereinheiten, die spezifischen Funktionen bleiben aber offen. Ähnliches gilt für das Netzwerk von PLC-Isoformen, wobei die Entdeckung der PLC epsilon und weiterer Isoformen darauf hindeutet, dass es hier zeitliche und räumliche Integrationsfunktionen der neu entdeckten Mitglieder gibt. Wesentliche Elemente der durch die PLC vermittelten Signaltransduktion sind die Spaltung von PIP2 in DAG und IP3 sowie der temporäre Anstieg der [Ca2+]i. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher die Etablierung und Adaptation eines Systems zur retroviralen Infektion von Zellen mit siRNA-Molekülen angestrebt, die in der Generierung stabiler knock down Zellen resultieren sollte. Im zweiten Schritt sollte diese Technik auf Fragestellungen zur Gbeta-Protein Spezifität und des PLC-Netzwerkes angewendet werden. Bei der RNA-Interferenz (RNAi) handelt es sich um einen hochkonservierten posttranskriptionellen Mechanismus zur Regulation der Genexpression in eukaryotischen Zellen. Eine zentrale Rolle in der RNAi spielen kurze RNA-Moleküle wie siRNAs und miRNAs. Es wurde ein retroviral basiertes Expressionssystem zur siRNA-Expression erstellt und validiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde dieses System erfolgreich zum knock down der Expression von PLCbeta1 PLCbeta 3, PLC epsilon, Gbeta1, Gbeta2 und Gbeta5 eingesetzt. Außerdem wurde mit Hilfe dieses Systems ein erfolgreicher knock down der Expression von Epac1 (Lopez De Jesus et al., 2006), von Cathepsin B (Dr. Bien, persönliche Mitteilung) und MRP5 (multidrug resistance related protein 5; Nambaru, Hübner, Köck, Jedlitschky, Rimmbach, Rosskopf, Kroemer, Weiss, Mayerle, Lerch, und Ritter: Modulation of drug efflux transporter MRP5 affects sensitivity to the nucleoside anticancer drug 5-fluorouracil in pancreatic cancer cell lines; Molecular Cancer Therapeutics; eingereicht) durchgeführt. Wesentliche Befunde zur spezifischen Signalübertragung dieser Arbeit waren die Beobachtung, dass der knock down von Gbeta 1 keinen Einfluss auf die Signalübertragung der Transmitter Bradykinin und Histamin besitzt. Die funktionelle Ausschaltung von Gbeta 2 oder Gbeta 5 – zweier Gbeta-Untereinheiten, die zu unterschiedlichen Gbeta-Familien gehören – führte jedoch zu einer signifikanten Hemmung dieser Signale. Es handelt sich bei dieser Beobachtung um einen der wenigen Befunde, die eine Spezifität bei der Gbeta-vermittelten Signaltransduktion herausarbeiten können. Auf ähnliche Weise konnte plausibel gemacht werden, dass die PLCbeta3 – nicht aber die PLCbeta1 – an der Signalübertragung von LPA-Rezeptoren beteiligt ist. Ein funktioneller knock down der PLC epsilon wirkte sich nicht auf die frühen Calciumsignale nach Stimulation von GProtein- gekoppelten Rezeptoren für LPA, S1P oder Acetylcholin aus. Interessanterweise waren aber nach Ausschaltung der PLC epsilon Calciumsignale, die durch den EGF-Rezeptor – einer Rezeptortyrosinkinase – vermittelt wurden stark gehemmt. Bei der Analyse des Zeitverlaufs der durch LPA stimulierten Calciumsignale fiel ferner auf, dass eine länger anhaltende Plateauphase in Abwesenheit der PLC epsilon unterblieb. Dies deutet auf eine Integrationsfunktion der PLC epsilon in späteren Phasen der Signalübertragung hin, die zu einem anhaltenden Anstieg der Ca2+-Konzentration beiträgt. Es ist bekannt, dass diese Anstiege z.B. bei der Proliferationskontrolle eine wichtige Rolle spielen. Im Einklang mit diesen Befunden fiel auf, dass nach Stimulation mit dem Lysolipid LPA die Proliferationsrate von PanC1 Pankreaskarzinomzellen, denen die PLC epsilon durch retroviralen Transfer von siRNA Molekülen ausgeschaltet wurde, signifikant erniedrigt war. Schließlich wurde eine neue Methode zur Quantifizierung von Transkriptmengen homologer Transkripte basierend auf dem Pyrosequencing Verfahren etabliert und validiert. Gerade bei hoch homologen Genen – wie es bei Gbeta -Untereinheiten der Fall ist – kann diese Methode der relativen Quantifizierung sehr gut eingesetzt werden, da im Gegensatz zu anderen Techniken, die wesentlichen Messungen in einem Ansatz durchgeführt werden können. Abschließend bleibt festzuhalten, dass es gelungen ist, die innovative Technik der RNA Interferenz auf Fragen der Signalübertragung unter Verwendung retroviraler Infektionstechniken anzuwenden. In ersten Experimenten konnten bereits bislang unbekannte Spezifitäten bei der Signalübertragung über heterotrimere G-Proteine bzw. PLC-Isoformen heraus gearbeitet werden. Damit ist der Grundstein für zukünftige systematische Analysen dieser Zusammenhänge mit Hilfe der hier etablierten Techniken gelegt.
Ziel der Arbeit war es, ein Probenkollektiv zu etablieren und die Expression, Lokalisation und Funktion pharmakologisch und physiologisch relevanter Membrantransporter systematisch zu untersuchen. Dafür wurde aus 70 humanen Plazenten mRNA, Protein und genomische DNA isoliert. Im Anschluss konnte die mRNA-Expression der Membrantransporter ABCB1 (P-gp), ABCC1 (MRP1), ABCC2 (MRP2), ABCC3 (MRP3), (ABCC5), ABCG2 (BCRP), SLC10A6 (SOAT), SLC22A4 (OCTN1), SLC22A5 (OCTN2), SLC22A11 (OAT4) und SLCO2B1 (OATP2B1) bestimmt und hinsichtlich ihrer Assoziation mit dem Gestationsalter und dem Geschlecht analysiert werden. Dabei zeigte sich eine signifikante gestationsabhängige Expressionsabnahme für das P-gp, BCRP, OATP2B1 und OAT4, darüber hinaus war die Expression von MRP1 in Plazenten männlichen Feten im Vergleich zu weiblichen Feten deutlich erhöht. Da fast alle Organe, mit Ausnahme der Leber, Niere und Gehirn, auf eine Carnitinaufnahme aus dem Blut angewiesen sind, spielen Carnitintransporter wie das SLC22A4 (OCTN1) und SLC22A5 (OCTN2) eine entscheidende Rolle: In der Plazenta sind sie bei der Versorgung des Fetus mit L-Carnitin unabdingbar. Auf mRNA-Ebene konnte in diesem Zusammenhang zunächst keine gestationsabhängige Expressionsänderung gezeigt werden, obwohl der Fetus zum Ende der Schwangerschaft einen deutlich erhöhten Carnitinbedarf hat. Die daraufhin durchgeführte Bestimmung der korrespondierenden OCTN2-Proteinexpression, die interessanter Weise nicht mit den mRNA-Werten korrelierte, zeigte tatsächlich eine erhöhte Transporterexpression zum Ende der Schwangerschaft hin. Für das OCTN2 wurden weiterhin Untersuchungen zum Einfluss eines bekannten Promotorpolymorphismus, dem -207G>C, der in anderen Studien mit der OCTN2 Expression assoziiert werden konnte, durchgeführt. Hier zeigte sich, dass diese genetische Variante zwar die mRNA Expression des Transporters beeinflusst, sich dieser Effekt aber wiederum nicht auf die Proteinebene übersetzt, so dass anzunehmen ist, dass die plazentare OCTN2 Expression auch von nicht transkriptionellen Faktoren (z.B. miRNA) bestimmt wird. Mit Blick auf die anderen untersuchten Transporter zeigte sich in vielen Fällen eine Korrelation in der Expression bestimmter Efflux- und Aufnahmetransporter. Ein Beispiel für ein solches Transporterpaar war dabei das BCRP und OATP2B1,das in der Folge weiter untersucht wurde, wobei insbesondere ein mögliches funktionelles Zusammenspiel im Mittelpunkt stand. Aufbauend auf der apikalen Expression des BCRP und der basalen des OATP2B1, wurde ein, auf MDCKII-Zellen basiertes, in vitro Zellsystem verwendet, um die Bedeutung dieser Transporter für den transzellulären Transport von Substanzen wie E1S und DHEAS zu zeigen. In der Tat war ein gerichteter Transporter dieser Substanzen nur zu beobachten, wenn beide Transporter in den Zellen exprimiert wurden. Diese Ergebnisse sind bezüglich der Hormonsynthese durch die Plazenta von Bedeutung, da diese während der Schwangerschaft einen zentralen Syntheseort darstellt, aber einige Vorläufermoleküle nicht selber synthetisieren kann. Zusammengefasst bietet die vorliegende Arbeit ein umfassendes Bild über die Regulation wichtiger physiologischer und auch pharmakologischer Membrantransporter im letzten Drittel der Schwangerschaft. Darüber hinaus konnte für ausgewählte Transporter das Zusammenspiel (OATP2B1 und ABCG2) und die Regulation (OCTN2) näher charakterisiert werden.
Als Folge eines akuten Myokardinfarktes kommt es zu einem Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration assoziiert mit einer Aktivierung der kardialen Cysteinproteasen Calpain I und II. Diese scheinen in der Pathogenese von Gewebeschäden und Nekrose nach Myokardinfarkt eine wesentliche Rolle zu spielen. Darüber hinaus gibt es Hinweise auf eine Beteiligung von Calpain I bei kardialen Umbauprozessen nach Infarkt. Calpaininhibitoren könnten daher in der Therapie des Myokardinfarkts erfolgreich eingesetzt werden. Unter den Bedingungen einer kardialen Ischämie konnte bei einigen dieser Substanzen eine kardioprotektive Wirkung demonstriert werden. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde ein Aktivitätsprofil der beiden Calpainformen im infarzierten und nicht-infarzierten Myokard erstellt und die Auswirkungen des Calpaininhibitors CAL 9961 in vitro und in vivo untersucht. Hierzu wurde an Ratten durch permanente Ligation der linken Koronararterie ein akuter Myokardinfarkt induziert. Ein, 3, 7 und 14 Tage nach Infarkt wurden Calpain I und II aus Gewebehomogenaten von interventrikulärem Septum (IS) und linker, freier Ventrikelwand (LVFW) mittels Chromatographie auf DEAE-Sepharose getrennt. Die Aktivität wurde in scheinoperierten und Infarkt-induzierten Tieren mit chronischer Placebo- oder CAL 9961-Therapie mithilfe eines Enzymassays mit synthetischem Substrat gemessen. Die Therapie wurde 3 Tage vor Infarktinduktion begonnen. Calpain I-Aktivität erreichte 14 Tage nach Infarkt höchste Werte im nicht-infarzierten Myokard (IS), während die maximale Calpain II-Aktivität 3 Tage nach Infarktereignis im infarzierten Herzgewebe (LVFW) gemessen wurde. In Experimenten in vitro hemmte CAL 9961 beide Calpainformen vollständig. In vivo verhinderte eine chronische Therapie mit CAL 9961 bei Tieren mit Myokardinfarkt teilweise den Anstieg der Calpain I-Aktivität im nicht-infarzierten Gewebe (IS) und reduzierte die Calpain II-Aktivität im infarzierten Myokard (LVFW) auf das Level scheinoperierter Tiere. Die in dieser Dissertation erbrachten Ergebnisse zeigen, dass die kardialen Calpaine I und II nach einem akuten Myokardinfarkt aktiviert werden, sich ihre Aktivierung jedoch innerhalb des Myokards zeitlich und regional unterscheidet. Die chronische Inhibition dieser Enzyme könnte die Calpain-vermittelten Gewebeschäden limitieren und zur Erhaltung der strukturellen Integrität des Myokards nach Infarkt beitragen.
Der klinische Erfolg einer Arzneimitteltherapie wird maßgeblich durch pharmakokinetische Eigenschaften eines Arzneistoffes bestimmt. Dieser ist unter anderem vom Transport und der Verteilung des Arzneistoffes in die Zielkompartimente abhängig. Während der Einfluss intestinal exprimierter Transportproteine auf die Absorption eines Arzneistoffes nach oraler Gabe bereits umfassend untersucht wurde, ist die Beteiligung dieser Proteine bei der Verteilung von Xenobiotika in die jeweiligen Wirkkompartimente ist bisher weniger umfassend untersucht. Ein Beispiel ist die pulmonale Penetration eines oral verabreichten Arzneistoffes. Es gibt erste Hinweise, die auf eine Beteiligung von Transportproteinen an der Akkumulation von beispielsweise Makrolidantibiotika in der Lunge schließen lassen. Ziel dieser Arbeit war, die Expression von für den Arzneimitteltransport wichtigen Proteinen in unterschiedlichen Kompartimenten der Lunge und gleichzeitig den Einfluss dieser auf die Verteilung von Arzneistoffen in die pulmonale Epithelialflüssigkeit und die bronchoalveolären Lavagezellen zu untersuchen. Die klinisch indizierte Kombinationstherapie eines Makrolides mit Rifampicin zur Eradikation von Rhodococcus equi in Fohlen bietet eine geeignete Grundlage dafür. Zur Auswertung pharmakokinetischer Untersuchungen entwickelten und validierten wir eine Flüssigchromatographie-Tandemmassenspektrometrie (LC-MS/MS)-Methode. Diese ermöglichte die Quantifizierung von Clarithromycin, 14-Hydroxyclarithromycin, Rifampicin und dessen Hauptmetaboliten 25-O-Desacetylrifampicin sowohl in den Proben der tierexperimentellen Studien als auch in den Zelllysaten der in vitro-Untersuchungen. In zwei Interaktionsstudien an gesunden Fohlen sollte der Einfluss einer chronischen Komedikation von Rifampicin, einem Induktor der Genexpression von ABC-Transportern, auf die Verteilung der Makrolide Tulathromycin bzw. Clarithromycin in die pulmonalen Kompartimente untersucht werden. Hierbei stellten wir nach Rifampicingabe eine deutliche Abnahme der Akkumulation beider Makrolide in den pulmonalen Kompartimenten fest. Die mittels TaqMan®-Methoden durchgeführten Genexpressionsuntersuchungen ergaben den unerwarteten Befund einer fehlenden Induktion der mRNA von ABCB1 und ABCC2 durch Rifampicin. Für Clarithromycin ist bekannt, dass es ein Substrat von ABCB1 und ABCC2 ist. In in vitro-Transportstudien an überexprimierenden Zellmodellen sowie Vesikeln transfizierter Zellen zeigten wir, dass Tulathromycin keine Affinität zu den genannten Transportproteinen besitzt. Somit konnten die pulmonalen Auswärtstransporter nicht ursächlich sein für den Verlust an Makrolidkonzentration an ihrem Wirkort. Gleichzeitig sank die orale Bioverfügbarkeit von Clarithromycin signifikant um mehr als 90% wohingegen die Bioverfügbarkeit von Tulathromycin nur um 25% sank. Dieser drastische Verlust an Bioverfügbarkeit von Clarithromycin konnte weder allein mit einem gesteigerten intestinalen Efflux noch durch den gesteigerten hepatischen Metabolismus des CYP3A4-Substrates erklärt werden. Diese Ergebnisse weisen auf eine Beteiligung anderer intestinaler Aufnahmemechanismen hin. Die anschließend durchgeführte Studie zur Untersuchung der akuten Interaktion von Clarithromycin und Rifampicin erbrachte ähnliche Ergebnisse bezogen auf die pulmonalen Kompartimente. Die orale Absorption war jedoch um „nur“ 70% reduziert. Den Unterschied von etwa 20% in der Veränderung der oralen Absorption von Clarithromycin verglichen zur chronischen Therapie konnten wir mit der nach akuter Komedikation ausbleibenden Induktion von ABCB1, ABCC2 und dem Biotransformationsenzym CYP3A4 begründen. Auffallend waren die verdoppelten Verhältnisse der Konzentration von Clarithromycin in der Epithelialflüssigkeit verglichen zum Plasma sowohl nach chronischer als auch nach akuter Komedikation. Die weiteren Transportuntersuchungen an transfizierten Zellen zeigten einen inhibitorischen Einfluss von Clarithromycin auf alle Vertreter der organic anion transporting polypeptide (OATP-) Familie (OATP1B > OATP1B1 > OATP1A2 > OATP2B1). In den direkten Akkumulationsversuchen stellte sich Clarithromycin jedoch nicht als Substrat der genannten Transportproteine dar. Wir konnten somit verdeutlichen, dass die klinisch indizierte Kombinationstherapie aus Makroliden und Rifampicin zur Elimination des pathogenen R. equi mit einer drastischen Absorptionsminderung von Clarithromycin verbunden ist und die Akkumulation im pulmonalen Zielkompartiment deutlich beeinträchtigt ist. Dennoch werden in der pulmonalen Epithelialflüssigkeit und den bronchoalveolären Lavagezellen therapeutisch ausreichend hohe Konzentrationen erreicht. Wir konnten im Vergleich der akuten und der chronischen Interaktion der Antibiotika die Beteiligung von intestinalen Transportmechanismen, die durch Rifampicin modulierbar sind, nachweisen. Die detaillierte Aufklärung der beteiligten Transportproteine bietet Ansatzpunkte für zukünftige Forschungsarbeiten.
Der ß-Adrenozeptorenblocker Talinolol (TAL) und das Herzglykosid Digoxin (DIG) sind geeignete Substrate, um die Expression von intestinalem P-Glykoprotein beim Menschen zu untersuchen.. Basierend auf der Tatsache, dass Digoxin-Plasmaspiegel bei hyperthyreoten Patienten niedriger sind als bei euthyreoten Personen, sollte mit der vorliegenden Arbeit untersucht werden, ob Schilddrüsenhormone einen Einfluss auf die intestinale P-gp-Expression haben. Dazu wurde an 8 gesunden Probanden (4 männl., 4 weibliche, 22-29 Jahre) die Pharmakokinetik von intravenös (30 mg) und oral (100 mg) appliziertem Talinolol vor und nach 17tägiger Gabe von Thyroxin untersucht. Mittels Immunhistochemie und RT-PCR wurde die intestinale P-gp-Expression in Dünndarmbiopsien, welche den Probanden vor und nach Thyroxin-Gabe entnommen wurden, bestimmt. Ergebnisse: (1) Durch 17tägige Gabe von Thyroxin lässt sich bei gesunden Probanden das Bild einer subklinischen Hyperthyreose erzielen. (2) Nach der Behandlung mit Thyroxin war sowohl in der Immunhistochemie als auch in der RT-PCR ein Anstieg der P-gp-Expres-sion zu beobachten. (3) Die pharmakokinetischen Daten nach oraler Gabe von Talinolol weisen darauf hin, dass Thyroxin ein Induktor des Transportproteins P-gp sein könnte (Abnahme der Bioverfügbarkeit, signifikante Abnahme der Halbwertszeit). Nach intravenöser Applikation konnte keine Veränderung der Pharmakoki-netik von Talinolol gezeigt werden. Schlussfolgerung: Die vorliegenden Ergebnissen zeigen, dass Thyroxin die Expression von intestinalem P-gp induziert. Aufgrund dieses Effektes ist damit zu rechnen, dass die Therapie mit Arzneimitteln, die durch P-gp transportiert werden, bei hyperthyreoten Patienten beeinflusst wird.
Das Glioblastom ist ein hochmaligner und aggressiver Hirntumor, der von der WHO als Grad IV eingestuft wird. Die Betroffenen haben eine mittlere Überlebenszeit von 12 bis 15 Monaten, was auf dem invasiven Wachstum und der Chemo- und Radioresistenz des Tumors beruht. Dadurch existiert keine kurative Behandlung und es kommt in nahezu allen Fällen zu Rezidiven. Zunehmend wird deutlich, dass das Glioblastom einen stark veränderten Energiestoffwechsel aufweist, wobei das sogenannte lipidomic remodelling (Koundouros und Poulogiannis, 2020), welches für maßgebliche Alterationen im Fettsäuremetabolismus sorgt, besonders interessant erscheint. Die Fettsäureoxidation sowie damit assoziierte Prozesse und Proteine sind als eine bedeutende Energiequelle in den Fokus der Forschung getreten. So auch der hoch-affine Carnitintransporter OCTN2 (SLC22A5), welcher essentiell für den Carnitinhaushalt und damit die β-Oxidation der Zelle ist. In der vorgelegten Arbeit wurde daher das komplexe OCTN2/L-Carnitin System in seiner Funktion als potenzielle pharmakologische Zielstruktur zur therapeutischen Intervention beim Glioblastom tiefergehend untersucht und vorhandenes Wissen weiter ausgebaut. Hierzu diente eine Vielzahl experimenteller Bedingungen und Methoden, um Teilcharakteristiken des Glioblastoms darzustellen und die Bedeutung des OCTN2/L-Carnitin System zu überprüfen.
Da in vorausgegangenen Studien eine erhöhte Expression von OCTN2 mit einem signifikant schlechteren Überleben von Patienten mit Glioblastom nachgewiesen werden konnte, wurden als weitere potentiell interessante Zielstrukturen der niedrig-affine Carnitintransporter OCTN1 (SLC22A4) sowie Komponenten der β-Oxidation (CPT1C, CRAT) in die Patientenanalysen eingeschlossen. Zwar konnte für OCTN1 eine signifikant erhöhte mRNA-Expression in den humanen Glioblastomproben festgestellt werden, diese war jedoch nicht mit dem Überleben der Patienten assoziiert. Auch CPT1C und CRAT zeigten sich nicht als relevante Zielstrukturen beim Glioblastom.
In den durchgeführten Zellkulturexperimenten mit humanen LN-18 und murinen GL261 Glioblastomzellen zeigten sich partiell signifikante Effekte auf die wachstumsfördernden Kinasen AKT1 und ERK1/2, deren Phosphorylierungsgrad durch L-Carnitin moduliert wurde und die damit möglicherweise an carnitinvermittelten Wirkungen beteiligt sein könnten. Auf die Zellviabilität und Zellvitalität ließen sich hemmende Wirkungen des OCTN2-Inhibitors Meldonium sowie des CPT1-Hemmstoffes Etomoxir nachweisen, welche teilweise durch die zusätzliche Gabe von L-Carnitin revertiert wurden. Hinsichtlich der durch Zytostatika (Doxorubicin, Carmustin, Vincristin und Temozolomid) induzierten Apoptose konnte L-Carnitin nur die durch Carmustin in niedriger Dosierung ausgelöste Caspase-3 Aktivierung verhindern. Ein durch L-Carnitin ausgelöster Effekt auf die Migration der Glioblastomzellen konnte nicht nachgewiesen werden, jedoch wurde die migratorische Aktivität durch die Zytostatika Temozolomid und Carmustin, sowie interessanterweise auch durch den CPT1-Inhibitor Etomoxir, beeinträchtigt.
Um die Möglichkeit einer zielgerichteten Therapie gegen das OCTN2/L-Carnitin System präklinisch zu evaluieren, wurden tierexperimentelle Studien durchgeführt. Unter Verwendung eines orthotopen Glioblastommodelles der Maus konnte gezeigt werden, dass Etomoxir und Meldonium einen hemmenden Einfluss auf das in vivo Tumorwachstum besitzen, wobei dieser Effekt nur für den OCTN2-Inhibitor Meldonium signifikant ausfiel. In den OCTN2-defizienten jvs(-/-)-Mäusen konnte keine ausreichende Anzahl von Versuchstieren erreicht werden, um zuverlässige und finale Aussagen zu tätigen. In den heterozygoten jvs(+/-)-Mäusen, die zwar phänotypisch unauffällig sind, aber durch die geringere OCTN2 Ausstattung verminderte Carnitin-Gewebespiegel aufweisen, zeigte sich eine leichte, nicht signifikante Reduktion des intrazerebralen Tumorwachstums im Vergleich zu den C57BL/6-Wildtyp Mäusen.
Zusammenfassend wurde in der vorliegenden Arbeit das OCTN2/L-Carnitin System und seine Bedeutung für das Glioblastom umfassend dargelegt und experimentell überprüft. Als Endresultat dieser Studie können Etomoxir und Meldonium als Substanzen zur zielgerichteten Beeinflussung des Glioblastomwachstums angesehen werden und sollten in weiteren Versuchsreihen detailliert auf ihre Eignung für die Entwicklung neuer Therapieformen überprüft werden.
Das bisherige Wissen über den Einfluss von pharmazeutischen Hilfsstoffen auf die Funktion von Arzneistofftransportern ist insbesondere für die pharmakokinetisch bedeutsame Gruppe der Aufnahmetransporter sehr beschränkt. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten in vitro Untersuchungen liefern umfangreiche und systematische Daten zu inhibitorischen Effekten von häufig verwendeten pharmazeutischen Hilfsstoffen auf die Transportfunktion der in vielen pharmakologisch bedeutsamen Geweben exprimierten organic cation transporter (OCT) 1-3 sowie H+/peptide cotransporter (PEPT) 1/2. Für viele dieser pharmakokinetisch-relevanten Aufnahmetransporter sind es die erstmals beschriebenen Interaktionen mit pharmazeutischen Hilfsstoffen.
Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass der pharmazeutische Hilfsstoff Cremophor® EL (CrEL) neben der bereits bekannten Hemmung von Phase-I-Metabolismus und Effluxtransport auch die zelluläre Aufnahme von Arzneistoffen beeinflusst, wie am klinisch relevanten Beispiel des Doxorubicin dargestellt wurde. Hierbei beeinflusste der genannte Hilfsstoff die zelluläre Akkumulation von Doxorubicin über die Aufnahmetransporter organic anion transporting polypeptide (OATP) 1A2 sowie OCT1, OCT2 und OCT3 in artifiziellen Zellmodellen und zeigte sich zudem auf funktioneller Ebene anhand einer erheblich veränderten Zytotoxizität in MDA-MB-231 Brustkrebszellen. Auf diesem Wege könnten pharmazeutische Hilfsstoffe zusammen mit Transporter-Polymorphismen wie beispielsweise für OATP1A2, deren Rolle für Doxorubicin in dieser Arbeit auch untersucht wurde, für unaufgeklärte Veränderungen sowie Variabilität der Pharmakokinetik, Effektivität und Sicherheit von Arzneistoffen verantwortlich sein.
Die spezifische Normalisierung von in vitro Transportdaten auf den Transportproteingehalt anstelle des Gesamtproteingehaltes kann dabei zur erheblichen Verbesserung der Beurteilung von Transportaktivitäten einzelner Transportproteine sowie deren Beteiligung am Transportprozess eines Arzneistoffes beitragen, wie für die Aufnahme von Doxorubicin und der damit assozierten Zytotoxizität über die OATP1A2-Varianten gezeigt werden konnte.
In der durchgeführten in vivo Studie zeigten sich durch CrEL hervorgerufene Veränderungen in der systemischen Pharmakokinetik sowie noch weit drastischere Auswirkungen auf die Akkumulation des Modellarzneistoffes Clarithromycin (CLA) am Wirkort in der Lunge. Die Hemmung des Cytochrom P450 (CYP) 3A-Metabolismus und des multidrug resistance protein 1 (ABCB1)-vermittelten Effluxtransportes in Leber, Nieren und alveolären Makrophagen konnte hierbei als möglicher Mechanismus für die erhöhte Exposition von CLA im Blutplasma und in den bronchoalveolären Lavage-Zellen identifiziert werden. Allerdings ist die Interpretation von derartigen in vivo-Befunden aufgrund des komplexen und zum Teil simultan ablaufenden Wechselspiels von zahlreichen Aufnahme- und Effluxtransportern sowie von Metabolisierungsenzymen nicht eindeutig konklusiv.
Derartiges Wissen zur Interaktion pharmazeutischer Hilfsstoffe mit pharmakologisch bedeutsamen Enzymen und Transportern kann dazu beitragen, gewünschte Wirkungen zu verstärken sowie unerwünschte Effekte zu minimieren. Das Zusammenspiel der Einflüsse von pharmazeutischen Hilfsstoffen auf Metabolismus, Efflux und Aufnahme kann somit sowohl zu synergistischen als auch zu antagonistischen Effekten auf die Absorption, Verteilung und Elimination eines Arzneistoffes führen. Weiterhin sollte berücksichtigt werden, dass viele Erkrankungsbilder sowie Polymorbidität nicht selten die Therapie mit mehreren Arzneimitteln erfordern, welches auch mit einem erhöhten Risiko für Arzneistoff-Hilfsstoff-Interaktionen verbunden ist.
Die Erkenntnisse dieser Arbeit zum Einfluss von häufig verwendeten Hilfsstoffen auf die Funktion von Arzneistofftransportern unterstreichen, dass von den zunächst als pharmakologisch inert eingestuften Substanzen in Arzneimitteln durchaus pharmakokinetische Effekte ausgehen können.
Dieses Wissen sollte insbesondere bei der präklinischen Entwicklung von Arzneistoffen berücksichtigt werden. Andernfalls drohen möglicherweise Fehlinterpretationen, wenn neue Entwicklungskandidaten in Anwesenheit von pharmazeutischen Hilfsstoffen (z.B. zur Verbesserung der Löslichkeit) auf ihre Affinität zu Metabolisierungsenzymen und Transportern geprüft werden.
Neben der etablierten Anwendung als pharmazeutischer Hilfsstoff rückt in der letzten Zeit auch vermehrt die Nutzung von beispielsweise Cyclodextrinen wie Hydroxypropyl-β-cyclodextrin als Wirkstoff zur Behandlung von Krankheiten wie Krebs oder Arteriosklerose in den Fokus der Forschung. Weitere Untersuchungen zum Einfluss von pharmazeutischen Hilfsstoffen und deren Potential zur Interaktion mit Arzneistoffen, der Optimierung bestehender Therapien sowie möglicher Anwendungen als Wirkstoff sollten im Fokus künftiger in vitro und in vivo Studien stehen.
Der Nukleäre Rezeptor SHP1 ist ein zentrales Stellglied zahlreicher biologischer Prozesse. So reguliert SHP1 über direkte Protein-Protein-Interaktion mit Nukleären Rezeptoren Stoffwechselwege, wie den Gallensäure-, Cholesterin- und Lipidmetabolismus sowie die Glucosehomöostase und den Arzneimittelstoffwechsel. Erweiternd konnte kürzlich ein tumorsupprimierender Effekt des SHP1 gezeigt werden. So wurde die Entwicklung eines Hepatozellulären Karzinoms im Mausmodell in Abwesenheit des SHP1 beschrieben. Es ist bekannt, dass SHP1 nicht nur in hepatischem Gewebe, sondern auch in Lunge, Herz, Milz, Dünndarm, Pankreas, Niere, Nebenniere und Hirn exprimiert ist. In einer orientierenden Expressionsanalyse konnten wir eine verminderte SHP1 Expression in Tumorentitäten der Organe Niere, Lunge und Magen zeigen. Diese Ergebnisse konnten in den Proben einer Kohorte von an einem klarzelligen Nierenzellkarzinom erkrankten Patienten verifiziert werden. Es zeigte sich eine signifikant verminderte SHP1 Expression im klarzelligen Nierenzellkarzinom (RCC) im Vergleich zu Nierengewebe. Nachfolgend konnten wir mittels adenoviral vermittelter Überexpression des SHP1 in einem Zellmodell des RCC einen antiproliferativen Effekt des SHP1 im RCC zeigen. Bisher wurde die Vermittlung dieser antiproliferativen Komponente über eine Hemmung des CyclinD1 durch SHP1 vermutet. Zwar konnten wir im Einklang hiermit eine verminderte CyclinD1 Expression im RCC gegenüber Niere detektieren, nach Überexpression des SHP1 zeigte sich jedoch keine Suppression des CyclinD1, so dass davon auszugehen ist, dass die antiproliferative Wirkung des SHP1 im RCC über andere Zielstrukturen vermittelt wird. Da sich das RCC durch eine hohe Chemotherapieresistenz auszeichnet und SHP1 in den Arzneimittelstoffwechsel involviert ist, untersuchten wir den Einfluss des SHP1 auf die Chemosensitivität des RCC. Hier konnten wir zunächst keinen Einfluss des SHP1 auf die Viabilität des zellulären Modells des RCC durch die Substanzen Vinblastin, Temsirolimus und Sunitinib zeigen. Dennoch ist ein Einfluss des SHP1 auf die Proliferationshemmung durch diese Substanzen nicht auszuschließen. Abschließend untersuchten wir Ursachen für die verminderte SHP1 Expression im RCC. Hier zeigte sich, dass sowohl eine verminderte Expression von Aktivatoren des SHP1 als auch genetischen Varianten in der Promotorregion des SHP1 zunächst nicht ursächlich für die Minderexpression im RCC zu sein scheinen. Zusammenfassend konnten wir den Nukleären Rezeptor SHP1 als Tumorsuppressorgen des klarzelligen Nierenzellkarzinoms, dessen Pathogenese nach dem heutigen Wissensstand nicht geklärt ist, identifizieren. Basierend auf der antiproliferativen Wirkung könnte der SHP1 zukünftig ein Zielmolekül einer pharmakologischen Therapie des RCC darstellen.
Viele periphere Blutzellen exprimieren ABC-Transporter an ihrer Zelloberfläche. Insbesondere konnten ABCC4 (MRP4) und ABCC5 (MRP5), die in Plasmamembranen verschiedener peripherer Blutzellen identifiziert wurden, spezifische Funktionen für die entsprechenden Zellpopulationen, wie z.B. die Mediatorspeicherung in den dichten Granula der Thrombozyten zugewiesen werden. Alle reifen Blutzellen stammen von derselben Stammzelle ab, sodass man annehmen muss, dass sich die spezifische Funktionalität und die dazugehörige zelluläre Ausstattung erst im Verlauf der Differenzierung ausbilden. Inwiefern sich diese Prozesse während der Differenzierung auf die Expression und Lokalisation von MRP4 und MRP5 auswirken, wurde bisher nicht untersucht. So wurde im Rahmen dieser Arbeit ein Zellmodell zur Isolierung CD34-positiver hämatopoetischer Stammzellen aus Nabelschnurblut entwickelt. Dies beinhaltete zudem die Behandlung CD34-positiver Zellen mit bestimmten Wachstumsfaktoren zur Differenzierung in die thrombozytäre und die myelomonozytäre Richtung. Darüber hinaus wurden die Leukämiezelllinien K562 und HL60 mit PMA, DMSO und Butyrat ausdifferenziert. Erstere in Richtung Thrombozyten, letztere in Richtung Makrophagen, Granulozyten und Monozyten. Der Differenzierungsnachweis wurde mittels FACS-Analyse geführt und die Expression von MRP4 und MRP5 im Anschluss auf mRNA und Protein-Ebene, mittels Real-Time PCR, Immunhistochemie, Western Blot und Akkumulationsassay erforscht. In den thrombozytär differenzierten CD34-positiven Zellen fand sich ein signifikant positiv korreliertes Verhältnis von MRP4 zu CD41a (Glykoprotein IIb/IIIa), hingegen eine negative Korrelation von MRP5 zu CD41a. Außerdem konnte im Laufe der Differenzierung in der Immunfluoreszenz eine zunehmende intrazelluläre Expression von MRP4 und eine Kolokalisation mit LAMP-2, einem Lysosomen- und Dense-Granula-Marker, gezeigt werden. Die myelomonozytären Zellen wiesen eine signifikante Reduktion an MRP4 und ebenfalls eine Verminderung der MRP5-Expression auf. In der Differenzierung der leukämischen Zelllinien wurde eine generelle Zunahme von MRP4 und MRP5 mit der Entdifferenzierung der Zellen in allen Linien gefunden. Die komplexen Vorgänge im Verlauf der menschlichen Hämatopoese umfassen also auch Veränderungen an MRP4- und MRP5-Expression in Qualität und Quantität. Sowohl in der physiologischen als auch in der pathologischen Zellentwicklung findet sich eine Regulation dieser beiden Transporter. Die Ergebnisse der Arbeit stützen die Annahme, dass MRP4 eine wichtige Rolle im Metabolismus der Thrombozyten spielt, hier besonders in der Speicherung und Freisetzung von cGMP, ADP und Serotonin. Die Transporterexpression in den Leukämiezelllinien steigt mit der Entdifferenzierung der Zellen. Aus dieser Erkenntnis ergeben sich therapeutische Überlegungen, Differenzierungsagenzien zur Überwindung der Multi-Drug-Resistenz mit Chemotherapeutika zu kombinieren.
Das Glioblastoma multiforme stellt den häufigsten primären Gehirntumor Erwachsener dar, der mit einer Überlebenszeit von 12-15 Monaten nach Diagnosestellung und einer 5-Jahresüberlebensrate von weniger als 5% einhergeht. Um in der Zukunft personalisierte Therapieverfahren für das Glioblastoma multiforme entwickeln und auf diese Weise das Überleben der Patienten verlängern zu können, wird nach relevanten molekularen Faktoren für die Malignität des Glioblastoma multiforme gesucht. Die DNA-Methylierung stellt einen bekannten Mechanismus für die epigenetische Modulation der Genexpression dar und spielt eine entscheidende Rolle in der Dysregulation von Protoonkogenen und Tumorsuppressorgenen während der Krebsentwicklung. Die Promotormethylierung des für das DNA-Reparaturenzym MGMT kodierenden Genes sowie die Arzneimitteltransporter ABCB1 und ABCG2 werden als Auslöser der Chemoresistenz des Glioblastoma multiforme diskutiert. Um die Promotormethylierung der Gene MGMT, ABCB1 und ABCG2 zu untersuchen, wurden in der vorliegenden Arbeit Pyrosequencing-Assays für die Methylierungsmessung der Genpromotoren von MGMT, ABCB1 und ABCG2 sorgfältig etabliert. Dabei wurde die Methode des Pyrosequencing zur Detektion der Methylierung gewählt, da diese eine exakte Quantifizierung des Methylierungsgehalts erlaubt. Die Ergebnisse der verwendeten Assays erwiesen sich als sehr valide und reliabel. Darüber hinaus wurde mittels Real Time-PCR die MGMT-, ABCB1- und ABCG2-Expression in den Glioblastomproben bestimmt. Da in der Fachliteratur Auswirkungen der Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) MGMT C-56T, ABCB1 C3435T und ABCG2 C421A auf die Expression und Funktion der in die Untersuchungen eingegangenen Gene beschrieben worden sind, wurden diese SNPs ebenfalls in den Glioblastomproben bestimmt und zu den Methylierungsdaten in Beziehung gesetzt. Durch die statistische Auswertung der erhobenen Promotormethylierungs- und Expressions- sowie SNP-Ergebnisse ergaben sich eine signifikant negative Korrelation zwischen MGMT-Methylierung und -Expression in den Glioblastomproben sowie ein signifikanter Zusammenhang zwischen der MGMT-Methylierung und dem MGMT C-56T-Polymorphismus. Hinsichtlich der klinischen Daten der Glioblastompatienten konnte mittels bivariater und multivariater Cox-Analysen kein signifikanter Einfluss von MGMT-, ABCB1- und ABCG2-Promotormethylierung auf das Gesamtüberleben von Glioblastompatienten in der vorliegenden Arbeit festgestellt werden. Daneben war kein signifikanter Einfluss des Alters der Patienten bei Diagnosestellung sowie des Geschlechts auf die Promotormethylierung der Gene MGMT, ABCB1 und ABCG2 nachweisbar. Insgesamt kann geschlussfolgert werden, dass die MGMT-, ABCB1- und ABCG2-Promotormethylierung keine prognostische Relevanz für Glioblastompatienten besitzen und die Suche nach anderen molekularen Zielstrukturen in Glioblastomen, die möglicherweise eine prognostische Aussage oder die Grundlage für eine Therapieoptimierung für Patienten mit einem Glioblastom erbringen könnten, zu erwägen ist.
Trotz multimodaler Behandlungschemata bestehend aus Resektion, Chemotherapie und Radiatio stellt das Glioblastoma multiforme nach wie vor eine große Herausforderung auf onkologischem Gebiet dar. Dieser hochmaligne Hirntumor ist durch eine hohe zelluläre Proliferationsrate, diffuse Infiltration, Anwesenheit von Nekrosen, Angiogenese, mikrovaskuläre Hyperplasie, Apoptoseresistenz und genomische Instabilität charakterisiert. Aufgrund der Invasivität und Rezidivierung beträgt das mediane Gesamtüberleben der Patienten mit einem Glioblastom nur 15 Monate, so dass eine intensive Erforschung neuer Therapiestrategien zwingend erforderlich ist. Eine onkogene Funktion des Transkriptionsfaktors MEF (Myeloid ELF-1-like Factor) ist bereits für andere Tumorentitäten wie Ovarialkarzinome und akute myeloische Leukämie beschrieben. Seine Wirkung vermittelt MEF in diesen Tumoren sowohl über eine Inhibition des p53-Signalwegs als auch p53-unabhängig. In Gehirntumoren ist bislang die Bedeutung der Expression und Funktion von MEF vollkommen unerforscht. In der vorliegenden Arbeit kann erstmals eine signifikante Überexpression von MEF in humanen Glioblastomen verglichen mit gesundem Gehirngewebe nachgewiesen werden. Die Analyse der unterschiedlichen, molekularbiologisch definierten Subtypen des Glioblastoma multiforme zeigte, dass Patienten mit proneuralen Glioblastomen bei niedriger MEF-Expression signifikant länger überleben als Patienten desselben Subtyps mit hoher MEF-Expression. Eine signifikante Häufung der für den proneuralen Subtyp charakteristischen IDH1-Mutation unter den Patienten mit niedriger MEF-Expression und längerem Gesamtüberleben unterstreicht den Einfluss von MEF auf die Progression des proneuralen Glioblastomsubtyps. Äquivalent zu den humanen Daten überleben in einem speziell für den proneuralen Glioblastomsubtyp etablierten Mausmodell Gliom-tragende Mef-/--Mäuse signifikant länger als die entsprechenden Mef-exprimierenden Mäuse. Mef-/--Mäuse weisen zudem signifikant benignere Gliome als die Mef-exprimierenden Mäuse auf. Die Mef-abhängige Entstehung der Gliome wird zum einen über eine stärkere, p53-unabhängige Zellproliferation hervorgerufen, die mit einer erniedrigten p21-Expression in den Mef-exprimierenden Zellen verglichen mit den Mef-/--Zellen assoziiert ist. Zum anderen bewirkt MEF eine signifikante, p53-unabhängige Zunahme von tumorinitiierenden Glioblastomstammzellen sowie ihrer Selbsterneuerung, was anhand einer gesteigerten Neurosphärenbildung, einer Zunahme der die Stammzellen enthaltenden Side Population und einer verstärkten Expression des neuronalen Stammzellmarkers Nestin verdeutlicht wird. Zusätzliche Expressionsanalysen weisen darauf hin, dass MEF direkt über eine Regulation des Transkriptionsfaktors Sox2 als wichtige Komponente im Netzwerk der Stammzell-Signaltransduktion wirkt, während die Transkriptionsfaktoren Oct4 und Nanog möglicherweise indirekt durch MEF beeinflusst werden. Eine für die Radiotherapie von Glioblastompatienten relevante Funktion könnte MEF ebenfalls besitzen, da sich humane Glioblastomzellen gemäß Analysen der subG1-Phase des Zellzyklusses unter Radiotherapie signifikant apoptoseresistenter verhalten, wenn sie MEF exprimieren als bei dessen Verlust. Zusammenfassend geben die Daten dieser Arbeit Anlass zur Hoffnung, in MEF ein für die Tumorentität des Glioblastoma multiforme bedeutsames Onkogen identifiziert zu haben, welches neben seiner wissenschaftlichen Novität zukünftig im klinischen Alltag eine Bedeutung als prognostischer Marker haben könnte. Gemäß den Daten dieser Arbeit könnten insbesondere Patienten, die die molekularen Besonderheiten des proneuralen Subtyps, wie eine IDH1-Mutation, aufweisen, von einer individualisierten Therapie mit MEF-Inhibitoren profitieren, denn Patienten mit einem Glioblastom des proneuralen Subtyps sowie einer niedrigen MEF-Expression zeigen einen signifikanten Überlebensvorteil. Durch eine Behandlung mit einem MEF-Inhibitor könnte bei Glioblastompatienten des proneuralen Subtyps mit hoher MEF-Expression die Wirkung des Onkogens MEF gehemmt und damit das Überleben der Patienten verlängert werden.
Parodontitis als eine Volkskrankheit ist die Entzündung des Zahnhalteapparates. Sie wird durch parodontalpathogene Mikroorganismen im Biofilm der Mundhöhle verursacht und kann unbehandelt über zunehmenden Attachmentverlust und Knochenabbau bis hin zum Zahnverlust führen. In der Ätiologie ist die bakterielle Plaque der entscheidende Auslöser, während Verlauf und Schwere durch die Wirtsreaktivität und modulierende Faktoren (Genetik, systemische Vorerkrankungen, Verhaltensfaktoren) determiniert werden. Durch Bestandteile und Stoffwechselprodukte der in der Plaque enthaltenden Bakterien wird die Immunantwort des Wirtes initiiert. Infolgedessen zerstören freigesetzte proinflammatorische Mediatoren das umgebende Stützgewebe und den Knochen.
Auch das proinflammatorische Lipidmolekül Sphingosin-1-phosphat (S1P) scheint bei der Pathogenese der Parodontitis eine Rolle zu spielen. S1P ist an zahlreichen physiologischen Prozessen wie Zellproliferation, vaskulärer Barrierefunktion und Lymphozyten-Zirkulation beteiligt und beeinflusst pathologische Zustände wie beispielsweise das Entzündungsgeschehen und Osteoporose. Die zellulären Signalwege werden durch eine Familie von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (S1PR1 bis 5) gesteuert, wobei die S1P Ausgangskonzentrationen und die unterschiedliche Rezeptoren-Expression in den Geweben entscheidend sind. Verschiedene Studien deuten auf einen Zusammenhang zwischen Parodontitis und S1P hin: Durch Eingriff in den Knochenmetabolismus fördert S1P insgesamt die Knochen-Resorption und steigert die Expression von Zytokinen in humanen gingivalen Epithelzellen.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde basierend auf der randomisierten Bevölkerungsstudie Study of Health in Pomerania (SHIP) untersucht, ob die individuellen S1P-Serumkonzentrationen mit der Parodontitis-Prävalenz in der SHIP-Trend-Kohorte assoziiert sind. Darüber hinaus wurden die individuellen S1P Konzentrationen mit verschiedenen Parodontitis-Variablen (Taschentiefe, klinischer Attachmentverlust, Anzahl der Zähne) und mit klassischen systemischen Entzündungsparametern (hoch-sensitives C-reaktives Protein, Leukozytenzahl, Fibrinogen) korreliert. Außerdem wurde anhand von Gewebeschnitten untersucht, inwiefern Enzyme des S1P-Stoffwechsels im Parodontalgewebe exprimiert sind und ob sich deren Expression im entzündeten Gewebe verändert.
Sowohl höhere Werte der untersuchten Parodontitis-Variablen als auch höhere Werte der untersuchten Entzündungsmarker waren konsistent mit höheren S1P-Konzentrationen assoziiert. S1P stellt somit einen potentiellen Biomarker für Parodontitis dar und ist möglicherweise in der Lage, das lokale parodontale Entzündungsgeschehen als systemische Konzentrationserhöhung im Serum zu reflektieren.
Kein Zusammenhang konnte zwischen Karies-Variablen und S1P gefunden werden, wodurch die Spezifität der Assoziation zwischen den Parodontitis-Variablen und S1P hervorgehoben wird.
Die Enzyme des S1P-Stoffwechsels waren sowohl in gesunden Gewebeproben als auch im Gewebe von parodontal erkrankten Probanden nachweisbar. Allerdings waren die Enzyme Sphingosin-Kinase 1 und S1P-Lyase im Gewebe von Probanden mit Parodontitis hochreguliert und zunehmend auch in anderen Zelltypen exprimiert, sodass womöglich ebenso die lokalen S1P-Gewebekonzentrationen bei Parodontitis erhöht sind.
Basierend auf den in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnissen und den bereits existierenden Studien zum Thema ist ein Zusammenhang zwischen Parodontitis und S1P anzunehmen. Bei einer Parodontitis liegen sowohl ein lokal verstärkter S1P-Metabolismus im Gewebe als auch systemisch erhöhte S1P-Konzentrationen im Serum vor.
Gadoxetate ist ein neuartiges gadoliniumhaltiges leberspezifisches paramagnetisches Kontrastmittel. Es wird nur über funktionell intakte Leberzellen aufgenommen. Der Aufnahmemechanismus von Gadoxetate beim Menschen ist unbekannt. Es gibt Hinweise aus In-vitro und In-vivo Studien an Ratten, dass Gadoxetate ein Substrat für Vertreter der lebespezifischen organic anion-transporting polypeptides (OATP) Familie ist. Daher war das Ziel der vorliegenden Dissertation, den Einfluss der häufigsten funktionellen Varianten der hepatischen Aufnahmetransporter OATP1B1 und OATP1B3 In-vitro und In-vivo am Menschen zu untersuchen. Methode: Es wurden 36 gesunde Probanden kaukasischer Abstammung entsprechend ihres OATP1B1- und OATP1B3-Haplotyps ausgewählt und den Gruppen wie folgt zugeordnet: OATP1B1/1B3 Wildtyp (n=10), OATP1B1 *1b/*1b (n=8), OATP1B1 *15/*15 und *5/*15 (n=8), OATP1B1 *1a/*5 (n=6) und OATP1B3 *4/*4 (N=4). Nach einer Injektion von 0,1 ml/kg/KG wurden die pharmakokinetischen Parameter und das hepatische enhancement durch Gadoxetate (mittels T1- gewichteter MRT) gemessen. In-vitro Studie: Die Effekte von OATP1B1, OATP1B3 und ihrer funktionellen Varianten auf die zelluläre Aufnahme von Gadoxetate wurde mittels validierter stabil transfizierter HEK-Zellen untersucht. Die Gadoxetate-Konzentrationen in Plasma, Urin, Stuhl und Zellen wurden mittels Flüssigchromatographie-Tandemmassenspektrometrie (LC-MS/MS) bestimmt. Ergebnisse: Die Transportaktivität der Proteinvariante OATP1B1p.130Asp und OATP1B3p.233Ile war erhöht während die der Varianten OATP1B3p.112Ala und OATP1B3p.522Cys sowie der OATP1B1p.130Asp/174Ala Varianten erniedrigt war im Vergleich zu den Wildtypproteinen. Das hepatische Enhancement mit Gadoxetate war in den Gruppen OAT1B1 *1a/*5 und *15/*15 und *5/*15 deutlich reduziert im Vergleich zu den OATP1B1 *1a/*1a und *1b/*1b-Trägern. OATP1B3*4/*4 hatten keinen funktionellen Einfluss auf die hepatische Aufnahme von Gadoxetate. Keiner der pharmakokinetischen Parameter wurde durch OATP1B1 und OATP1B3 Varianten signifikant beeinflusst. Zusammenfassend konnte diese Untersuchung bestätigen, dass Gadoxetate ein Substrat von OATP1B1 und OATP1B3 ist. Wir konnten nachweisen, dass zumindest die OATP1B1 Varianten von klinischer Bedeutung für die hepatische Aufnahme von Gadoxetate in gesunden Probanden sind. OATP1B1-Haplotypen können eine Rolle bezüglich der interindividuellen Variabilität in dem hepatischen enhancement durch Gadoxetate spielen. Weitere klinische Studien sind erforderlich, um die hier gewonnenen Ergebnisse zu bestätigen.
Die koronare Herzkrankheit ist die häufigste Todesursache in den Ländern der westlichen Welt. Dem Endothelin-System wird zunehmend eine Rolle in der Pathogenese der Atherosklerose und der koronaren Herzkrankheit (KHK) zugesprochen. Das Endothelin-Converting Enzyme (ECE) katalysiert im letzten Schritt des Endothelin-Systems die Bildung des aktiven Endothelins aus seinem inaktiven Vorläufer big-Endothelin. In dieser Arbeit wurde die Assoziation der beiden Polymorphismen G-377A und C-854T in der Promotorregion des ECE-1a, einer Isoform des ECE, zum Risiko der KHK in einem großen Kollektiv von 1000 Patienten mit einer angiografisch verifizierten KHK und 1000 Kontroll-Patienten untersucht. Die Untersuchung ergab für die Variante G-377A eine Häufigkeit des A-Allels von 10,44% in der KHK-Gruppe gegenüber 10,69% in der Kontrollgruppe. Für die Variante C-854T ergab sich eine Häufigkeit des T-Allels von 8,05% in der KHK-Gruppe gegenüber 7,24% in der Kontrollgruppe. Beim Vergleich der Genotypenverteilung mittels x2-Test ergab sich für beide Varianten kein signifikanter Unterschied (p=0.71 bzw. p=0.63). Für beide Varianten erfolgten Stratifizierungen nach allgemeinen Faktoren wie Alter und Geschlecht und nach den verschiedenen Risikofaktoren einer KHK, die insgesamt keine signifikanten Verteilungsunterschiede ergaben. Zusammenfassend konnte kein Beweis einer Assoziation der beiden Polymorphismen zum Risiko der koronaren Herzkrankheit erbracht werden
Trotz intensiver Forschungsarbeit stellt die kardiale Toxizität von Doxorubicin auch heute noch ein therapielimitierendes Problem in der chemotherapeutischen Behandlung dar und ist nur unzureichend verstanden. In früheren Studien konnte gezeigt werden, dass sowohl in vitro als auch in vivo lipidsenkende Medikamente, wie Statine oder Probucol, in Komedikation positive Auswirkungen auf diese Nebenwirkung besitzen. Der bereits 1985 erstmalig beschriebene Anstieg des Serumcholesterolsspiegels konnte darüberhinaus in eigenen Voruntersuchungen im akuten Doxorubicin-Mausmodell bestätigt werden. Gleichzeitig wurden erhöhte Spiegel oxigenierter Cholesterolderivate in Serum, Herz und Leber nachgewiesen. Vor diesem Hintergrund, wurde die Hypothese aufgestellt, dass Doxorubicin die Bildung von Oxysterolen begünstigt und somit Einfluss auf die Cholesterolhomöostase nimmt. Es ist bekannt, dass erhöhte Cholesterol- und Oxysterolspiegel die Elektrophysiologie, genauer die Kalziumhomöostase in Kardiomyozyten beeinträchtigen, was auf eine mögliche Bedeutung dieser Beobachtung für die Kardiotoxizität hinweist. In der vorliegenden Arbeit konnte diese Hypothese erhärtet werden, indem zunächst sowohl auf RNA- und Proteinebeneeine gesteigerte Expression der Cholesteroleffluxtransporter ABCA1 und ABCG1 in Kardiomyozyten aber auch eine erhöhte Aktivität gezeigt werden konnte. Ursächlich für diese Beobachtung konnte in der Folge eine verstärkte Aktivierung des nukleären Transkriptionsfaktors und Oxysterolliganden LXR unter Doxorubicinexposition identifiziert und durch die Koinkubation von Doxorubicin mit LXR-Agonisten und–Antagonist bestätigt werden. Bei der Charakterisierung verschiedener Oxysterole konnte zudem für 24(S) Hydroxy- und 7 Ketocholesterol ein dem Doxorubicin-vergleichbaren Effekt auf die Expression Karditoxizitäts-assoziierter Gene (wie Gata4, Edn1, Tgfb) festgestellt werden, insbesondere das 7-Ketocholesterol zeigte zudem auch eine ausgeprägte Toxizität im HL-1-Zellmodell. Vor diesem Hintergrund wurde ein Tierversuch durchgeführt, bei dem der Einfluss einer Vorbehandlung mit einem LXR-Agonisten zur Verminderung der zellulären Cholesterolkonzentration durch Aufregulation der genannten Effluxtransporter einen Einfluss auf die akute Doxorobicin-induzierte Kardiotoxizität besitzt. Drei Tage nach der Doxorubicingabezeigte sich dabei für die Ejektionsfraktion in den mit dem LXR-Agonisten vorbehandelten Tieren ein signifikant verbesserter Wert. Dieser Effekt konnte allerdings in der Folge nicht aufrechterhalten werden. Ein Grund hierfür könnte in der zu geringen Halbwertszeit des LXR Agonisten, da dieser mit der Doxorubicingabe abgesetzt wurde, liegen. Trotzallem weisen die Daten auf eine Kardioprotektion hin, so dass weitere Untersuchung in diesem Bereich angestrebt werden sollten.
Die Variabilität von Arzneimitteln wird nicht nur durch die Spezifität der Substanzen für die Zielstrukturen bestimmt, sondern auch durch die interindividuelIe Variabilität von eliminierenden Prozessen. Im Hinblick auf die demographische Entwicklung mit zunehmendem Alter Schwangerer scheint auch die Notwendigkeit einer therapeutischen Intervention der Schwangerschaft wahrscheinlicher. Effekte von maternal gegebenen Arzneimitteln auf das sich entwickelnden Kind sind die Hauptrisiken einer schwangerschafts-assoziierten Therapie. Die Plazenta bildet die Schnittstelle zwischen Mutter und Kind und ist sowohl an der Versorgung, als auch an der Protektion des Kindes beteiligt. Es konnte bereits in vorhergehenden Studien gezeigt werden, dass Transportproteine welche auch die Mitglieder der ABC (ATP-binding cassette) Transporter Familie einschließen, an der Schutzfunktion beteiligt sind. Aus diesem Grund wurde die Expression Lokalisation und Funktion von Mitgliedern der ABC-Transporter in der Plazenta untersucht. Näher betrachtet wurden P-Glykoprotein (ABCB1), Breast Cancer Restance Protein (ABCG2), Multidrug Resistance Protein 2 (MRP2) und MRP5. Quantitative Real-Time Reaktion ergab tue Expression der Transport in allen untersuchten 60 Proben von Früh- und Termingeburten. Nachgewiesen werden konnte eine mit den Gestationsalter abnehmende Expression von MRP5, während die MRP2 und P-Glykoprotein mRNA mit dem Gestationsalter anstieg. Western Blot Analysen von Membranpräparation zeigte ähnliche Ergebnisse. Mittels Immunfluoreszenz Mikroskopie konnte MRP5 hauptsächlich in der basalen Membran des Synzytiotrophoblasten und in der Umgebung voll fetalen Gefäßen nachgewiesen werden, während die anderen 'Transporter hauptsächlich in der apikalen Syzytiotrophohlasten- Mernbran lokalisiert waren. Darüber hinaus wurde die Veränderung der Expression der Transporter in isolierten Zytotrophoblasten untersucht. Diese Vorläuferzellen des Synzytiotrophoblasten differenzieren in vitro und bilden ein multinukleäres Synzytium. Es zeigte sich, dass mit zunehmender Differenzierung die Expression der Transporter mit der hCG-Sekretion - einem biochemischem Marker der Differenzierung- ansteigt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Expression der hier untersuchten Transporter vorn Gestationsalter abhängig ist und sich mit der Differenzierung der Cytotrophoblasten verändert.
Der akute Myokardinfarkt ist die häufigste Todesursache in den Industrieländern. Um die Spätfolge Herzinsuffizienz so gering wie möglich zu halten, ist eine schnelle Wiederherstellung des koronaren Blutflusses entscheidend. Dieser gewünschten Reperfusion wird jedoch eine zusätzliche Schädigung des Myokardgewebes zugeschrieben. Durch kurze Intervalle von Ischämie und Reperfusion nach Wiederöffnung des Koronargefäßes konnte die Infarktgröße drastisch gesenkt werden, so dass dieses als ischämische Postkonditionierung bezeichnete Verfahren, hohes Potential zur Reduktion der Myokardschädigung nach einem Infarkt bietet. Für den klinischen Einsatz erweist sich dieses Verfahrens jedoch als technisch aufwendig, so dass der Wunsch nach pharmakologischen Ansätzen zu Beginn der Reperfusion steigt. Die vorliegende Arbeit befasste sich daher mit der Untersuchung möglicher kardioprotektiver Substanzen und der Charakterisierung wichtiger Elemente der zugrunde liegenden Signalkaskade. Hierfür wurde in dem Modell der ex vivo perfundierten Rattenherzen die kardioprotektive Wirkung des endogenen Mediators Bradykinin während der Reperfusion und die mögliche Beteiligung des EGF-Rezeptors untersucht. In einem kardiomyozytenbasierten Zellmodell, bei dem HL-1-Zellen mit den Kalziumionophor Calcimycin gestresst wurden, sollte die Beteiligung wichtiger Signalelemente bestätigt werden. Zur Charakterisierung der Rolle der Adenosinrezeptoren während der Reperfusion wurde ein in vivo Maus Modell etabliert, welches die Untersuchung der Infarktgröße im Tier erlaubt. Hierfür wurden selektive Adenosinrezeptoragonisten und -antagonisten sowie CD73-/- Mäuse, die kein endogenes Adenosin durch die 5’-Ektonukleotidase (CD73) bilden können, verwendet. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Bradykinin während der Reperfusion zu einer signifikanten Reduktion der Infarktgröße führt und dass dieser Schutzmechanismus von einer Transaktivierung des EGF-Rezeptors und der survival Kinase Akt abhängig ist. Des Weiteren konnte sowohl bei den Infarktgrößen als auch im zellbasierten Modell eine Beteiligung der MMP-8 bei der Transaktivierung des EGF-Rezeptors nachgewiesen werden. Anhand des in vivo Maus Modells konnte gezeigt werden, dass der durch die ischämische Postkonditionierung vermittelte Myokardschutz durch den selektiven A2bAR Antagonisten MRS1754 aufgehoben werden konnte und dass eine Aktivierung des A2bAR durch den selektiven A2bAR Agonisten BAY60-6583 während der Reperfusion zu einer Senkung der Infarktgröße führt. Des Weiteren konnte mit Hilfe der CD73-/- Mäuse und unter Verwendung von selektiven Adenosinrezeptoragonisten und -antagonisten gezeigt werden, dass bei fehlendem extrazellulärem Adenosin kein Schutz durch eine ischämische Postkonditionierung, dem selektiven A2bAR Agonisten BAY60-6583 oder dem A2aAR Agonisten CGS21680 erzielt werden kann, sondern dass nur die gleichzeitige Aktivierung von A2aAR und A2bAR zum Schutz des Herzens vor Reperfusionsschäden führt. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen mögliche Ansätze für pharmakologische Interventionen zur Behandlung des akuten Myokardinfarkts auf. Die Verwendung von Agonisten zur Aktivierung von G-Protein gekoppelten Rezeptoren rückt damit immer mehr in den Vordergrund für mögliche klinische Ansatzpunkte.
Bei ersten Betrachtungen zum Zelltransport nahm man an, dass Stoffe passiv über die Zellmembran diffundieren. Nach weiteren Forschungen musste dies revidiert werden. Heute weiß man, dass dies fast nur über spezielle Proteine möglich ist. Diese Proteine sind Kanäle und Transporter welche aufgrund ihrer Funktion eine Schlüsselposition in der zellulären Homöostaste darstellen. Sie sorgen für die Aufnahme und den Ausstrom fast aller wichtigen Substanzen.
Im Jahr 2007 wurde die Entdeckung eines neue Zelltransporters, TETRAN (Tetracycline transporter-like protein), veröffentlicht. In ersten Untersuchungen zeigte sich ein bevorzugter Transport von NSAIDs über die Zellmembran. NSAIDs haben bei unterschiedlichen Personen abweichende Wirkungen bzw. Nebenwirkungen deren Gund bis heute noch nicht endgültig geklärt ist.
In dieser Arbeit konnten polymorphe TETRAN überexprimierende Zellen erzeugt werden und der Nachweis unterschiedlich starker Expression des Proteins in verschiedenen Geweben nachgewiesen werden. Unter anderem zeigte sich eine gute Expression in Plazentagewebe. Welches auch wegen guter Verfügbarkeit zur Reihensequenzierung von 25 Proben genutzt wurde. Es zeigten sich 28 Synonyme und 85 Veränderungen im Gencode welche Einfluss auf die Primärsequenz des Proteins haben. Diese wurden alle in einer berechneten Grafik des Proteins zusammengefasst und dargestellt. In drei Situationen bildete sich anstatt des Wechsels einer Aminosäure ein Stopcodon. Dies trat jedoch nie homozygot auf. So das immer ein vollständiges Protein vorhanden war. In Anlehnung an vergleichbare Studien könnte dies mit ein Grund der differenten Wirkung von NSAIDs sein. Umfangreichere Beweise können in weiteren Studien noch folgen.
Die gleichzeitige Gabe von Arzneimitteln kann durch Inhibition oder Induktion von intestinalen Transportproteinen bzw. metabolischen Enzymen unerwünschte Arzneimittelinteraktionen verursachen. Bewirkt wird der induktive Effekt durch die Aktivierung von nukleären Rezeptoren wie PXR. Aktuell sind keine in vitro-Modelle verfügbar, die die Interaktion auf intestinaler Ebene infolge von Induktionsprozessen prognostizieren können. Für intestinale Absorptions- und inhibitorische Arzneistofftransportstudien werden bisher die häufig genutzten Caco-2-Zellen verwendet, da sie enterozytenartige Eigenschaften besitzen. Allerdings gibt es einige Unklarheiten, die das Caco-2-Modell betreffen, wie bspw. der optimale Zeitraum der Zellkultivierung, das fragliche Vorhandensein von nukleären Rezeptoren und die umstrittene Repräsentanz von Colon-Karzinomzellen für den intestinalen, jejunalen Arzneimitteltransport.
Ziel dieser Arbeit war es somit, die Eignung der präklinisch genutzten Caco-2-Zellen als in vitro-Modell für Transporter-bedingte Arzneimittelinteraktion und intestinalen Arzneimitteltransport zu untersuchen. Hierzu wurde die Expression klinisch relevanter intestinaler Arzneistofftransporter, Metabolisierungsenzyme und nukleärer Rezeptoren in Caco-2-Zellen auf Gen- und Proteineben mittels real time-RT PCR (TaqMan®-Prinzip) und LC-MS/MS-basiertem targeted proteomics bestimmt und mit der Expression in humanem Jejunum verglichen. Ferner wurde die Expression der erwähnten Determinanten in Abhängigkeit von der Kultivierungszeit und nach Induktion mit den prototypischen Induktoren Carbamazepin, Efavirenz, Hyperforin, Hypericin und Rifampicin untersucht. Zuletzt wurde der Einfluss der Induktoren auf die Funktion des Transporters ABCB1, anhand eines bidirektionalen Transportassays mit den radioaktivmarkierten ABCB1-Substraten [3H]-Digoxin und [3H]-Talinolol, ermittelt.
Die Expression der Transporter und nukleären Rezeptoren auf Gen- und Proteinebene in Caco-2-Zellen unterschieden sich deutlich zu der von jejunalem Gewebe. Für die Transporter ABCB1, ABCC2, OATP1A2, OATP2B1, PETP1 und das Enzym UGT1A1 konnte eine signifikante Zunahme der mRNA-Expression mit der Dauer der Kultivierungszeit festgestellt werden, die auf Proteinebene nicht gezeigt werden konnte. Die Induktoren Carbamazepin, Hyperforin, Hypericin und Rifampicin wiesen einen Effekt auf die mRNA-Expression, nicht aber auf die Proteinmenge der Transporter auf. In Übereinstimmung zu den Befunden der fehlenden Transporterinduktion konnte kein Effekt der Induktoren auf die Funktion von ABCB1 beobachtet werden.
Caco-2-Zellen sind daher nicht als in vitro-Modell geeignet um Arzneimittel-interaktionen prognostizieren zu können, die durch die Induktion von Transportern entstehen.
Das P-Glykoprotein stellt ein wichtiges membranäres Transportprotein zum Schutz des Organismus vor Xenobiotika sowie toxischen endogenen Metaboliten dar und ist an der Aufrechterhaltung der Barrierefunktion von Blut-Gewebe-Schranken beteiligt. Außerdem beeinflussen Pgp-vermittelte Transportvorgänge die Pharmakokinetik einiger Arzneimittel. Eine Modulation der Pgp-Funktion ist in vielerlei Hinsicht von Bedeutung. Daher war es Ziel dieser Arbeit, die Interaktionen zweier unterschiedlicher Substanzen, des mit der AD assoziierten Beta-Amyloids und des Arzneistoffes Heparin, mit dem Pgp zu untersuchen und die modulatorischen Fähigkeiten auf die Aktivität des Effluxtransporters in einem Zellsystem zu bewerten. Dafür stand eine polar wachsende, mit humanem MDR1-transfizierte Zelllinie zur Verfügung, die sich zur Untersuchung des transepithelialen Transportes eignete. Bei der Durchführung der funktionellen in-vitro-Assays ließen sich eine signifikant verstärkte Akkumulation, ein signifikant inhibierter apikaler Efflux von Rh123 und die signifikant verminderte ATP-abhängige Rh123-Aufnahme in Membranvesikel in Gegenwart von UFH sowie LMWH im Pgp-überexprimierenden Epithelzellmodell nachweisen. Ein direkter Transport markierter Heparine konnte ebenso gezeigt werden. Als Kontrolle dienten zum Einen parentale LLC-PK1, zum Anderen zeigten vergleichende Betrachtungen bekannter Pgp-Modulatoren wie Verapamil oder CsA in diesen Transportversuchen ähnliche Ergebnisse. Neben inhibitorischen Effekten der Aβ-Peptide auf die Pgp-Funktion konnte ein direkter aktiver Pgp-vermittelter Transport von synthetischem Aβ1-40 und Aβ1-42 gezeigt werden. Sowohl in polarisierten Zellmonolayern aus MDR1-transfizierten LLC-Zellen, die als in-vitro-Modell für das vaskuläre Endothel der Blut-Hirn-Schranke dienen, als auch in aus den Zellen isolierten Membranvesikeln konnte ein vektorieller bzw. ATP-abhängiger Transport der fluoreszenzmarkierten Peptide nachgewiesen werden. Eine Beteiligung des Pgp wurde anhand der Minderung des Transportes durch den spezifischen Inhibitor CsA verifiziert. Damit stellen sowohl die Heparine als auch die Beta-Amyloide nicht nur Inhibitoren des Pgp-vermittelten Transportes dar, sondern können selbst zum breiten Spektrum der affinen Pgp-Substrate gezählt werden. Sie bewirken eine nachgewiesene pharma-kologische Modulation der Pgp-Aktivität und bieten Anhaltspunkte für weitere Untersuchungen der komplexen Funktionen des Transportproteins.
Das Multidrug Resistance Protein 4 (MRP4/ABCC4) ist als Mitglied der ABC-Transporterfamilie nicht nur an dem Transport zahlreicher Pharmaka, wie beispielsweise antiviraler und zytostatischer Substanzen, sondern auch an Signaltransduktionsprozessen, z.B. dem Transport von Eicosanoiden und zyklischen Nukleotiden beteiligt. MRP4 weist außerdem innerhalb der ABCC-Gruppe ein einmaliges Expression-, Lokalisations- und Substratspektrum auf. MRP4 wurde neben Prostata, Niere, Gehirn und Leber auch in Blutplättchen nachgewiesen und kann zelltypabhängig sowohl apikal oder basolateral als auch intrazellulär lokalisiert sein. Insbesondere das Vorkommen in den δ-Granula der Thrombozyten ist bemerkenswert, da die Speicherung und Freisetzung von Überträgersubstanzen wie ADP auf die Thrombozytenfunktion entscheidenden Einfluss haben. Änderungen der zelltypischen MRP4-Lokalisation, die beispielsweise bei Patienten mit δ-storage pool Defekt beobachtet wurden, können zu einem Verlust der spezifischen Transporterfunktion führen. Das Ziel dieser Arbeit war es, das Transportprotein Multidrug resistance protein 4 in Bezug auf Protein-Protein-Wechselwirkungen genauer zu untersuchen. Da die Lokalisation von Membranproteinen u.a. durch die Wechselwirkung mit Proteinen gesteuert wird, stand die Identifikation möglicher Interaktionspartner von MRP4 mit Hilfe von Bindungs- und Kolokalisationsstudien im Vordergrund dieser Arbeit. Es schien sehr wahrscheinlich, dass Adaptormoleküle über eine Wechselwirkung mit MRP4 an dessen trafficking innerhalb der Zellen beteiligt sind und damit Einfluss auf dessen Lokalisation und konsekutiv auch auf die Funktion nehmen. Als mögliche Motive zur Vermittlung solcher Proteinbindungen liegen im MRP4-Molekül ein PDZ-Motiv sowie eine mögliche Bindungsstelle für Adaptorprotein (AP)-Komplexe vor. Zur Ermittlung solcher potentiellen Partner wurde eine Affinitätschromatographie durchgeführt. Dafür erfolgte die Kopplung eines Peptids, welches der C-terminalen Sequenz von MRP4 mit dem PDZ-Bindemotiv entsprach, an eine Sepharosematrix und eine anschließende Inkubation mit Thrombozytenlysat. Mittels Western Blot-Verfahren und Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie konnten im gewonnenen Eluat das ERM-bindende Phosphoprotein 50 (EBP50/NHERF1), Moesin, sowie das Post synaptic density protein 95 (PSD95) und das Hitzeschockprotein Hsp90 als mögliche Bindungspartner identifiziert werden. Während eine Wechselwirkung von MRP4 mit EBP50 über seine PDZ-Domäne bereits postuliert worden war, konnten insbesondere PSD95 und Hsp90 erstmalig als mögliche Interaktionspartner von MRP4 ermittelt werden. Da PSD95 bisher vorwiegend in neuronalen Zellen beschrieben wurde, wurde das Vorkommen dieses Proteins in Thrombozyten und der megakaryoblastischen Leukämiezelllinie M-07e auf RNA-Ebene untersucht und nachgewiesen. Damit konnte erstmals die Expression dieses scaffolding Proteins in Zellen der myeloischen Reihe gezeigt werden. Im Anschluss daran wurden Kofärbungen von MRP4 und den identifizierten Bindungspartnern durchgeführt. Die indirekte Immunfluoreszenzmikroskopie lieferte das Ergebnis einer zumindest partiellen Kolokalisation des Transporters mit Hsp90 – in Thrombozyten und M-07e-Zellen in intrazellulären Strukturen, in den Nierenepithelzellen LLC-PK1 und MDCKII in der Plasmamembran. Auch eine Kolokalisation von MRP4 mit PSD95 konnte in M-07e-Zellen und Thrombozyten beobachtet werden. Untersuchungen mit dem Hsp90-Hemmstoff Radicicol ergaben des Weiteren zum einen eine sichtbare Verringerung der MRP4-Expression im Western Blot nach der Inkubation, zum anderen auch eine Änderung der Lokalisation von Hsp90 und MRP4 in den verwendeten Nierenzelllinien nach intrazellulär. Ferner konnten funktionelle Transportversuche unter Verwendung von inside-out Thrombozytenmembranvesikeln einen Abfall der Aufnahme des radioaktiv markierten MRP4-Substrats cGMP in die Vesikel nach Behandlung mit Radicicol zeigen. Um den Einfluss von PSD95 auf die MRP4-Lokalisation zu untersuchen, wurde ein spezifischer knock-down von PSD95 mittels siRNA in M-07e-Zellen durchgeführt. Im Anschluss ergab sich in der Immunfluoreszenzmikroskopie eine deutliche Zunahme der MRP4-Lokalisation in der Plasmamembran. Zusammenfassend konnten im Rahmen dieser Arbeit EBP50, Moesin, PSD95 und Hsp90 als mögliche Bindungspartner von MRP4 in Thrombozyten identifiziert werden. Es ist denkbar, dass Hsp90 als Hitzeschockprotein möglicherweise zu der Prozessierung und Stabilisierung von MRP4 beiträgt. Die Interaktion mit PSD95 hingegen scheint die Internalisierung des Transportproteins zu begünstigen. Die gewonnenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass Protein-Protein-Interaktionen die Lokalisation und Funktion von MRP4 entscheidend beeinflussen.
In vielen wissenschaftlichen Studien konnte die Bedeutung des NO-cGMP-PKG-Signalweges für die Regulation der Spannung von glatten Muskelzellen gezeigt werden. Im Mittelpunkt standen dabei oftmals die Guanylatzyklase, die Proteinkinase G oder zelluläre Kalziumkanäle und deren Bedeutung für die Muskeltätigkeit. In der vorliegenden Arbeit sollte über Modulatoren der zelluläre cGMP-Spiegel in glatten Gefäßmuskelzellen von Ratten verändert und durch Messung der Kontraktionsstärken dessen Einfluss auf das Kontraktionsverhalten nachgewiesen werden. Dabei sollte sowohl die Auswirkung von cGMP-Veränderungen auf die Spannung bei maximaler Stimulation als auch auf die Sensitivität für Phenylephrin untersucht werden. Nach Inkubation der Aorten mit einem cGMP-Modulator und Stimulation mit Phenylephrin wurden die Kontraktionen von Aortenringen über Schreiber direkt aufgezeichnet. Als Modulatoren wurden das Urikosurikum Probenecid, der Phosphodiesterasehemmer Sildenafil und der Inhibitor der löslichen Guanylatzyklase ODQ eingesetzt. Ein besonderer Fokus sollte darauf gelegt werden, inwiefern die Hemmung der MRP-Transportproteine 4 und 5 durch Probenecid- und Sildenafilinkubation auf den cGMP-Spiegel und damit die Spannung der glatten Muskelzellen auswirkt. In den Aufzeichnungen der Kontraktionen zeigte sich unter ODQ-Einfluss eine deutlich gesteigerte Spannung in g pro g Aortengewebe (Mw=2761,44*; SEM=236,4; n=9) bei maximaler Stimulation mit Phenylephrin im Vergleich zur Kontrolle (1515,15; 186; n=9). Unter Vorinkubation mit Sildenafil konnten sowohl mit der geringeren Konzentration von 1 µM (689,15*; 163,3; n=5) als auch bei 50 µM (187,17*; 154,5; n=5) signifikant niedrigere Spannungen festgestellt werden. In höherer Konzentration kommt neben der Inhibition der PDE auch der hemmende Einfluss von Sildenafil auf die MRP-Transporter zum Tragen. Auch nach der Inkubation mit Probenecid konnte sowohl mit 10 µM (783,70; 150,7; n=5) als auch mit 100 µM (693,64*; 128,4; n=5) eine verminderte Kontraktion der Gefäße festgestellt werden. Die Untersuchung der Sensitivität der Aorten auf Phenylephrin über Vergleiche der EC50-Werte ergab, dass insgesamt durch den Einsatz von cGMP-Modulatoren keine Veränderungen der Sensitivität verursacht werden. Schlussfolgernd ergibt sich aus den Ergebnissen dieser Arbeit, dass glatte Gefäßmuskulatur über cGMP-Modulatoren hinsichtlich der Maximalspannungen beeinflussbar ist und dass der cGMP-Transport über MRP 4 und 5 für die Kontraktion von glatten Muskelzellen physiologisch bedeutsam zu sein scheint, was neue Möglichkeiten des medikamentösen Eingreifens in die Gefäßregulation eröffnen könnte.
Die bisherige pharmakologische Therapie von Opioid-induzierter Obstipation in der Schmerztherapie ist limitiert. Opioidrezeptorantagonisten könnten hier Abhilfe schaffen, in dem sie kausal in die Problematik eingreifen und somit zu einer besseren Lebensqualität bei vielen schmerzgeplagten Patienten führen. In klinischen Studien konnte eine Reduktion von intestinalen Transitzeiten nach subkutaner Methylnaltrexon-Gabe (MNTX) beobachtet werden. Auch orale Applikationsformen sowohl von MNTX als auch von Naloxon (NLX) stellten sich teilweise als wirksam dar. Daher war es das Ziel dieser Dissertation die Wirksamkeit hinsichtlich der Prävention einer Opioid-induzierten Obstipation von subkutaner und oraler Applikation von MNTX nach einmaliger Gabe miteinander zu vergleichen, sowie nach wiederholten Gaben die daraus resultierende effektivste Darreichungsform dem retardiert-freisetzenden NLX gegenüberzustellen. Dazu führten wir zwei kontrollierte, randomisierte, doppelblinde klinische Studien in gesunden Probanden durch. Die Obstipation wurde mit Loperamid (LOP) induziert. Die orozökale Transitzeit (OCT) und die Kolon-Transitzeit (CTT) wurden mit Hilfe von Sulfasalazin/ Sulfapyridin und röntgendichten Markern gemessen. Durch die LC-MS/MS-Methode konnten die Wirkstoffe bzw. deren Metaboliten in den Körperflüssigkeiten ermittelt werden und nachfolgend pharmakokinetische Parameter erhoben werden. In der single-dose-Studie konnten wir zeigen, dass retardiert freisetzendes MNTX (MNTX-ER) signifikant die LOP-induzierte Verzögerung im Intestinaltrakt antagonisiert. Subkutanes Methylnaltrexon (MNTX-SC) und schnell freisetzendes Methylnaltrexon (MNTX-IR) hatten keinen signifikanten Einfluss auf die OCT, CTT oder Gesamt-Darm-Transitzeit (WGT). (Publikation 1) Nach der mehrmaligen Applikation von MNTX-ER bzw. NLX-ER in der multiple-dose-Studie Studie konnte NLX-ER eine signifikante Reduktion der durch LOP verlängerten WGT herbeiführen, während MNTX-ER keinen nennenswerten Effekt erzielte. LOP verursachte nur kurzzeitig eine Erhöhung der Darmtransitzeiten. Es erfolgte nach der zweiten Applikation ein Gewöhnungseffekt. (Publikation 2) Aus diesem Grund erscheint LOP nicht geeignet eine anhaltende Obstipation zu induzieren. Die Toleranzentwicklung und auch die Entstehung der Obstipation bei Opioidtherapie lassen noch viele Fragen offen. Weitere Studien sowohl auf zellulärer Ebene als auch in der klinischen Anwendung werden folgen müssen um in diese komplexe Thematik mehr Licht zu bringen.
Das OATP2B1 stellt neben den überwiegend hepatisch exprimierten OATPs, wie dem OATP1B1 oder OATP1B3 einen weiteren interessanten Vertreter der SLCO-Familie dar. Dieser Aufnahmetransporter ist sowohl aus physiologischer, als auch aus pharmakologischer Sicht interessant, da er eine breite Gewebeverteilung aufweist und neben endogenen Substanzen eine Reihe verschiedener Wirkstoffe transportiert. Hinsichtlich seiner Expression und Funktion ist das OATP2B1 bereits gut charakterisiert, mögliche Regulationsmechanismen hingegen sind bisher kaum untersucht. Es war daher Ziel dieser Arbeit, neue Erkenntnisse über die Regulation dieses Transporters zu erlangen. Eine Möglichkeit die Funktion von Transportproteinen schnell zu verändern, ist die direkte Interaktion mit Substanzen, die in der Lage sind, die Transportfunktion zu modulieren. Dies können gleichzeitig verabreichte Arzneimittel, Nahrungsbestandteile, aber auch endogene Substanzen sein. In der vorliegenden Arbeit konnte hierzu gezeigt werden, dass die Transportfunktion des OATP2B1 durch Progesteron und Glukokortikoide stimuliert werden kann. Dieser Effekt ist sowohl substrat- als auch transporterspezifisch. So wird die Aufnahme sulfatierter Steroide, wie DHEAS oder E1S, OATP2B1-spezifisch stimuliert, wohingegen andere Substrate, wie Atorvastatin oder Glibenclamid nicht verstärkt transportiert werden. Während eine pharmakologische Bedeutung dieser OATP2B1-Interaktion nicht zu erwarten ist, könnte die physiologische Bedeutung in der Aufnahme von Steroidhormonvorläufern in die Plazenta liegen. Diese ist nicht in der Lage C21-Steroide, wie Pregnenolon oder Progesteron in C19-Steroide zu transformieren und daher auf Vorläufermoleküle, wie DHEAS oder Preg-S, für die plazentare Estrogensynthese, angewiesen. Im Rahmen dieser Arbeiten konnten mit Glibenclamid und Preg-S zwei weitere OATP1A2-Substrate identifiziert werden. Des Weiteren wurde der zugrunde liegende Mechanismus der Proteinkinase C (PKC)-abhängigen Internalisierung des OATP2B1 näher untersucht. Es konnte aufgeklärt werden, dass das OATP2B1, nach Aktivierung der PKC, Clathrin-abhängig internalisiert und anschließend lysosomal degradiert wird. Eine direkte Phosphorylierung des OATP2B1 als Ursache für die Internalisierung wurde weitestgehend ausgeschlossen, so dass in der Folge mögliche Internalisierungssignale und Adapterproteine des OATP2B1 untersucht wurden. Mittels in silico Analyse konnte ein Dileucinmotiv (EQQLLV), sowie eine Klasse-I-PDZ-Bindedomäne (DSRV) im Bereich des C-Terminus des Proteins identifiziert werden. Eine Beteiligung an der PKC-abhängigen Internalisierung des OATP2B1 konnte hier zwar nicht beobachtet werden, jedoch zeigte sich, dass es für die basolaterale Sortierung des Proteins von Bedeutung ist. So wies die Dileucinvariante eine ausschließlich apikale Plasmamembran-Lokalisation auf, ohne die Transportfunktion des Proteins zu beeinflussen. Parallel wurden mittels pull-down Experimenten C-terminale Adapterproteine des OATP2B1 identifiziert. In diesem Zusammenhang wurde zudem die Rolle des Dileucinmotivs, als mögliche Bindungsstelle für Adapterproteine, die die basolaterale Sortierung vermitteln, untersucht. Unter denen mittels Massenspektrometrie identifizierten Proteinen befanden sich einige, wie Aktin oder Hsc70, die mit der Clathrin-vermittelten Endozytose assoziiert sind. Weiterhin wurden SNX27, NHERF1 und Grp75 als Adapterproteine identifiziert und näher untersucht. Hier konnte teilweise eine Interaktion bestätigt werden, eine funktionelle Relevanz ließ sich jedoch nicht nachweisen. Insgesamt liefert diese Arbeit wichtige grundlegende Erkenntnisse zur Regulation der OATP2B1-Funktion. Weitere Studien sind jedoch notwendig, um dessen physiologische und pharmakologische Relevanz zu beurteilen.
Bei der Aufnahme von Arzneimitteln in Zellen spielen Transportprozesse eine große Rolle. Das ATP-abhängige Transportprotein P-Glykoprotein vermittelt häufig Resistenzen gegenüber Arzneimitteln. Zunächst wurde dieser Effekt in P-Glykoprotein-überexprimierenden Tumoren entdeckt. Auch viele gesunde Gewebe enthalten P-Glykoprotein. Einige der Substanzen, die von P-Glykoprotein transportiert werden, sind vielverwendete Medikamente bei der Therapie von Herzerkrankungen. Die individuelle Expressionhöhe von P-Glykoprotein im Herzen könnte für das unterschiedliche Ansprechen von Patienten auf von P-Glykoprotein transportierte Medikamente verantwortlich sein. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Expression von P-Glykoprotein an 15 humanen Herzgewebeproben untersucht. Verwendet wurde die Methode der RT-PCR und die immunhistochemische Darstellung des Proteins. Die Expression von P-Glykoprotein in humanem Herzmuskelgewebe konnte an allen Proben gezeigt werden. Immunhistochemisch ist P-Glykoprotein in den Endothelzellen der Arteriolen und Kapillaren lokalisiert worden. Hinsichtlich der Expression bei verschiedenen Krankheiten konnte bei Patienten mit einer dilatativen Kardiomyopathie eine signifikante Verminderung (p = 0,05) beobachtet werden. Die gewonnenen Ergebnisse zeigen eine Beteiligung des Herzens an Transportprozessen. Intrakardiale Konzentrationen vieler Substanzen können abhängig von der individuellen P-Glykoprotein-Expression beeinflusst werden
Azathioprin und 6-Mercaptopurin sind wichtige Arzneimittel in der Therapie onkologischer und inflammatorischer Erkrankungen. Die Wirksamkeit dieser Medikamente ist im Wesentlichen von der Bildung aktiver Metabolite, sog. Thioguaninnukleotide (TGN), abhängig. Diese sind die Summe von Thioguanosinmonophosphat (TGMP), Thioguanosindiphosphat (TGDP) und Thioguanosintriphosphat (TGTP). Im Jahr 2005 wurde erstmals berichtet, dass das Ansprechen der Thiopurintherapie bei Patienten mit chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen vom Verhältnis der Metabolite Thioguanosindiphosphat (TGDP) zu Thioguanosintriphosphat (TGTP) abhängt (Neurath et al. Clin Gastroenterol Hepatol. 2005 Oct;3(10):1007-14). Es wird angenommen, dass die Konversion von TGDP zu TGTP durch das ubiquitär exprimierte Enzym Nukleosid Diphosphat Kinase (NDPK) katalysiert wird. Die interindividuelle Variabilität der humanen NDPK-Expression bzw. -Funktion und deren Bedeutung für den Thiopurinmetabolismus sind bisher nicht systematisch untersucht worden. Daher war es Ziel der vorliegenden Arbeit, zuerst den Nachweis zu führen, dass die Konversion von TGDP zu TGTP durch die NDPK katalysiert wird. Im Anschluss daran erfolgte eine systematische Analyse der interindividuellen Variabilität der relevanten NDPK-Isoformen, NDPK A und NDPK B, in verschiedenen humanen Geweben (Leber und Blutzellen). Dabei sollte auch der Einfluss von genetischen, nicht genetischen sowie epigenetischen Faktoren auf die Variabilität der NDPK-Expression untersucht werden. Dafür wurden zunächst die NDPK-Isoformen NDPK A und NDPK B rekombinant exprimiert und ein high performance liquid chromatographie (HPLC)-Assay zur Bestimmung der NDPK-Aktivität etabliert. Die Quantifizierung der NDPK-Expression auf mRNA- und Proteinebene wurde mit Hilfe von quantitativer real-time PCR bzw. durch indirekte Immunodetektion der Isoformen mit spezifischen Antikörpern durchgeführt. Um den Einfluss von genetischen und epigenetischen Faktoren auf die NDPK A bzw. B Expression zu untersuchen, wurden die Genbereiche von NDPK A (NME1) und NDPK B (NME2) sequenziert bzw. mittels Matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) analysiert. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, die beiden NDPK-Isoformen NDPK A und NDPK B in E.coli rekombinant zu exprimieren. Mithilfe des validierten HPLC-Assays zur Bestimmung der NDPK-Aktivität konnte gezeigt werden, dass beide Isoformen die Konversion von TGDP zu TGTP katalysieren können. Durch Quantifizierung der mRNA- und Proteinexpression von NDPK A und NDPK B sowie der Bestimmung der NDPK-Aktivität wurde eine systematische Analyse zur Phänotyp- (Expression bzw. Funktion) Genotyp Korrelation dieser Enzyme in humaner Leber bzw. Blutzellen durchgeführt. Dabei zeigte sich eine ausgeprägte interindividuelle Variabilität für die NDPK A- und NDPK B-Expression auf RNA und Proteinebene für beide Gewebetypen. Bei der Sequenzierung der relevanten Genbereiche für die NDPK A (NME1) wurden zahlreiche genetische Varianten identifiziert, darunter zwei bisher noch nicht beschriebene Varianten im Promotorbereich. Für die NDPK B (NME2) konnte nur eine einzige genetische Variante detektiert werden. Mit Hilfe eines neu etablierten 16-plex MALDI-TOF MS Assays wurden genomische DNA-Proben der humanen Leberbank bzw. DNA aus Blutzellen auf diese gefundenen Varianten genotypisiert. Für zwei Promotorvarianten von NME1 konnte ein signifikanter Einfluss auf die NDPK A-Expression gezeigt werden, diese wurden mittels electromobility shift assays (EMSA) auf Verlust der DNA-Bindungskapazität von Kernproteinen untersucht. Darüber hinaus wurde bei der Analyse verschiedener nicht genetischer Faktoren (z. B. Alter, Geschlecht, Raucherstatus, Alkoholkonsum, Medikation und Diagnose), ein signifikanter Einfluss auf die NDPK A- bzw. NDPK B Expression in humanen Leberproben von Patienten mit cholestatischen Leberparametern beobachtet. Untersuchungen zur Methylierung der NME1-Promotorbereiche mit einer hohen Dichte an CpG-Dinukleotiden, den sog. CpG-Inseln, konnten keinen signifikanten Einfluss des Methylierungsstatus auf die NME1/NDPK A-Expression zeigen. Ergänzende Untersuchungen mit Centre dÉtude du Polymorphisme Humain (CEPH)-Zelllinien bestätigten eine ausgeprägte Variabilität der NDPK A- und NDPK B Expression, die durch genetische Varianten nicht erklärt werden konnte.
Zur Eignung von Gd-EOB-DTPA zur Visualisierung des Transportes von Arzneimitteln zum Ort der Wirkung
(2013)
Gadolinium-Ethoxybenzyl-Diethylentriaminpentaessigsäure (Gd-EOB-DTPA) ist ein leberspezifisches Magnetresonanztomographie (MRT)-Kontrastmittel. Es ist ein häufig in der Klinik eingesetztes Diagnostikum bei fokalen Leberläsionen. Im Vergleich zu anderen Gadolinium-haltigen Kontrastmitteln wird Gd-EOB-DTPA spezifisch von gesunden Hepatozyten aufgenommen. Somit ist es bei der Erkennung von hepatischen Tumoren von großer Bedeutung. Nach einer Bolusinjektion wird Gd-EOB-DTPA bis zu 50% über die Galle und 50% über die Nieren ausgeschieden. Die Mechanismen der hepatischen Aufnahme und der biliären Elimination sind bisher nur unzureichend verstanden. Ein weiterführendes Verständnis ist aber auch nötig, um die großen interindividuellen Unterschiede der Leberanreicherung von Gd-EOB-DTPA bei Patienten zu erklären und auch mögliche Arzneimittelinteraktionen vorhersagen zu können. Deswegen war das Ziel der vorliegenden Dissertation, erstens die Transportmechanismen des Kontrastmittels in in vitro Experimenten und dabei sowohl die Aufnahme- also auch die Effluxtransporterproteinen zu untersuchen. Zweitens wurde ein Tierexperiment in Wildtyp- und Abcc2-definzienten Ratten durchgeführt, um die Mechanismen der hepatobiliären Elimination von Gd-EOB-DTPA zu untersuchen und den intestinalen Arzneimitteltransportweg mit Hilfe des bildgegebenden Verfahrens MRT zu visualisieren. Diese in vitro-Untersuchungen zeigten, dass Gd-EOB-DTPA ein Substrat der leberspezifischen Transporter OATP1B1, OATP1B3 und NTCP, aber nicht des ubiquitären OATP2B1 ist. Hiermit kann die hohe Leberspezifität des Kontrastmittels erklärt werden. In vitro wurde Gd-EOB-DTPA von allen genetischen Varianten des OATP1B1 mit unterschiedlichen Km-Werten aufgenommen, wobei die *1b Variante eine signifikant erhöhte Transportkapazität im Vergleich zum Wildtyp (WT) zeigte. Allerdings sieht man bei OATP1B1*5 (nicht signifikant) und *15 (signifikant) eine verringerte Aufnahme von Gd-EOB-DTPA. Bei OATP1B3, zeigte die Variante p.233Ile eine signifikant niedrigere Substrat-Affinität in vitro. Gd-EOB-DTPA wurde über den Polymorphismus p.112Ala/233Ile mit einer signifikant niedrigeren Transportaktivität aufgenommen im Vergleich zum WT. Nach intravenöser Applikation von Gd-EOB-DTPA in Wildtyp- und Abcc2-defizienten Ratten wurde gezeigt, dass Abcc2 eine zentrale Rolle für die hepatobiliäre Ausscheidung von Gd-EOB-DTPA spielt. Gleichzeitig wurde gezeigt, dass bei Abcc2-defizienten Ratten die Ausscheidung des Kontrastmittels vollständig über die Nieren kompensiert wird. In Abcc2-defizienten Ratten ist die Expression des in der basolateralen Membran der Hepatozyten exprimierten Effluxtransporters Abcc3 signifikant erhöht. In vitro konnte eine konzentrationsabhängige Aufnahme von Gd-EOB-DTPA in ABCC2- bzw. ABCC3-enthaltende inside-out Vesikel dargestellt werden. Abcc3 könnte ein Kandidat für den Rücktransport von Gd-EOB-DTPA aus den Hepatozyten ins Blut sein. ABCC2 und ABCC3 sind auch im Darm exprimiert. Da Gd-EOB-DTPA ein Substrat von ABCC2 und ABCC3 ist, wurde untersucht, ob das Kontrastmittel auch im Darm absorbiert wird und somit die Absorption von Arzneimitteln visualisiert werden könnte. Nach oraler Gabe wurde Gd-EOB-DTPA im Darm der Ratten hinreichend absorbiert (Bioverfügbarkeit 17%). Für den intestinalen Efflux scheint ABCC2 von großer Bedeutung zu sein. Denn nach oraler Applikation stieg die Bioverfügbarkeit von Gd-EOB-DTPA in Abcc2-defizienten Ratten von 17% auf 25%. Zusammenfassend konnte die vorliegende Dissertation verdeutlichen, dass Gd-EOB-DTPA ein in vitro-Substrat der leberspezifischen Transporter OATP1B1, OATP1B3 und NTCP ist und auch von OATP1A2, ABCC2 und ABCC3 prozessiert wird. Der Arzneistoff ist somit ein gutes Beispiel für das komplexe Wechselspiel von intestinalem und hepatischem Aufnahme- und Effluxtransport, welcher für zahlreiche Stoffe bereits gut etabliert ist (z.B. Statine, Ezetmib). Es konnte gezeigt werden, dass die leberspezifische Aufnahme von Gd-EOB-DTPA über OATP1B1 und OATP1B3 realisiert wird, wohingegen ABCC2 den wesentlichen Effluxtransporter der hepoatobiliären Elimination darstellt. Die Arbeit konnte des Weiteren zeigen, dass genetische Varianten eine plausible Erklärung für die in der klinischen Praxis beobachtete hohe interindividuelle Variabilität der Leberanreicherung wären. Basierend auf den in vitro- und in vivo-Ergebnissen erweist sich, Gd-EOB-DTPA als neues „probe drug“, um den Absorptionsweg von Arzneimitteln zu visualisieren und die Funktion der Transporter zu charakterisieren.