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Funktionelle Analyse der Interaktion pleiotroper Faktoren der Histonmodifizierung mit spezifischen Regulatoren der Phospholipidbiosynthese in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

  • Die Regulation der Phospholipid-Biosynthesegene in der Hefe Saccharomyces cerevisiae erfolgt über die Verfügbarkeit der Phospholipid-Vorstufen Inositol und Cholin (IC). Bei ICMangelbedingungen wird die Transkription der Strukturgene stimuliert und bei IC-Überschuss im Medium reprimiert. Im Promotorbereich dieser Gene befinden sich spezifische UAS-Elemente („inositol/choline-responsive element“, ICRE-Motive), welche von den Aktivatoren Ino2 und Ino4 gebunden werden. Bei IC-Mangel kommt es zu einer Anhäufung des Intermediats Phosphatidsäure, wodurch der Repressor Opi1 durch die Interaktion mit Scs2 außerhalb des Zellkerns am endoplasmatischen Reticulum gebunden wird. Wenn ausreichend IC im Medium vorhanden ist, kann der Repressor Opi1 in den Zellkern einwandern und den Aktivator Ino2 binden. Ferner kann Opi1 über seine Opi1-Sin3-Interaktionsdomäne (OSID) mit der PAH1 („paired amphipathic helix“) des Corepressors Sin3 interagieren. Ein Ziel dieser Arbeit war es, ausgewählte Aminosäuren in der OSID durch gerichtete Mutagenese gegen Alanin auszutauschen und die erhaltenen Opi1-Varianten auf ihre Repressorfunktion hin zu untersuchen. Die Substitution einzelner Aminosäuren innerhalb der OSID offenbarte die Notwendigkeit der Aminosäuren L56, V59 und V67 für die Opi1-Sin3 Bindung. Die Ergebnisse legten außerdem nahe, dass die Repression nicht allein über Sin3 vermittelt wird. Tatsächlich konnte gezeigt werden, dass die innerhalb der OSID von Opi1 kritischen Aminosäuren der Opi1-Sin3 Bindung (L56, V59 und V67) auch für die Interaktion von Opi1 mit Cyc8 wichtig sind. Dementsprechend rekrutiert Opi1 mit Hilfe der OSID zwei pleiotrope Corepressoren. Sin3 bindet über die PAH1 an die OSID, während die Opi1-Cyc8- Bindung über die TPR-Motive im Cyc8 vermittelt wird. Desweiteren zeigte sich, dass die sin3 cyc8 Doppelmutante synthetisch letal ist. Sin3 ist eine Untereinheit in mehreren Komplexen der Histondeacetylase (HDAC) Rpd3 und fungiert als Plattform für viele Protein-Protein Wechselwirkungen. Innerhalb des Sin3/Rpd3LKomplexes wurde der Einfluss mehrerer Untereinheiten (Pho23, Sap30, Sds3, Ume1 und Dep1) untersucht. Hier zeigte sich, dass Pho23 einen entscheidenden Einfluss auf die Regulation ICRE-abhängiger Gene hat. In den sich anschließenden Interaktionsanalysen konnte eine Bindung von Pho23, Sds3 und Sap30 an Sin3 gezeigt werden. Eine genauere Kartierung der Pho23-Sin3 Bindung zeigte, dass Pho23 über zwei voneinander unabhängige Domänen (Pho23-Sin3-Interaktionsdomäne; PSID1 und PSID2) mit Sin3 wechselwirkt, wobei die Interaktion der PSID1 und der PSID2 mit der HID (HDAC-Interaktionsdomäne) im Sin3 erfolgt. Die katalytische Aktivität innerhalb der Sin3/Rpd3-Komplexe ist durch die HDAC Rpd3 gegeben. Durch Untersuchungen der HDACs der Klasse I (Rpd3, Hos1 und Hos2) bzw. der Klasse II (Hda1 und Hos3) konnte für ICRE-abhängige Genorte gezeigt werden, dass eine rpd3 hda1 hos1 Dreifachmutante ähnlich dereguliert ist wie eine sin3 Mutante. Bei Interaktionsstudien der HDACs Rpd3, Hda1 und Hos1 mit Sin3 konnten neben der bereits bekannten HID im Sin3 (aa 801-1100) zwei neue HIDs (HID2: aa 473-600, HID3: aa 1100- 1210) identifiziert werden. Die Histondeacetylase Rpd3 bindet an die HID1 und an die HID3, während Hda1 und Hos1 jeweils an HID2 und HID3 binden. Interessanterweise stellte sich heraus, dass die Bindedomäne für die Sin3-Bindung innerhalb der Deacetylase-Domäne (DAC) aller drei HDACs liegt. Für Hos1 konnte die Sin3 Bindedomäne auf einen Aminosäurebereich von 236-400 eingegrenzt werden. Für die Hda1- Sin3 Bindung konnten zwei voneinander unabhängig interagierende Bereiche im Hda1 (aa 201-250 und aa 251-300) beschrieben werden. Neben der Deacetylierung wurde der regulative Einfluss einer weiteren kovalenten Histonmodifizierung, nämlich der der Methylierung durch Histonmethyltransferasen (HMT; Set1, Set2 und Dot1) und der Demethylierung durch Histondemethylasen (HDM; Jhd1, Jhd2, Ecm5, Gis1 und Rph1) auf die Genexpression der Phospholipid-Biosynthesegene untersucht. Hier konnte für die HMT Set2 (spezifisch für Lysin-36 im Histon H3) ein großer Einfluss auf die ICRE-abhängige Genexpression gezeigt werden. Desweiteren konnte gezeigt werden, das Set2 direkt an Ino2 bindet. Die Kartierung der Interaktionsdomäne offenbarte, dass die katalytische SET Domäne im Set2 mit der DNA-bindenden bHLHDomäne von Ino2 wechselwirkt.
  • The regulation of phospholipid biosynthetic genes in the yeast Saccharomyces cerevisiae depends on the availability of the precursor molecules inositol and choline (IC). Low levels of IC stimulate the transcription of structural genes, while high levels repress transcription. Promoter regions of these genes contain UAS elements (ICRE; inositol-choline responsive element) which are bound by the activators Ino2 and Ino4. In the absence of IC, the cellular concentration of the metabolite phosphatidic acid is high, leading to exclusion of Opi1 from the nucleus and its retention at the endoplasmatic reticulum via interaction with Scs2. At high concentrations of IC, Opi1 can enter the nucleus and interact with the activator Ino2. Furthermore, Opi1 also binds the paired amphipathic helix (PAH1) of corepressor Sin3 via its Sin3-Opi1-interaction domain (OSID). To analyze the previously mapped OSID in more detail, selected amino acids within OSID were replaced by alanine. It turned out that hydrophobic amino acids L56, V59 and V67 are important for ICRE-dependent gene regulation and also for Opi1-Sin3 binding. The results of this work also suggested that repression is not executed entirely via Sin3. Indeed, I could show that critical OSID residues are also important for contacting a second pleiotropic corepressor, Cyc8. Consequently, OSID of Opi1 binds to PAH1 of Sin3 and also to tetratricopeptide repeats (TPR) of Cyc8. Interestingly, the sin3 cyc8 double mutant turned out as synthetically lethal. Sin3 is a subunit of various complexes containing the histone deacetylase (HDAC) Rpd3 and works as a platform for multiple protein-protein interactions. I analyzed the influence of Pho23, Sds3, Sap30, Dep1 and Ume1 subunits of the Sin3-Rpd3L complex. Pho23 turned out as important for the regulation of ICRE-dependent gene expression. Subsequent in vitro interaction studies could show that Pho23, Sap30 and also Sds3 are able to directly bind Sin3. By high resolution mapping of Pho23-Sin3 interaction it was shown that two separate domains of Pho23 (Pho23-Sin3-interaction domain; PSID1 and PSID2) can interact with Sin3, binding to its previously described HDAC interaction domain (HID). The catalytical activity within the Sin3-Rpd3L complex is executed by HDAC Rpd3. The analysis of ICRE-dependent gene expression in mutant strains lacking HDACs class I (Rpd3, Hos1 and Hos2) and class II (Hda1 and Hos3) showed that a triple mutant rpd3 hda1 hos1 mimics the regulatory phenotype of a sin3 mutant. Using in vitro interaction studies comprising HDACs Rpd3, Hda1 and Hos1 it was established that Sin3 not only contains the well-known HID (aa 801-1100, now designated HID1) but two additional HIDs (HID2: aa 473- 600 and HID3: aa 1100-1210) as well. HDAC Rpd3 is able to bind HID1 and HID3 while Hda1 and Hos1 both bind HID2 and HID3. Interestingly, all HDAC binding domains for Sin3 contain their catalytic deacetylase domain (DAC). Hos1 is binding to Sin3 via a domain comprising amino acids 236-400. Hda1 can bind to Sin3 via two separate domains (aa 201-250 and aa 251-300). In addition to deacetylation, the regulatory influence of histon methylation (via histone methyltransferases HMT Set1, Set2 and Dot1) and histon demethylation (via histone demethylases HDM Jhd1, Jhd2, Ecm3, Rph1 and Gis1) on expression of phospholipid biosynthetic genes was also investigated. Influence of HMT Set2 (specific for lysine-36 in histone H3) on ICRE-dependent gene expression could be shown. Furthermore, direct binding of Set2 and Ino2 was demonstrated. Mapping of interaction domains revealed that the catalytic SET domain of Set2 interacts with the DNA-binding bHLH domain of Ino2.

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Metadaten
Author: Yvonne Jäschke
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001230-0
Title Additional (English):Functional analysis of interaction of pleiotropic factors of histone modification with specific regulators of phospholipid biosynthesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae
Advisor:Prof. Dr. Hans-Joachim Schüller
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2012/05/07
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2012/01/13
Release Date:2012/05/07
GND Keyword:Saccharomyces cerevisiae
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Mikrobiologie - Abteilung für Genetik & Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie