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The introduction of two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2-D PAGE) enabled the separation and visualization of a substantial fraction of an organism’s entire proteome, and when mass spectrometry entered protein science, these proteins became even amenable to identification on a grand scale. Nevertheless, important classes of proteins elude a separation on classical 2 D gels, as the ones showing extremes in isoelectric point or molecular weight, and foremost very hydrophobic proteins naturally embedded in lipid membranes. This thesis aimed at the establishment and adaptation of alternatives to 2-D PAGE. New techniques allowing for an identification and quantification of critical protein classes were designed and adopted to physiological questions in the Gram-positive bacteria Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus. In a comprehensive study on cytoplasmic proteins of S. aureus COL the number of proteins identified by a 2-D gel based approach could be extended by 650 proteins employing gel free technologies. Application of these complementary methods resulted in the establishment of a comprehensive reference map of the cytosolic proteome in growing and non-growing S. aureus cells which can serve as basis for further physiological investigations. Gel free separation of complex protein digests was likewise used in a quantitative study on heat stress in B. subtilis. By implementation of the iTRAQ® technology four different physiological states could be relatively quantified in one experiment. A parallel generation of 2-D gel based data enabled the depiction of strengths and weaknesses of protein quantitation by both, spot intensities on 2-D gels and iTRAQ® signal intensities in MS/MS spectra. Furthermore, new insights into heat sensitivity of pivotal enzymes involved in amino acid biosynthesis could be delivered. The institution of gel free approaches and advancements in 2-D PAGE provide the tools to penetrate into yet unamenable scopes of proteomes. A review on proteome coverage in B. subtilis gives an overview on the strategies which have been explored for most comprehensive protein identification in various sub-proteomes. Although more than one third of B. subtilis’ open reading frames could be demonstrated on protein level, one has to be aware of the fact that it still is a long way to achieve complete coverage of its proteome. Integral membrane proteins make up about one quarter of the entirety of proteins in a cell. Despite their large portion they are clearly understudied due to the intricacy of identification. Their low abundance and non-accessibility of membrane-spanning domains represent major experimental difficulties. The establishment of a protocol efficiently depleting cytosolic proteins by membrane shaving and targeting trans-membrane peptides by novel digestion strategies essentially facilitated identification of highly hydrophobic integral membrane proteins. This protocol was not only successfully applied to the membrane proteome of growing S. aureus cells, but was shown to be applicable in B. subtilis as well. Both studies displayed the novel membrane shaving approach to be highly complementary to a previously established separation of membrane proteins via 1 D PAGE. A combination of the two techniques resulted in identification of about half of the theoretical membrane proteome in both bacteria, and hence layed the foundation for advanced and quantitative analyses. In this regard, 14N/15N metabolically labeled membrane samples of growing and non-growing cells of S. aureus COL were relatively quantified revealing a significant difference in amount for more than one third of the proteins. A corresponding experimental setup was used to compare the membrane proteomes of S. aureus SA113 and its mutant deficient in the lysylphosphatidylglycerol synthetase MprF. Interesting quantitative differences were obtained for proteins most likely involved in the regulation of cellular surface net charge as well as for virulence-associated proteins.
Staphylococcus aureus ist einer der bedeutendsten Erreger von Infektionen der Milchdrüse (Mastitis). In dieser Arbeit wurden 16 S. aureus-Isolate aus bovinen Mastitisinfektionen unterschiedlicher geografischer Herkunft umfassend charakterisiert, um tiefere Einblicke in die Wirtsspezifität von S. aureus zu erlangen. Das bovine Mastitisisolat S. aureus RF122, dessen Genomsequenz seit kurzem verfügbar ist, wurde zum Vergleich in die Studien einbezogen. Mittels Multilocus Sequence Typing wurde die klonale Verwandtschaft der Stämme analysiert und ihre Zugehörigkeit zu bestimmten Sequenztypen bzw. klonalen Komplexen ermittelt, von denen einige unter bovinen S. aureus-Isolaten weltweit sehr verbreitet sind.Zum Nachweis von virulenz- und resistenzassoziierten Genen, sowie regulatorischen und speziesspezifischen Markergenen wurde ein diagnostischer DNA-Microarray eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass das individuelle Profil der Isolate sehr stark variierte und sich selbst Stämme mit dem gleichen Sequenztyp in ihrem variablen Genom teilweise erheblich unterschieden. Nur 43 Gene, die u.a. für Hämolysine, Proteasen, Leukocidine kodieren, waren in allen Stämmen konserviert. Es wurde auch die Existenz einiger als bovin-spezifisch angesehener Gene, bzw. die Abwesenheit humanspezifischer Gene nachgewiesen. Zusätzlich wurde die Expression von Virulenzfaktoren mittels 2D-Gelelektrophorese und massenspektrometrischer Identifizierung analysiert. Wie erwartet unterschieden sich die extrazellulären Proteommuster der einzelnen Stämme stark. Nur zwölf sekretierte Proteine wurden (in unterschiedlicher Menge) von mindestens 80 % der bovinen Isolate gebildet, und bilden das sogenannte „Core-Exoproteom“. Auch Isolate mit nahezu identischer genetischer Zusammensetzung unterschieden sich z.T. erheblich in ihrem Exoproteom, was sehr gut mit der Transkription des Virulenzgenregulators RNAIII korrelierte. Weiterhin wurde die mitogene Wirkung der Kulturüberstände auf humane und bovine PBMC (mononukleäre Zellen aus peripherem Blut) untersucht. Dabei fiel auf, dass zwei Isolate, welche Gene der bovinen Pathogenitätsinsel SaPIbov trugen, bovine T-Zellen stärker als humane stimulierten, was auf wirtsspezifische Unterschiede in der Aktivität dieser Superantigene hindeutet. Schließlich konnten durch den Vergleich mit S. aureus-Isolaten aus humanen Infektionen bestimmte Proteine ermittelt werden, die häufiger mit einem bestimmten Wirt assoziiert sind. Die Variabilität in der Expressionshäufigkeit dieser Proteine könnte mit der Wirtsspezifität von S. aureus im Zusammenhang stehen. Als pathogener Mikroorganismus ist S. aureus hohen Konzentrationen an reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffspezies (ROS und RNS) ausgesetzt, die im Rahmen der unspezifischen Wirts-Immunantwort gebildet werden. Um das Verständnis über seine Anpassungsstrategien zu erweitern, wurden vier Substanzen, die oxidativen bzw. nitrosativen Stress verursachen, eingesetzt: Wasserstoffperoxid (H2O2), eine Vorstufe des stark toxischen Hydroxylradikals; Diamid, ein spezifisches Thiol-Oxidationsmittel, die Superoxidanion-generierende Substanz Paraquat, sowie der NO-Donor MAHMA NONOate. Für jeden Stressor wurden Proteomsignaturen durch Auftrennung der cytoplasmatischen Proteine mittels 2D-Proteingelelektrophorese und anschließender massenspektrometrischer Identifizierung erstellt. Die zu verschiedenen Zeitpunkten nach Stressauslösung neu synthetisierten Proteine wurden mittels L-[35S]-Methionin radioaktiv markiert und quantifiziert. Mindestens zweifach induzierte Proteine wurden als Markerproteine für einen bestimmten Stressor definiert. Durch Zugabe von 10 mM H2O2 wurden verstärkt Proteine synthetisiert, die an Synthese, Reparatur oder Schutz von Nukleinsäuren oder DNA beteiligt sind, was bestätigt, dass die DNA ein Hauptziel H2O2-induzierter Schädigung ist. Unter Einfluss von 10 nM Paraquat wurden Proteine mit sehr unterschiedlichen biologischen Funktionen, wie z.B. Aminosäuresyntheseenzyme und Cofaktoren, induziert. Der durch 1 mM Diamid induzierte Thiolstress führte wie erwartet zur verstärkten Neusynthese CtsR und HrcA-kontrollierter Chaperone und Proteasen, was auf die Akkumulation fehlgefalteter Proteine hindeutet, die höchstwahrscheinlich durch nichtnative Disulfidbrücken an den Thiolgruppen der Cysteinreste entstanden sind. Die Induktion von Peroxiredoxinen und einer Thioredoxinreduktase lassen auf ein gestörtes Redoxgleichgewicht in der Zelle schließen. Die Effekte von NO ähnelten denen, die auch unter Sauerstofflimitation beobachteten wurden. Viele Markerproteine sind in Glykolyse und Fermentation involviert und durch Nachweis der entsprechenden Fermentationsprodukte konnte eine höhere Aktivität fermentativer Stoffwechselwege bestätigt werden. Die Fähigkeit, unter Einfluss von NO auf anaeroben Metabolismus umzuschalten, könnte ein entscheidender Vorteil von S. aureus und essentiell für seine höhere Resistenz gegenüber NO sein.
A physiological proteomic approach to address infection-related issues of Gram-positive bacteria
(2012)
Trotz der vielen wissenschaftlichen Fortschritten sind Infektionskrankheiten auch heute noch die Haupttodesursache weltweit. Sie haben nicht nur heute, sondern werden auch in der Zukunft eine große epidemiologische Bedeutung haben. Die komplexe Infektionsthematik sollte unter zwei Gesichtspunkten betrachtet werden: der Prävention und der Behandlung. Zur Prävention von Infektionen zählen neben der Dekontamination und Sterilisation auch die Impfungen sowie die Hygiene- und Gesundheitsaufklärung. Bei der Behandlung von Infektionen kann auf Antibiotika zurückgegriffen werden, wenn das humane Immunsystem die Infektionen nicht auf natürliche Weise bekämpfen kann. Zwischen 1969 und 2000 wurde kein neues Antibiotikum den bereits vorhandenen Antibiotikaklassen hinzugefügt. Parallel zu dieser schwindenden Antibiotikaforschung, verbreiten sich nosokomiale Infektionen und community-acquired (vor allem Methicillin-resistente) Infektionen rapide. Von besonderer Bedeutung ist die Grundlagenforschung an infektionsassoziierten Mikroorganismen, wie dem humanen Erreger Staphylococcus aureus. Im Zusammenhang mit Infektionen spielen Virulenzfaktoren eine entscheidende Rolle. Sie sind entweder an der Zelloberfläche platziert oder werden aktiv ins Medium sekretiert. Um das pathogene Potential von S. aureus besser zu verstehen und aufzuklären ist ein Verständnis über die Proteintransportwege essentiell. Momentan sind die Transportwege von Escherichia coli (Gram-negative) und Bacillus subtilis (Gram-positive) am besten charakterisiert. Viele Transportwegekomponenten wurden mittels Transkriptions und Proteomeanalysen auch in S. aureus konserviert gefunden und ermöglichten dadurch einen ersten Einblick in die Sekretionsmaschinerie. Das Verständnis, warum und wie Virulenzfaktoren Infektionen auslösen birgt ein großes Potential in der Suche nach verbesserter Infektionskontrolle und Behandlung. Kontaminierte medizinische Arbeitsmittel, wie zum Beispiel Katheter oder Endoskope können auch eine auslösende Quelle von Infektionen sein. Diese medizinischen Arbeitsmittel oder Geräte bestehen immer häufiger aus bio-kompatiblen Polymeren (z.B. Polyethylen (PE) oder Polyethylenterephthalat (PET). Diese thermosensitive Polymere können keinen hohen Temperaturen ausgesetzt werden, ohne dass sie beschädigt werden. Damit sind herkömmliche Sterilisationsverfahren (z.B. Autoklavieren) nicht anwendbar. Alternative chemische Verfahren (z.B. Ethylenoxid-Sterilisation) sind mit Nebenwirkungen und Risiken verbunden, die im medizinischen Bereich nicht akzeptabel sind. Alternative Dekontaminationsverfahren für diese thermosensitive Materialen sind also gefragt. Hierbei rückt das Niedertemperaturplasma (NTP) nicht nur bei den Physikern sondern auch bei den Biologen und Medizinern immer weiter in den Fokus der Forschung. NTP, welches unter atmosphärischen Druck erzeugt wird, ist aus einer Vielzahl von antimikrobiell aktiven Agentien und chemischen Produkten (z.B. atomarer Sauerstoff (O), Ozon (O3), Hydroxyl (OH), reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und reaktive Stickstoffspezies (RNS)) zusammengesetzt und stellt damit ein wirksames Mittel für die mikrobielle Dekontamination dar. Seit einiger Zeit wird NTP auch erfolgreich bei der Wundbehandlung angewendet. Erste Studien zeigen ein großes Potential von NTP-Wundbehandlungen in Hinblick auf verbesserte Wundheilung. Die Anwendung von Plasma in der Medizin könnte ganz neue Perspektiven eröffnet- das ist zumindest die Vision. Auf der praktischen Seite gibt es allerdings noch eine Vielzahl von offenen Fragen: (i) welche Art von Plasma ist für welchen Zweck am besten geeignet; (ii) was sind die Vorteile von Plasma im Vergleich zu gängigen medizinischen Behandlungen; (iii) ist Plasma ein ökonomische Alternative im Vergleich zu gängigen Anwandelungen und Standards? Bevor Plasma sicher und routinemäßig in Krankenhäusern zu Einsatz kommen kann ist es zusätzlich von größter Wichtigkeit den Einfluss von Plasma auf Zellen zu klären. Erst wenn die Plasma-Zell-Interaktion (pro- und eukaryotische Zellen) grundsätzlich untersucht und verstanden ist kann eine sichere, erfolgreiche und vor allem akzeptierte Implementierung in den Krankenhausalltag stattfinden.
Bacterial infections represent an increasing threat in human health and hospital- acquired infections meanwhile account for 99,000 deaths every year in the United States (Ventola, 2015). Live-threating bacterial infections will certainly emerge to an even more serious concern in future, essentially by accelerated development of antibiotic resistance. Only recently, the discovery of plasmid-encoded mcr-1, that confers resistance against colistin, marks the point where this highly transmissible resistance mechanism is now reported for every so far developed antibiotic (Liu et al., 2016). Staphylococcus aureus is a Gram-positive bacterium and well-known for its ability to quickly acquire resistance toward antibiotics either by chromosomal mutations and/or horizontal gene transfer (Pantosti et al., 2007). Although approximately 30% of the population is colonized with S. aureus (Kluytmans et al., 1997), it can transform to an invasive pathogen that causes a wide range of severe infections including pneumonia. The success of S. aureus as opportunistic pathogen can be attributed to combinations of several beneficial properties and capabilities including the expression of an arsenal of virulence factors (Archer, 1998), intracellular persistence (Garzoni & Kelley, 2009) and subversion of host cell defense mechanisms (Schnaith et al., 2007). The airway epithelium is the first line of defense against bacterial pathogens by forming a relative impermeable physical barrier composed of epithelial cells that are linked by tight junctions, desmosomes and adherence junctions (Davies & Garrod, 1997). Additionally, the airway epithelium mediates the detection of bacterial pathogens via toll-like receptors (TLRs) that recognize a variety of bacterial molecular patterns such as lipopolysaccharide (LPS), peptidoglycan and flaggelin (Sha et al., 2012). This interaction is transduced via protein phosphorylations into the cell in order to promote adaptation to the infection by initiation of the adaptive and innate immune defense. Although few insights where obtained of the signaling host responses towards staphylococcal infections (Agerer et al., 2003; 2005; Ellington et al., 2001), a comprehensive description of the host signaling network is largely missing. Thus, this dissertation thesis focuses on the decipherment of phosphorylation-mediated signaling responses towards S. aureus infections in non- professional and professional phagocytes by mass spectrometry-based phosphoproteomic techniques. The results of this thesis are summarized in the four chapters. Chapter I introduces to recent advances in the development of methodologies applied in the field of phosphoproteomics, including quantification strategies, peptide fractionation techniques and phosphopeptide enrichment methods applied for the system-wide characterization of protein phosphorylations by mass spectrometry. Additionally, publications reporting phosphorylation-based host signaling responses towards bacterial pathogens or their molecular patterns that applied mass spectrometry-based phosphoproteomics are discussed. In chapter II, the responses of the human bronchial epithelial cell lines 16HBE14o- and S9 following challenge with staphylococcal alpha- toxin at the level of proteome and phosphoproteome are summarized. General and cell type-specific signaling events are highlighted and evidences linking the activity of the epidermal growth factor receptor (EGFR) with differences in tolerance toward alpha-toxin are provided. Chapter III describes the modulation of the host signaling network of 16HBE14o- airway epithelial cells triggered by infection with S. aureus including temporal dissection of signaling events. Several protein kinases were identified as important signaling hubs mediating the host response. Targeted pharmaceutical inhibition of these kinases was probed and resulted in reduction of intracellular bacterial load. Chapter IV describes the rearrangement of the kinome by the differentiation of THP-1 monocytes to macrophage-like cells by application of quantitative kinomics. This approach identified the kinase MAP3K7 (TAK1) as key mediator of bacterial clearance, chemokine secretion and the differentiation process itself.
Thiol or sulfhydryl groups are highly reactive functional groups in cellular systems. Molecules carrying thiol groups are mostly derivatives of the amino acid cysteine and are grouped as low molecular weight (LMW)-thiols: coenzyme A (CoA), glutathione (GSH) or bacillithiol (BSH). LMW-thiols can help in the maintenance of the reduced cellular environment as so called redox-buffers. Additionally, they act as co-factors in enzyme reactions or help in the detoxification of reactive oxygen or nitrogen species, electrophilic compounds or thiophilic metalloids (arsenite, tellurite). In proteins from different organisms cysteine is underrepresented compared to other amino acids, but still overtakes diverse roles. It is an important determinant in the tertiary and quaternary structure of proteins. The nucleophilic character of the thiol or thiolate group, respectively, makes cysteine the catalytically active amino acids of different enzymes. As a precursor cysteine participates in the formation of Fe-S clusters and coordinates different co-factors like heme, iron or zinc. The main goal of this study was the investigation of the different cellular thiol pools, now defined as the thiolome. The thiolome is the entity of the cellular thiol pools, i.e. LMW-thiols and protein thiols, and the dynamics between these pools. In Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus mixed disulfides between protein thiols and free LMW-thiols, so called S-thiolations, were identified in different proteins in response to the thiol specific reagent diamide. Some of these S-thiolations were located at catalytically active cysteine residues. Subsequent analysis of metabolites supports this: the S-thiolation of the cobalamine-independent methionine-synthase MetE led to a decrease of the cellular methionine content. Additionally, the conversion of threonine to different branched-chain amino acids (BCAAs) was disrupted by the S-thiolation of the branched-chain amino acid aminotransferase YwaA, thereby probably inducing the synthesis of ppGpp, the alarmon of the stringent response. In addition to the identification of S-thiolations a technique was established which allowed the discrimination between intra- and intermolecular disulfides. The non-reducing/ reducing diagonal gel electrophoresis was applied to B. subtilis and S. aureus and confirmed known existing disulfide bonds, e.g. in alkyl hydroperoxide reductase AhpC or the thiol peroxidase Tpx. In response to diamide an increase of specific disulfide bonds in different proteins was observed. The analysis of the LMW-thiol content by an HPLC-approach allowed the observation of the dynamics of the thiolome. In response to diamide the reduced LMW-thiol content decreased by 75%, reduced protein thiols by 60%. Collaborations with other working groups allowed the identification of BSH in this approach. Additionally, an unknown thiol was found that is likely a derivative of BSH. Screening of the LMW-thiol content of different S. aureus-strains under various growth conditions revealed that strains 8325-4 and SH1000 lack BSH. The lack of BSH was attributed to an 8 bp-duplication in the bshC-gene that encodes the last enzyme of the BSH-synthesis. BSH-production was restored by transducing plasmid-borne functional BshC from strain Newman into strains 8325-4 and SH1000. The reconstitution of the BSH-synthesis aided in the resistance to the antibiotic fosfomycin but did not increase the resistance to different oxidants (diamide, sodium hypochlorite, hydrogen peroxide). The production of BSH had also positive effects on the survival of S. aureus inside human bronchial epithelial cells and murine macrophages in phagocytosis assays. Additionally, a GSH-uptake was observed into S. aureus which has before been known as a GSH-free bacterium. Taken together, this thesis provides the first insights into both, the LMW-thiol- and protein thiol pool of low GC, Gram-positive bacteria under different conditions. A plethora of different methodologies was used to describe the thiolome. The bacterial thiolome is a sophisticated system which is tightly regulated, but also flexible enough to not rely on determined molecules like BSH. The influences of the thiolome are not restricted to its own system and regulation, but also affect different branches of cellular physiology like the metabolism of BCAAs.
Selbst bei intensiv erforschten Modellorganismen ist die Funktion von mindestens einem Drittel der codierten Proteine bis heute vollkommen unbekannt. Dies trifft auch auf das Gram-positive, fakultativ pathogene Bakterium Staphylococcus aureus zu. Mit 25.000 Molekülen pro Zelle ist das alkalische Schock Protein Asp23 eines der abundantesten Proteine in S. aureus. Abgesehen davon, dass die Expression von asp23 unter alkalischen Schock Bedingungen induziert ist, weshalb es seinen Namen erhielt, und dass es alleinig σB-abhängig transkribiert wird und somit gut als Marker für σB-Aktivität geeignet ist, war über Asp23 zu Beginn dieser Arbeit nichts bekannt. Das asp23-Gen liegt in einem tetracistronischen Operon. Bestandteil dieses Operons sind außerdem opuD2, das für einen Transporter für Osmoprotektantien codiert, und SAOUHSC_02442 und SAOUHSC_02443, die beide für Membranproteine unbekannter Funktion codieren. Interessanterweise enthalten sowohl Asp23 als auch SAOUHSC_02443 eine DUF322-Domäne. DUF322-Domänen sind in Gram-positiven Bakterien sehr konserviert und kommen normalerweise in mehreren Kopien pro Genom vor. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass das cytoplasmatische Protein Asp23 nahe der Membran lokalisiert ist. Dabei konnte Asp23 entlang der gesamten Membran nachgewiesen werden. Auffällig war jedoch, dass in sich teilenden Zellen die Stellen frei von Asp23 blieben, wo sich das neue Septum gebildet hat. Nur in Zellen, die sich vermutlich in einem fortgeschrittenen Stadium der Zellteilung befanden, konnte auch am Septum Asp23 nachgewiesen werden. Da für Asp23 selbst keine Transmembrandomänen vorhergesagt werden, wurde untersucht, ob eines der im asp23-Operon codierten Membranproteine an der Verankerung von Asp23 an der Membran beteiligt ist. Dazu wurden Deletionsmutanten der drei Gene opuD2, SAOUHSC_02443 und SAOUHSC_02442 konstruiert und die Lokalisation von Asp23 in diesen Mutanten fluoreszenzmikroskopisch untersucht. Ein eindeutiger Einfluss auf die Lokalisation von Asp23 konnte nur für die Deletion von SAOUHSC_02443 nachgewiesen werden. Mittels BACTH-Analyse konnte außerdem eine direkte Interaktion zwischen SAOUHSC_02443 und Asp23 gezeigt werden. SAOUHSC_02443 ist somit maßgeblich an der Verankerung von Asp23 an der Membran beteiligt und wurde deshalb als „Asp23 membrane anchoring protein“, kurz AmaP, benannt. Mithilfe des BACTH-Systems wurden zudem alle theoretisch möglichen Interaktionen zwischen den im asp23-Operon codierten Proteinen untersucht. Dabei konnten Selbstinteraktionen von allen vier Proteinen, OpuD2, AmaP, SAOUHSC_02442 und Asp23, nachgewiesen werden und eine Interaktion zwischen SAOUHSC_02442 und der Membrandomäne von AmaP. Die Selbstinteraktion von AmaP wird über dessen Membrandomäne vermittelt. Für die Selbstinteraktion von Asp23 ist hingegen dessen DUF322-Domäne in Kombination mit dem C-Terminus wichtig. Die Interaktion zwischen Asp23 und AmaP konnte nur dann nachgewiesen werden, wenn AmaP intakt war, was dafür spricht, dass AmaP eine von seinem Membranteil abhängige Quartärstruktur einnehmen muss, um die Bindungsstelle für Asp23 zu bilden. Da neben der mittels BACTH-Analyse gezeigten Selbstinteraktion von Asp23 auch Ergebnisse von Gelfiltrationsexperimenten dafür sprachen, dass Asp23 polymere Strukturen ausbildet, wurde Asp23 mit einem Strep-tag in Escherichia coli exprimiert, gereinigt und mittels Elektronenmikroskopie visualisiert. So konnte gezeigt werden, dass Asp23 in vitro spiralig gewundene, bis zu mehrere Mikrometer lange Filamente bildet. Im Zuge einer strukturellen Charakterisierung der Filamente wurden drei Punktmutationen in Asp23 identifiziert (K51A, E106A, K117A), die die Filamentbildung in vitro beeinträchtigten. In einer vergleichenden Transkriptionsanalyse der asp23-Deletionsmutante und des Wildtyps konnten 16 in der asp23-Mutante hochregulierte Gene identifiziert werden. Darunter waren viele Gene, die zum Vancomycin-Stimulon gehören. Mittels Northern Blot konnte das Ergebnis der DNA-Microarray-Analysen bestätigt werden. Zudem konnte so gezeigt werden, dass die in der asp23-Mutante hochregulierten Gene auch in der amaP-Mutante hochreguliert sind, in der Asp23 vorhanden, aber delokalisiert ist. Die phänotypische Charakterisierung deutet somit ebenso wie die Lokalisation von Asp23 auf eine Zellwand-assoziierte Funktion hin.
A method employing labeling of cell-surface proteins with Sulfo-NHS-SS-biotin and subsequent affinity enrichment with NeutrAvidin has been optimized in order to make cell-surface proteins from Gram-positive bacteria reliably accessible to quantitative mass spectrometric analyses. The optimized biotinylation approach was applied for analysis of the lipoproteome from S. aureus and S. pneumoniae on a global scale and the influence of mutations in the lipoprotein maturation pathway on the cell-surface and exoproteomes of both species was investigated. The biotinylation approach was integrated into a proteomic workflow that employs metabolic labeling with heavy nitrogen for relative protein quantification to investigate proteomic differences between S. aureus in a biofilm model and its free-floating, planktonic counterparts.
Proteolysis represents the final step in the life of a protein. It is one of the most important cellular processes assisted by chaperone systems and ensures an appropriate protein homeostasis. Protein degradation is essential for the removal of cytotoxic protein aggregates and mis-translated/mal-folded proteins, „unemployed“ and regulatory proteins to enable rapid cell adaptation to altering environmental conditions (Gottesman, 2003; Wiegert & Schumann, 2001; Parker, 1981; Stansfield et al., 1998; Drummond & Wilke, 2008; Goldberg, 1972; Gerth et al., 2008). The bacterial Clp (caseinolytic proteins) protease complexes are analogous to the eukaryotic 26S proteasome and consist of Hsp100/Clp proteins of the AAA+ superfamily and an associated barrel-like proteolytic chamber (e.g. ClpP). The Clp proteases seem to be responsible for the major protein turnover in low GC, Gram+ bacteria. The main goal of this thesis was to develop new methods and tools to investigate global proteolysis more precisely and to get a detailed understanding of protein degradation during starvation conditions and it´s regulation in low GC, Gram-positive bacteria. To analyse protein degradation under starvation conditions the well established glucose starvation model was used. In Bacillus subtilis it could be shown that approximately 200 proteins are selectively degraded in a glucose depletion induced stationary phase. Furthermore radioactive pulse-chase labelling experiments coupled with 2D-PAGE analysis revealed that mainly the ClpCP protease complex is involved in the degradation of proteins in the stationary growth phase. To investigate proteolysis in the human pathogen Staphylococcus aureus in the same way, a newly developed chemically defined medium was established suitable for radioactive pulse-chase labelling experiments under stable glucose starvation conditions. The degradation kinetics of individual 2D spots was significantly better resolved using 14C-BSA as an internal marker protein for the sample normalisation. A rather huge overlap was found within the functional protein classes that were degraded in B. subtilis and S. aureus the stationary phase. Among others, especially proteins involved in amino acid, nucleotide and cell wall biosynthesis were rapidly degraded, whereby not always the same and sometimes another enzymes from a biosynthetic chain were targeted for proteolysis. Despite the resolution power of the 2D-PAGE method, there are some drawbacks such as a limited "protein window" with regard to the molecular weight and isoelectric point, loss of low abundance proteins and a rather low reproducibility for time course experiments. Therefore a mass spectrometry based approach for the simultaneous detection of protein synthesis, accumulation and degradation was developed. This pulse-chase SILAC approach provides a very good reliability with a broad spectrum of proteins that can be analysed. Through the combination with ultracentrifugation even non-soluble and aggregated proteins could be analysed. Several hundred proteins were degraded in S. aureus during glucose starvation. Among them was the functional cluster of ribosomal proteins which is degraded in the early stationary phase. Furthermore proteins belonging to complexes were degraded with the same kinetic (e.g. NrdE, NrdF). In addition selective protein degradation took place according to functional categories (e.g., ribosomal proteins, biosynthetic, glycolytic enzymes) and not to regulatory groups (e.g. CcpA, SigB regulon).The investigation of a clpP deletion mutant in S. aureus revealed a greater susceptibility to aggregation, where the cells try to counteract with the expression of chaperones like GroEL/ES, ClpB and DnaK. The renaturation process is very ATP consuming and only takes place in energy rich phases of growth (e.g. from exponential to transient growth phase). Protein aggregation was found enhanced in the stationary phase. Furthermore, a higher GTP level compared to the wild-type probably resulted in a stronger CodY mediated repression with a rather low level of amino acids in clpP mutant cell. In addition substances like glycerol, which thermodynamically stabilise proteins in refolding processes (Maeda et al., 1996; Feng & Yan, 2008), were found in higher levels compared to the wild-type. A strong response to reactive oxygen species was detected in the clpP mutant strain, which is probably due to ROS production during the early stages of protein aggregation. Altogether, different methods were used for investigation protein degradation at a proteome-wide scale. Hundreds of degradation candidates were identified by gel-based and gel-free approaches in S. aureus wild-type cells. “Unemployed” proteins (e.g. ribosomal proteins, biosynthetic enzymes) were degraded and proteins particularly required and synthesized in glucose-starved cells such as TCA cycle enzymes were stable in the stationary phase. Investigation of the clpP mutant strain supports a proposed model for the pleiotropic phenotype and provides a deeper insight in the fine-tuned protein quality control and the important role of ClpP during starving conditions.
Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Etablierung von Methoden zur absoluten und relativen Proteinquantifizierung. In darauf aufbauenden Studien sollten diese Methoden für die Untersuchung physiologisch relevanter Fragestellungen in Bakterien genutzt werden. Zum tieferen Verständnis der Bakterienphysiologie ist es unabdingbar, Mengenänderungen von Proteinen hochaufgelöst darstellen zu können. Relative Proteinquantifizierung erlaubt dabei die Untersuchung von Änderungen der Menge eines Proteins zwischen verschiedenen Proben eines Experiments. Im Rahmen der hier vorgelegten Arbeit wurden 2D PAGE und gelfreie massenspektrometrische Methoden in einer Studie (Tefon et al. 2011, Artikel I) angewendet, um Oberflächen- und Immunoproteine zweier Vakzinationsstämme des humanpathogenen Bakteriums Bordetella pertussis zu charakterisieren. Die relative Proteinquantifizierung erlaubt zwar Rückschlüsse auf die Mengenänderung eines Proteins zwischen verschiedenen Bedingungen, ermöglicht aber nur bedingt Aussagen über die absolute Menge der Proteine. Gerade absolute Proteinmengen und damit Proteinkonzentrationen sind jedoch Grundvoraussetzung für ein zielorientiertes Verwenden der gewonnenen Daten nicht nur im Kontext der Systembiologie. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, in der durch Kombination zweier etablierter Proteomik-Methoden die absolute Quantifizierung für einen großen Teil der cytosolischen Proteine eines Organismus ermöglicht wird. In dieser Methode werden ausgewählte Proteine, deren genaue Konzentration durch gerichtete Massenspektrometrie bestimmt wurde, für die Kalibration von hoch auflösenden 2D Gelen genutzt (Maass et al. 2011, Artikel II). Um das Potential dieses Verfahrens zu verdeutlichen, wurde es für die Analyse der Anpassung von Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus an Glukosehunger angewendet. Dabei konnten für 467 Proteine von B. subtilis in drei Zeitpunkten Proteinkonzentrationen bestimmt werden. Für die Etablierung der Methoden waren verschiedene Vorarbeiten nötig: I) Selektion geeigneter Kalibrationsproteine, II) Selektion geeigneter Standardpeptide und Optimierung der massenspektrometrischen Parameter zu deren absoluten Quantifizierung, III) Selektion eines geeigneten, proteinunspezifischen und hoch sensitiven Gelfarbstoffes, IV) Testung verschiedener Zellaufschlussmethoden und Etablierung einer Methode zur Bestimmung der Zellaufschlusseffizienz, V) Testung verschiedener Proteinbestimmungsmethoden zur genauen Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration im komplexen cytosolischen Extrakt und VI) Optimierung der vollständigen enzymatischen Spaltung aller Proteine vor der massenspektrometrischen Analyse. Im Rahmen dieser Arbeit konnte außerdem gezeigt werden, dass sich die Kalibration der 2D Gele für die Ermittlung absoluter Daten zwischen Gelen übertragen lässt, was den Aufwand für große Zeitreihenexperimente deutlich reduziert. Die Genauigkeit und der dynamische Bereich 2D-gelbasierter relativer und absoluter Proteinquantifizierung kann durch eine erhöhte Reproduzierbarkeit, Auflösung und Sensitivität der Gele verbessert werden. Die Etablierung von HPE-Gelen führte zu 25 % mehr detektierbaren und damit quantifizierbaren Proteinspots und Proteinen bei deutlich erhöhter Reproduzierbarkeit (Moche et al. 2013, Artikel III). Die zusätzlich höhere Anzahl von Gelen mit quantifizierbarer Qualität verringert außerdem den Zeit- und Kostenaufwand vor allem für komplexe experimentelle Ansätze. Die neue Methode zur gelbasierten absoluten Proteinquantifizierung wurde in einer Folgestudie angewendet, um die Konzentrationen von mehr als 700 Proteinen von B. subtilis während der physiologisch relevanten Anpassung an verschiedene Stressbedingungen, nämlich Glukosehunger und Hitzestress, zu bestimmen (Maaß et al. 2014, Artikel IV). Der Vergleich der beiden Stressbedingungen ermöglicht eine Unterscheidung der generellen von der spezifischen Stressantwort, wobei die Analyse der Daten durch Berechnung der Proteinkosten und der Ressourcenverteilung auf verschiedene metabolische Pfade und regulatorische Einheiten unterstützt wurde. Da die Nutzung von 2D PAGE zur Proteinquantifizierung auf im Gel detektierbare Proteine beschränkt ist, ist es für eine höhere Proteomabdeckung sinnvoll, gelbasierte Methoden mit gelfreien Methoden zu ergänzen. Deshalb wurde eine Methode zur labelfreien MS-basierten absoluten Quantifizierung von Proteinen im großen Maßstab entwickelt und etabliert. In dieser gel- und labelfreien Quantifizierungstechnik wurde datenunabhängige, parallele Fragmentierung aller zeitgleich eluierenden Vorläufermoleküle (LC-MSE) genutzt. Auch für diese Methode der absoluten Proteinquantifizierung bildeten die im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Probenaufbereitungsverfahren die Grundlage (Muntel et al. 2014, Artikel V).
Understanding of the regulatory mechanisms controlling stress gene expression of S.aureus in response to environmental stress is very essential in studying its fitness and virulence. In this work, the changes in protein expression profiles as well as the gene transcription of S.aureus after heat exposure, osmotic stress and in response to the antibiotic puromycin were studied in order to provide detailed insights into the response of S.aureus to various kinds of environmental stress under in vitro conditions, namely: (1) to investigate the global response of S.aureus to heat stress conditions using transcriptomic and proteomic analyses. (2) to study the transcriptome and proteome of S.aureus in response to antibiotic substance puromycin. (3) to define the proteome signatures of S.aureus under NaCl stress condition. (4) to complete the proteome map of cytoplasmic proteins of S.aureus by identifying proteins exclusively synthesized during the exposure to stress. Firstly, the high resolution 2-D protein gel electrophoresis technique combined with MALDI-TOF-MS and a DNA array approach were used to investigate the cellular response of S.aureus to heat stress. A switch from normal growth temperature to high temperature condition revealed complex changes in the protein expression pattern as well as the genes expression profile. The effect of puromycin stress on S.aureus cells was analyzed, using a gel-based proteomic approach and transcriptomic analyses with DNA microarrays. We compared the protein synthesis pattern as well as the transcription data of S.aureus in response to puromycin stress with that in response to heat shock. The results demonstrated that both stress conditions induced specific, overlapping and general responses. Finally, the protein expression profile of S.aureus in response to NaCl stress was analyzed with 2D gel based proteomic approach. Our proteome analyses revealed the repression of the synthesis of many enzymes belong to different metabolism pathways . In summary, the signatures for stress or starvation stimuli can be used as diagnostic tools for the prediction of the mode of action of new antibiotics or for studying the physiological state of cells grown. Expression of the respective genes under in vivo conditions could provide some ideas on the environmental signals that specifically influence the survival of S.aureus within and outside the host.
Staphylococcus aureus is a pathogenic bacterium infecting the human host. It’s multifaced adaptation to various environmental conditions is mediated by a tight regulation of the virulence factors influencing the host’s immune system. In this thesis two regulators of gene expression were analysed: (i) the global influence of the two-component system SaePQRS and (ii) the regulation of superantigen gene expression by the alternative sigma factor σB. At the outset of this thesis, single target genes induced by SaeRS were known (hla, hlb, cap5, fnbA, coa). In order to get a general idea of the Sae-regulon, the influence of SaePQRS on gene-expression was analysed in two strain backgrounds by proteomics and transcriptomics aproaches. Recapitulatory, expression of at least 18 secreted and two covalently cell-wall bound proteins was decreased following inactivation of the Sae-system. Sae-dependently expressed were, amongst others, well decribed virulence factors like the y-hemolysins HlgA, HlgB, HlgC, LukM and LukF, the innate immune system modulating proteins Efb, CHIPS and SCIN-B as well as the enterotoxin SEB. SaeR acts as an activator of its target genes. Some proteins were detected in increased amounts in the extracellular proteome of the Sae-deficient strain. However, these changes did not occur at the transcriptional level. The expression of virulence factors is determined by other global regulators. No influence of SaePQRS on the transcription of five substancial regulators, namely the Agr-system and its effector molecule RNAIII, the alternative sigma factor σB, the two-component system ArlRS and the DNA-binding protein SarA, could be shown. In the second part of this thesis the issue was broached to the regulation of gene-expression of a subgroup of virulence factors, the superantigens (SAgs) of S. aureus by SaePQRS and σB. In contrast to their well described molecule structure and function, the regulation of their gene expression was largely unknown. Six different S. aureus strains (two laboratory strains and four clinical isolates) encoding one to seven SAg-genes each, were used for analysis of a total of twelve SAgs regarding their transcription and mitogenic activity. The transcriptional units were characterized using Northern-Blotting. The expression of SAgs could be correlated to the respective growth phase. While egc-SAgs were expressed mainly at low optical densities, seb was induced during late growth phase. In contrast, the transcription of sea, seh, sek, tst and sep remained constant and growth-phase independent. The transcriptional dataset was verified using T-cell proliferation assays. The expression of seh, tst and the egc-operon was dependent on σB. A potential σB-dependent promotor could be identified preceeding seo, the first gene of the egc-operon. In contrast, the expression of seb was increased in sigB-deficient background. This might be due to indirect effects. Expression of seb required SaePQRS. Transcriptional datasets were verified by Immuno-Blotting and T-cell-proliferation assays. In conclusion, the same mutation in sigB but in different strain backgrounds could result in opposite phenotypes with respect to their mitogenic activity. Besides well characterized virulence factors, some secreted proteins with so far unknown function belong to the Sae-regulon. Given that the influence of SaePQRS was restricted to virulence factors and induced especially modulators of the innate immune system, it can be assumed, that these proteins potentially play a role in virulence of S. aureus. In the third part of this thesis, one of these potential new virulence factors, namely SACOL0908, was analysed in detail. In cooperation with the group of Prof. Stehle, Tübingen, the crystal structure was solved. The protein folding of SACOL0908 is new with only minor similarities to described protein structures. Recombinantly expressed SACOL0908 binds to granulocytes. These cells belong to the innate immune system, incorporate bacteria by phagocytosis and kill them. The receptor for SACOL0908 on the surface of granulocytes could not be identified using immunoprecipitation, antibody-blocking assays and functional assays in cooperation with the group of Prof. Peschel, Tübingen. The gene encoding SACOL0908 was deleted in two S. aureus strain backgrounds (COL and Newman). These mutants are currently in use to characterize their phenotype in mouse-infection studies.
Staphylococcus (S.) aureus ist vor allem bekannt als einer der Haupterreger nosokomialer Infektionen weltweit. Die Mechanismen, mit denen S. aureus und das Immunsystem des Wirtes miteinander interagieren sind komplex und bis heute nicht vollständig verstanden. Ziel der vorliegenden Dissertation war es daher, bekannte Virulenzfaktoren von S. aureus und Proteine, deren Funktion für das Bakterium bisher unbekannt ist, hinsichtlich ihrer Immunogenität und ihrer Fähigkeit, Interaktionen mit Zellen und Plasmafaktoren des humanen Blutes einzugehen, zu charakterisieren. Die Entwicklung und Anwendung eines für den Organismus S. aureus spezifischen Proteinmikroarray war eines der Hauptziele dieser Arbeit, welches unter der Bezeichnung Staph-Toxin-Ag verwirklicht wurde. Der Array trug bis zu 62 S. aureus-Antigene und zeigte sich als geeignet zur Charakterisierung und Quantifizierung von Antikörperantworten in verschiedenen humanen und murinen Wirtsproben, wie Blutplasma und -serum sowie anderen extrazellulären Flüssigkeiten wie Nasensekret und Bauchwasser von gesunden und infizierten Probanden. Im ‚Protein-Interaktionsassay‘ wurde der Staph-Toxin-Ag dazu verwendet, Interaktionen von S. aureus-Proteinen zu humanen Blutplasmaproteinen zu identifizieren – Faktor H, Fibronektin, Fibrinogen, Plasminogen und Vitronektin. Der Staph-Toxin-Ag wurde in zwei unabhängigen globalen Studien angewendet, welche die S. aureus spezifischen Antikörperantworten von gesunden humanen Probanden untersuchten, darunter Träger und Nicht-Träger von S. aureus. In der ersten Studie wurden die IgG-Antworten in den Blutplasmen, in der zweiten Studie die Antikörperantworten der Klassen IgG und IgA, hier in den Nasensekreten der Probenaden charakterisiert. In beiden Studien wurde wie erwartet eine enorme Heterogenität der detektierten Antikörperantworten innerhalb der Kohorten beobachtet, die unabhängig vom Trägerstatus bestand. Vergleichende Analysen der IgA- mit den IgG-Antworten in den Nasensekreten konnten den Grad der Heterogenität noch einmal deutlich erhöhen. Für keinen der untersuchten Probanden stimmten die S. aureus-Antigen-Muster beider Antikörperklassen vollständig überein. Für die untersuchten S. aureus-Träger wurden im Durchschnitt höhere Antikörperlevel nachgewiesen als für die Nicht-Träger. Statistische Analysen (Mann-Whitney U-Test) der gemessenen IgG- bzw. IgA-Level identifizierten insgesamt zehn Antigene, gegen die die Testgruppe der Träger im Vergleich signifikant höhere Antworten zeigte. Für das virulenzassoziierte Protein IsaA (Immunodominant staphylococcal Antigen A) wurden die beschriebenen Unterschiede in beiden globalen Studien und für beide untersuchten Antikörperklassen identifiziert. Die stärksten und häufigsten Antikörperantworten konnten gegen Proteine aus zwei funktionellen Gruppen – die nicht-egc-Superantigene (SEB, SEC, TSST-1) und die Komplement- und Koagulationsinhibitoren (SCIN, Efb, Sbi, SSL-7, SACOL1169) – detektiert werden. Mindestens 60 % der untersuchten Probanden zeigten spezifische IgG- und/oder IgA-Antworten gegen Komplementinhibitoren. Hingegen konnten für Superantigene vor allem Antikörperspezifitäten der Klasse IgG detektiert werden. Für den Komplementinhibitor Sbi (S. aureus Binder of IgG) wurde eine Lücke in den IgG-Antworten beobachtet. Beide funktionelle Gruppen werden folglich bei der Invasion des Wirtes von S. aureus in vivo exprimiert. Komplementinhibitoren sind darüber hinaus offensichtlich für S. aureus von besonderer Relevanz bei der Kolonisierung der Naseschleimhaut. Zahlreiche neue Erkenntnisse konnten gewonnen werden zu Proteinen, die von S. aureus sekretiert werden, deren Funktion für das Bakterium jedoch bisher unbekannt ist. Gegen zehn dieser Proteine wurden mithilfe des Staph-Toxin-Ag spezifische IgG- und/oder IgA-Antworten nachgewiesen, besonders häufig gegen die Antigene SACOL0479, SACOL0480, SACOL0985 und SaurJH1_2034. Dies zeigte, dass diese Proteine durch S. aureus in vivo synthetisiert werden und dass sie immunogen wirken. Im ‚Protein-Interaktionsassay‘ konnten für 20 der sekretierten Proteine mit unbekannter Funktion Interaktionen mit humanen Blutplasmafaktoren nachgewiesen werden. In durchflusszytometrischen Analysen mit humanem Vollblut wurden für sieben Proteine – SACOL0021, SACOL0742, SACOL0908, SACOL0985, SACOL1788, SACOL1802 und SACOL2197 – spezifische Bindungen an PMNs (Polymorphonuclear Leukocytes) und/oder Monozyten gezeigt. In der vorliegenden Dissertation wurden mithilfe immunologischer und durchflusszytometrischer Methoden potentielle neue Virulenzfaktoren, Vakzinkandiaten sowie diagnostische Biomarker identifiziert. Neben der wissenschaftlichen Anwendung ist der Proteinarray Staph-Toxin-Ag durch seine Eigenschaften prädestiniert für einen Einsatz als Screening-Methode in der diagnostischen Medizin.
Reversible posttranslational modifications play an important role during the regulation of many central processes in bacterial cells. Protein phosphorylation, in particular, can influence signal transduction processes and thus enables a distinct reaction of the cell to different stress and environmental conditions. In the case of the human pathogen Staphylococcus aureus, protein phosphorylation is involved in the adaptation to changing conditions during colonisation of human hosts. For this reason, the investigation of phosphorylations in S. aureus allows a better understanding of pathophysiology and virulence of this organism. Apart from stable phosphorylations at the amino acids serine, threonine and tyrosine, insights into energy-rich phosphorylations, for instance at arginine residues, gain more and more scientific attention. For this reason, one purpose of this study was the investigation of incidence and physiological relevance of this protein modification at a global scale. Firstly, the analysis of this modification was methodically optimised resulting in the identification of eight arginine phosphorylations in wild type cells of S. aureus COL. Secondly, the deletion mutant ΔptpB missing the gene that codes for an arginine phosphatase, was analysed. The characterisation of PtpB in vitro proved its activity and specificity towards arginine phosphorylations. This enabled the global analysis of the phosphoproteome with a focus on arginine phosphorylations. In addition to the optimisation of the phosphopeptide enrichment as part of the sample preparation, the data analysis process was adapted to the special challenges of energy-rich phosphorylations. Here, classical database search was extended by spectral library based analyses. In addition, synthetic peptides allow the generation of high quality mass spectra and the verification of database based evaluation strategies to ensure the quality of the spectral library. Next, S. aureus COL was cultivated under various conditions and several subcellular fractions were analysed with the aim to cover a broad part of the proteome. The combination of the spectra of synthetic peptides, the spectra of non-phosphorylated peptides from extensive cultivation experiments and the spectra of enriched phosphopeptides rendered the construction of a spectral library possible. This contained 2,270 proteins out of which 392 were found to be phosphorylated. A comparison of the database based analysis with spectral library based analysis showed the advantages of the latter when comparing the reproducibility of biological replicates. Thereby a permanent issue in phosphoproteomics was investigated. Hence, spectral libraries were used for the analysis of the phosphoproteome of S. aureus under control and stress conditions. 215 arginine phosphosites were identified within the mutant under control conditions and 117 under oxidative stress conditions. Oxidative stress was chosen because phenotypic characterisation of the mutant revealed that the most distinct growth changes in comparison with the wild type occurred after oxidative stress. These phenotypic changes were quantitatively approached in the last part of this work. Total proteome quantification of the wild type and mutant under control and stress conditions revealed an influence of the ptpB deletion on amino acid metabolism, oxidative stress response and virulence. The quantification of phosphopeptides by means of a combination of spectral library with Census based analysis finally confirmed the observations made during total proteome quantification.
Das humanpathogene Bakterium Staphylococcus aureus kann verschiedene, zum Teil lebensbedrohliche Erkrankungen wie Hautinfektionen (Furunkel, Karbunkel), Lungen-entzündung, Osteomyelitis (Knochenmarksentzündung), Endokarditis (Entzündung der Herzinnenhaut) und Sepsis auslösen. Dabei gehört S. aureus zu den häufigsten Erregern von Krankenhausinfektionen, sogenannten Nosokomialinfektionen. Deren Behandlung mittels Antibiotika stellt aufgrund von multiplen Antibiotikaresistenzen von S. aureus eine immer größere Heraus¬forderung dar, da dieser fähig ist, sich rapide an verändernde Umweltbedingungen anzu¬passen. Die Interaktion des pathogenen Bakteriums mit seiner Umwelt und seinem Wirt ist insbesondere durch den Proteinbestand, der auf der Zelloberfläche exponiert ist, bestimmt. S. aureus exprimiert ein Arsenal an Zellober-flächen-gebundenen Virulenzfaktoren, die zur Kolonisierung und Infektion von humanem Gewebe führen. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Anwendung von Massen¬spektrometrie-basierten Methoden zur Identifizierung und Quantifizierung der Zellober¬flächen¬-assoziierten Proteine von S. aureus. Dabei ist es gelungen, durch die Gel-freien und GeLC-MS/MS-basierten Methoden Biotinylierung und Trypsin-Behandlung 77% aller be-kannten Oberflächenproteine und zwei Drittel aller nach außen ragenden Membran-veran-kerten Lipoproteine von S. aureus zugänglich zu machen. Bei der Biotinylierung handelt es sich um eine Methode, bei der die Oberflächenproteine von intakten Zellen mit einem membranimpermeablen Reagenz markiert und anschließend über Affinitäts¬chroma-tographie aufgereinigt werden. Dagegen erfolgt bei der Trypsin-Behandlung die proteo-lytische Abspaltung der Oberflächen-exponierten Protein¬domänen. Erstmalig ist durch Markierung der Proteine mit stabilen Isotopen, dem sogenannten 14N/15N-metabolischen Labeling, auch eine relative Quantifizierung der Oberflächenproteine von S. aureus möglich. Bei der Analyse des Oberflächenproteoms von wachsenden und nicht-wachsenden S. aureus Zellen konnten mittels Biotinylierung 146 Oberflächenproteine identifiziert werden. Durch relative Quantifizierung wurde gezeigt, dass Zelloberflächen-assoziierte Adhäsine von S. aureus, wie der Fibrinogen-bindende clumping Faktor B, vorzugsweise während des Wachstums exprimiert werden, während nicht-wachsende Zellen erhöhte Mengen an clumping Faktor A aufweisen. Desweiteren war die Menge an immunodominanten Antigen B auf der Zelloberfläche in der stationären Phase mehr als 10-fach erhöht. Bei dieser Arbeit wurde erstmalig das Gesamt¬proteom des Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus COL, bestehend aus cytosolischem, extra¬zellulärem, Membran- und Oberflächenproteom, um¬fassend identifiziert und quantifiziert (Becher et al., 2009). Um die Pathogenität von S. aureus näher zu erforschen, wurde das Oberflächenproteom des Wildtyps mit dem einer sigB-Mutante verglichen. Der alternative Sigma-Faktor SigmaB kontrolliert ein großes Regulon bestehend aus etwa 300 Genen, von denen viele in die Virulenz von S. aureus involviert sind. Durch Kombination von 14N/15N-metabolischen Labeling, Biotinylierung und GeLC-MS/MS konnten 98 Oberflächen-proteine quantifiziert werden. Von den 49 Proteinen, die in der sigB-Mutante verändert vorlagen, waren 21 schon als SigmaB-abhängig oder durch SigmaB beeinflusst bekannt. In dieser Arbeit konnten weitere 28 Oberflächenproteine erstmalig als SigmaB-abhängig beschrieben werden. Die Gruppe der Zelloberflächen-assoziierten Proteine und Virulenz-faktoren, die durch SigmaB beeinflusst werden, wurde so erweitert (Hempel et al., 2010). Durch Trypsin-Behandlung wurden insgesamt 63 Oberflächen¬proteine beim Vergleich vier verschiedener S. aureus Stämme identifiziert. Hierbei konnte gezeigt werden, dass das Oberflächenproteom verschiedener S. aureus Stämme extrem variabel ist. Weniger als 10% der identifizierten Oberflächenproteine aller vier Stämme stimmten überein (Dreisbach et al., 2010). Eine optimale Analyse der Oberflächen¬proteine von S. aureus wird durch eine Kombination von Biotinylierung und Trypsin-Behandlung erreicht. Es konnte gezeigt werden, dass Sortase-Substrate insbesondere durch Trypsin zugänglich sind, während Lipoproteine optimal durch Biotinylierung analysiert werden können. Das Protokoll zur Trypsin-Behandlung wurde modifiziert, stark vereinfacht und ist auch zur Quantifizierung von Oberflächen¬proteinen geeignet. Durch Kombi¬nation beider Methoden mit 14N/15N-metabolischen Labeling konnten 221 Oberflächen¬proteine identifiziert und 158 quantifiziert werden. Hierbei wurde S. aureus unter Eisenmangel-bedingungen untersucht. In den Körperflüssigkeiten von Säugetieren herrschen Eisenmangelbedingungen, und diese fungieren als wichtiges Wirtssignal für die Bakterien um Virulenzproteine zu exprimieren. Unter diesen infektionsrelevanten in vitro Bedingungen wurden insbesondere Zelloberflächenproteine wie die eisenabhängigen Häm-bindenden Proteine IsdA, IsdB, IsdC und IsdD, sowie lipidver¬ankerte Eisen-bindende Proteine stark induziert gefunden (Hempel et al., unpublished).
Lipoproteins of Staphylococcus aureus represent a major class of surface proteins, which are anchored to the outer leaflet of the cell membrane. Although they play a key role in the immune response and virulence, the majority of lipoproteins in this organism is still of unknown function. The aim of our study was to investigate the function of so far poorly or uncharacterized lipoproteins in S. aureus strain Newman. To this end, an integrated bioinformatical approach was applied to define the pan-lipoproteome of 123 completely sequenced S. aureus strains. In total, this analysis predicted 192 different potential lipoproteins, with a core lipoproteome of 39 and a variable lipoproteome of 153 lipoproteins. Out of those 192 lipoproteins, 141 are so far functionally uncharacterized. Primarily focusing on members of the core-lipoproteome with unknown or poorly characterized function, 24 lipoproteins or co-encoded neighbor proteins were selected for further characterization. Of those 24 proteins, 20 S. aureus markerless deletion mutants were constructed (S. aureus delta l01 - delta l20) and screened for an altered growth behavior under various conditions. Here, three mutants showed a temperature-sensitive phenotype, two mutants formed aggregates in the TSB of the manufacturer Merck (TSBMerck), and four mutants showed reduced growth under osmotic stress with 8% NaCl. An altered aggregation behavior was observed for four mutants in the presence of Triton X-100 and for eleven mutants in the presence of SDS. Furthermore, ten mutants revealed an impaired biofilm formation capacity as well as reduced hemolytic activity. Interestingly, S. aureus deletion mutants delta l14 (delta NWMN_1435) and delta l16 (delta NWMN_0646) showed an altered phenotype under nearly all tested growth and stress conditions. Most strikingly, both deletion mutants demonstrated dramatic defects in cell morphology and cell division during the transient growth phase in TSBMerck and were therefore selected for further detailed characterization. Electron microscopy imaging of the two mutants revealed an irregular cell shape, increased cell size, multiple displaced division septa, and incomplete separation of daughter cells resulting in the formation of cell aggregates in TSBMerck. Complementarily, microarray-based transcriptome analysis and whole-genome sequencing of S. aureus delta l14 and delta l16 suppressor mutants strongly point to a functional association of both lipoproteins with cell envelope- or cell division-related processes. Specifically, multiple hints suggest a functional connection of both lipoproteins with lipo- or wall teichoic acids. Of note, the phenotypes of S. aureus delta l14 and delta l16 are conditional and appear under some, but not all growth conditions. Thus, it is conceivable that the function of L14 and L16 is modulated by metabolic processes, or that the proteins might be part of a “backup system” becoming important only under certain conditions. Collectively, we propose that L14 and L16 fulfill a basic role in cell envelope- or cell division-related processes under specific growth conditions. Particularly, the activity of L14 and L16 might be necessary for the function or localization of lipo- or wall teichoic acids, and thus, might be linked to the regulation of autolysins. In conclusion, this study reveals important insights into the function of two so far uncharacterized but highly conserved lipoproteins in S. aureus.
In vitro and in vivo analyses of mono- and mixed-species biofilms formed by microbial pathogens
(2022)
Microbial biofilms can be defined as multicellular clusters of microorganisms embedded in a self-produced extracellular matrix (ECM), which is primarily composed of polymeric biomolecules. Biofilms represent one of the most severe burdens in both industry and healthcare worldwide, causing billions of dollars of treatment costs annually because biofilms are inherently difficult to prevent, treat, and eradicate. In health care settings, patients suffering from cystic fibrosis, or patients with medical implants are highly susceptible to biofilm infections. Once a biofilm is formed, it is almost impossible to quantitatively eradicate it by mechanical, enzymatical, chemical, or antimicrobial treatment. Often the only remaining option to fully eradicate the biofilm is removing of the infected implant or body part. The primary reasons for the inherent resistance of biofilms against all forms of antimicrobial treatment are (I) a reduced metabolic activity of biofilm-embedded cells climaxing in the presence of metabolic inactive persister cells, as well as (II) the protective nature of the biofilm matrix acting as a (diffusion) barrier against antimicrobials and the host immune system. Consequently, there is an urgent need to better understand microbial biofilms from a structural and (patho-) physiological point of view in order to be able to develop new treatment strategies.
Therefore, the aims of this study were to investigate fundamental physiological properties of different clinically relevant single and multi-species biofilms, both in vitro and in vivo. Furthermore, the effectiveness of a novel treatment strategy using cold atmospheric pressure plasma was evaluated in vitro to treat biofilms of the pathogenic fungus C. albicans.
In article I, the intracellular and ECM protein inventory of Staphylococcus aureus during in vitro biofilm growth in a flow reactor was analyzed by liquid-chromatography coupled to tandem mass-spectrometry (LC-MS/MS) analysis combined with metabolic footprint analysis. This analysis showed that anaerobiosis within biofilms releases organic acids lowering the ECM pH. This, in turn, leads to protonation of alkaline proteins – mostly ribosomal proteins originating from cell lysis as well as actively secreted virulence factors – resulting in a positive net charge of these proteins. As a consequence, these proteins accumulate within the ECM and form an electrostatic network with negatively charged cell surfaces, eDNA, and metabolites contributing to the overall biofilm stability.
In article II, the in vivo metaproteome of the multi-species biofilm community in cystic fibrosis sputum was investigated. To this end, an innovative protocol was developed allowing the enrichment of microbial cells, the extraction of proteins from a small amount of cystic fibrosis sputum, and subsequent metaproteome analysis. This protocol also allows 16S sequencing, metabolic footprint analysis, and microscopy of the same sample to complement the metaproteome data. Applying this protocol, we were able to significantly enhance microbial protein coverage providing first insights into important physiological pathways during CF lung infection. A key finding was that the arginine deaminase pathway as well as microbial proteases play a so far underappreciated role in CF pathophysiology.
In articles III and IV, a novel treatment strategy for biofilms formed by the important fungal pathogen Candida albicans was evaluated in vitro. Biofilms were treated with two different sources of nonthermal plasma (with the Nonthermal Plasma Jet “kINPen09” as well as with the Microwave-induced plasma torch “MiniMIP”) and the effect on growth, survival, and viability was assessed by counting colony-forming units (CFU), by cell proliferation assays, as well as by live/dead staining combined with fluorescence microscopy, confocal laser scanning microscopy, (CLSM) and atomic force microscopy (AFM). These tests revealed that biofilms were effectively inactivated mostly on the bottom side of biofilms, indicating a great potential of these two plasma sources to fight biofilms.
Auf den inneren und äußeren Oberflächen des Menschen existieren zahlreiche Mikrohabitate mit limitiertem Sauerstoffangebot. Vor allem während infektiöser Vorgänge kann aufgrund einwandernder Neutrophile die Sauerstoffkonzentration im menschlichen Gewebe auf unter 1% sinken. Eine rasche Anpassung an das vorherrschende Sauerstofflevel und die Nutzung effizienter alternativer Atmungsformen oder des Gärungsstoffwechsels sind deshalb entscheidend für das mikrobielle Überleben im menschlichen Wirt. In der vorliegenden Dissertationsarbeit wurde die anaerobe Genexpression von Staphylococcus aureus sowie die zugrundeliegenden regulatorischen Mechanismen näher untersucht. Die sich in vier Teile gliedernde Arbeit befasst sich zunächst mit einer eingehenden Beschreibung der anaeroben Adaptation und Physiologie von S. aureus auf Ebene des Transkriptoms, der Proteinsynthese und des extrazellulären Metaboloms. Die Identifikation eines konservierten Sequenzmotivs (inverted repeat) vor zahlreichen anaerob induzierten Genen war Ausgangspunkt für die Untersuchung der entsprechenden regulatorischen Vorgänge im zweiten Teil dieser Arbeit. Diese führten letztlich in Kooperation mit Arbeitsgruppen aus den USA, Schweden und Deutschland (AG R. Proctor, Universität Wisconsin; AG C. von Wachenfeldt, Universität Lund; AG C. von Eiff, Universität Münster; AG M. Lalk, Universität Greifswald) zu der Identifikation des Rex Proteins (SACOL2035) als zentraler Regulator der anaeroben Genexpression in S. aureus. Neben der Rex-abhängigen Expressionskontrolle wurde in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Friedrich Götz (Universität Tübingen) auch der Einfluss des Zwei-Komponenten¬systems NreBC auf die Genexpression in S. aureus näher untersucht. Auf Ebene des Transkriptoms, Proteoms und Metaboloms konnte so die essentielle Bedeutung des NreBC-Systems für die Expression der dissimilatorischen Nitrat- und Nitritreduktasen in S. aureus nachgewiesen werden. Der dritte Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Einordnung des anaeroben Proteinsynthese¬musters (Proteomsignatur) in den Kontext zahlreicher anderer stressinduzierter Proteomsignaturen von S. aureus. Die aus diesem komplexen Vergleich gewonnenen Ergebnisse geben detaillierte Einblicke in die Spezifitäten und Gemeinsam¬keiten der Proteinsynthese von S. aureus als Reaktion auf oxidativen Stress (H2O2, Diamid und Paraquat), nitrosativen Stress (NO), Sauerstofflimitation in An- und Abwesenheit von Nitrat, Hitzestress (48°C) sowie subinhibitorische Antibiotikakonzentrationen (Puromycin, Mupirocin). Für die Bereitstellung der entsprechenden Daten wurde im Rahmen dieser Arbeit zudem ein mySQL-basiertes System entwickelt, das die Visualisierung der Daten mit komplexen Abfrage- und Filtermöglichkeiten verknüpft (http://www.aureolib.de). Im letzten Teil gibt diese Arbeit schließlich einen Überblick über die Leistungen und Möglichkeiten der Proteomanalyse hinsichtlich physiologischer und infektionsrelevanter Fragestellungen. Besondere Beachtung findet hier die Aufklärung und Struktur des bereits erwähnten Rex Modulons.
Ziel der Dissertation war die Untersuchung der physiologischen Adaptation von Staphylococcus aureus an Vancomycin und Linezolid mit Hilfe der Proteom-Analytik und die Entwicklung neuer Methoden für Proteom-Untersuchungen. Für die Untersuchung der Vancomycinstress-Antwort im ersten Teil der Doktorarbeit wurden alle vier Subproteome mit insgesamt sechs verschiedenen Methoden untersucht. Es konnte mehr als die Hälfte des theoretischen Proteoms quantifiziert werden, die Arbeit ist damit eine der umfassendsten Proteom-Studien, die bisher in S. aureus durchgeführt wurden. Es wurden verschiedene Enzyme der Biosynthese von Aminosäuren, die im Peptidoglykan-Vorläufer-Pentapeptid vorkommen, nach Vancomycin-Stress in signifikant erhöhter Menge nachgewiesen. Das ist ein Hinweis auf eine erhöhte Peptidoglykan-Synthese, wie sie auch in S. aureus Stämmen mit verminderter Vancomycin-Sensitivität beobachtet werden kann. Die Abundanz SaeRS-kontrollierter Virulenzfaktoren war nach Vancomycin-Stress vermindert. In der Vancomycin-Studie wurden extrazelluläre Proteine mit einer Trichloressigsäure (TCE)-Fällung gefällt, diese Methode ist in der Proteom-Analytik weit verbreitet. Die TCE-Fällung hat verschiedene Nachteile. Nach der Fällung muss das entstandene Pellet mehrfach gewaschen werden, hierbei kommt es zu Verlusten und die Reproduzierbarkeit sinkt. Aufgrund dieser Nachteile wurde im zweiten Teil der Dissertation ein neues Protokoll zur Anreicherung verdünnter Proteine entwickelt. Grundlage war das kommerziell erhältliche Festphasenextraktions-System StrataClean, das ursprünglich zur Entfernung von Proteinen aus PCR-Ansätzen entwickelt wurde. Im Rahmen der Doktorarbeit wurde die StrataClean-Extraktion für die gel-freie Proteom-Analytik optimiert. Der wichtigste Schritt war eine Präinkubation der StrataClean-Partikel in Salzsäure, um Kontaminationen an den Partikeln quantitativ abzubauen. Mit dem optimierten Protokoll konnten Proteine auch aus sehr stark verdünnten Lösungen (20 µg Protein in 200 ml Flüssigkeit) mit hoher Effizienz reproduzierbar angereichert werden. Diese hoch-effiziente Anreicherung ist mit keinem anderen etablierten Protokoll möglich. Zudem konnte gezeigt werden, dass die StrataClean Fällung Proteine unabhängig von ihren biophysikalischen Eigenschaften anreichert. Daher ist die StrataClean-Aufreinigung auch für absolute Quantifizierungsansätze interessant. Als weitere Anwendung können StrataClean-gebundene Proteine für mehr als 10 Tage bei Raumtemperatur gelagert werden. Das ermöglicht den Versand von Proteinproben auf dem normalen Postweg ohne aufwendige Kühlsysteme. Im dritten Teil der Doktorarbeit wurde die Linezolid-Adaptation von S. aureus USA300 analysiert. In Wachstumsversuchen konnte gezeigt werden, dass nach Linezolid-Zugabe zu exponentiell wachsenden Zellen bei OD 0.5 die Wachstumsrate sofort abnahm. Bei OD 1.6 – 2 trat ein temporärer Wachstumsarrest auf, dessen Dauer von der zugegebenen Linezolid-Konzentration abhing. Nach diesem Wachstumsarrest, der bis zu 15 Stunden anhielt, fingen die Zellen wieder an sich zu teilen. Es konnte gezeigt werden, dass die Linezolid-Konzentration im Medium während des kompletten Versuches konstant blieb. Die Hauptanpassung an Linezolid war eine verstärkte Expression der Gene ribosomaler Proteine und eine daraus folgende erhöhte Akkumulation der ribosomalen Proteine. Zudem konnte eine generelle Abnahme der Menge integraler Membranproteine und sekretierter Proteine festgestellt werden, auch wenn die Expression der codierenden Gene zunahm. Mittels elektronenmikroskopischer Analysen konnte gezeigt werden, dass die Zellen nach Linezolid-Zugabe deutlich größer wurden. Als weitere morphologische Auswirkung von Linezolid-Stress war die Dicke der Zellwand um den Faktor vier erhöht und es wurden Defekte in der Zellteilung beobachtet. Insbesondere nach Wiederaufnahme des Wachstums gab es zahlreiche zelluläre Strukturen, die mehrere, zum Teil falsch positionierte, Septen hatten. Mit Fluoreszenz-Mikroskopie wurde bewiesen, dass sich das Chromosom, das im normalen Wachstum das Cytosol ausfüllt, nach Linezolid-Zugabe komprimierte und den Kontakt zur Membran verlor. Eine Verbindung zwischen Chromosom und Membran wird durch Transertions-Komplexe gebildet. Transertion bezeichnet die simultane Transkription, Translation und Translokation integraler Membranproteine, dabei werden Komplexe aus Chromosom, mRNA, Ribosom, dem entstehendem Protein und den membranständigen SEC-Proteintransportern gebildet. Aus der Kombination der Ergebnisse wurde geschlossen, dass durch die Linezolid ausgelöste Translations-Hemmung die Transertionskomplexe aufgelöst werden und dadurch die Protein-Translokation vermindert wird. Auch die Defekte in der Zellteilung können so erklärt werden, da so das Chromosom eine Struktur-gebende Funktion für die Zellteilung verliert. Bisher war nicht vollständig bekannt, wie die strukturelle Ordnung in der Zellteilung von Staphylokokken entsteht.