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Der Einfluss des Redoxzustandes von CRMP2 auf die Dynamik des Zytoskeletts

  • Glutaredoxine (Grxs) gehören zur Enzymgruppe der Oxidoreduktasen und sind Teil der Thioredoxin-Familie. Grxs katalysieren die reversible (De-)Glutathionylierung von Proteinen und die Reduktion von Protein-Disulfiden. Diese Aktivitäten sind entscheidend für diverse redoxvermittelte Signaltransduktionsprozesse in den verschiedenen Kompartimenten der Zelle. Zudem werden sie im Zusammenhang mit der neuronalen Entwicklung, neurodegenerativen Erkrankungen und der Krebsentstehung und -progression gesehen. Säugetiergenome kodieren vier Grxs (Grx1, Grx2, Grx3 und Grx5) mit zytosolischer, nukleärer oder mitochondrieller Lokalisation. Von humanem Grx2 wurden bisher drei Isoformen charakterisiert. Das mitochondrielle Grx2a wird ubiquitär exprimiert, während die nukleären und zytosolischen Isoformen Grx2b und Grx2c ein Vorkommen in Testes und Krebszellen aufweisen. Grx2c ist an der Aussprossung von Axonen beteiligt und daher entscheidend für die Hirnentwicklung. Die Überexpression von Grx2c in HeLa-Zellen führt zu einem elongierten Phänotyp mit filopodienartigen Ausläufern, der in vorangegangenen Studien gut beschrieben wurde. Als potentielles Ziel der Grx2c-Wirkung wurde das Collapsin response mediator protein 2 (CRMP2) identifiziert. In der Tat konnte ein Thiol-Disulfid-Schalter in CRMP2 ermittelt werden. Grx2c wurde als spezifische Reduktase identifiziert, während MICALs (molecule(s) interacting with CasL) als potentielle Oxidasen dieses Schalters vermutet werden. Basierend auf diesen vorangegangenen Ergebnissen erarbeiteten wir die Hypothese, dass der Thiol-Disulfid-Schalter in CRMP2 die Interaktion des Proteins mit Regulatoren der Aktinpolymerisation und -verzweigung (das heißt Sra1/Cyfip1 und wave regulatory complex) kontrolliert und dadurch die Dynamik des Zytoskeletts beeinflusst. Hauptsächliches Ziel der Arbeit war die Überprüfung dieser Hypothese. Besonders die Protein-Protein-Interaktionen und deren Abhängigkeit vom CRMP2-Redoxstatus sollten untersucht werden. Unter Verwendung von HeLa-Zellen und Grx2c-exprimierenden HeLa-Zellen (HeLa-Grx2c-Zellen) konnte mittels Immunopräzipitation und unter Verwendung quervernetzender Substanzen keine direkte Interaktion zwischen Sra1/Cyfip1 und CRMP2 festgestellt werden. Es zeigte sich jedoch eine Co-Immunopräzipitation von Sra1/Cyfip1 und MICAL2, was für eine direkte Interaktion der beiden Proteine spricht. Des Weiteren fanden sich bei Betrachtung von Bandenmustern nach in vivo Quervernetzung Anhaltspunkte für eine indirekte Interaktion von CRMP2 und MICAL2. Die Auswertung von Western Blots ergab teils deutliche kompensatorische Änderungen im Expressionsmuster der untersuchten Proteine bei Überexpression von Grx2c in HeLa-Zellen. So kam es zur Erhöhung der Sra1- und Beta-Aktin-Menge, während sich die MICAL2-Menge in der Zelle verringerte. Unter Berücksichtigung der Ergebnisse wurde ein neues Modell erstellt, welches auf einer indirekten Interaktion von CRMP2, MICAL2 und Sra1/Cyfip1 via Plexin A (Teil des Semaphorin3A-Rezeptors) beruht. In diesem Modell wirken MICAL2 über Oxidation und Grx2c über Reduktion von CRMP2, was zu konformationellen Änderungen des CRMP2s führt. Die oxidierte, geschlossene Konformation inhibiert Sra1 über Bindung an MICAL2, während die reduzierte, offenere Konformation zu einer Freigabe und Aktivierung von Sra1 führt und letztendlich in der Aktinpolymerisation und -verzweigung mündet. Dieser Mechanismus hat eine entscheidende Bedeutung in der Pathogenese verschiedenster Krebserkrankungen und neurodegenerativer Erkrankungen. Die weitere Beleuchtung der Rolle des Redoxschalters in CRMP2 und die genaue Kenntnis dessen Involvierung in spezifische Signalwege wie der Sema3A-Signalkaskade, basierend auf dem neu erstellten Modell, könnten zukünftig bei der Verwirklichung gezielter pharmakologischer Therapien gegen Krebserkrankungen und neurodegenerative Erkrankungen eingesetzt werden.
  • Glutaredoxins (Grxs) belong to the enzyme class of oxidoreductases and are part of the thioredoxin family of proteins. Grxs catalyze the reversible (de-)glutathionylation of proteins and the reduction of protein disulfides. These activities are crucial for various redox signaling events in the different compartments of the cell. Moreover, Grxs were implied in neuronal development, neurodegenerative diseases, and the development and progression of cancer. Mammalian genomes encode four Grxs, Grx1, Grx2, Grx3 and Grx5, with cytosolic, nuclear and mitochondrial localisation. Three isoforms of human Grx2, derived from alternative transcript variants, were characterized until today. Mitochondrial Grx2a is expressed ubiquitously, whereas the nuclear and cytosolic isoforms Grx2b and Grx2c are specific for testis and cancer cells. Grx2c is involved in the control of axonal outgrowth and thus essential for the development of the brain. The overexpression of Grx2c in HeLa cells induces a distinct elongated phenotype with numerous filopodia-like extensions, described in preceeding studies. Collapsin response mediator protein 2 (CRMP2) was identified as potential target of Grx2c. Indeed, a thiol-disulfide redox switch could be detected in CRMP2 and Grx2c was identified as specific reductase, whereas MICALs (molecule(s) interacting with CasL) were suspected to be the specific oxidases of this thiol switch. Based on these previous results, we hypothesized that the redox switch in CRMP2 might control the proteins interactions with regulators of actin nucleation and branching, i.e. Sra1/Cyfip1 and the wave regulatory complex, thereby regulating cytoskeletal dynamics. The major aim of this thesis was to put this hypothesis to the test. In particular, the proposed protein-protein interactions and their dependence on the redox state of CRMP2 were addressed. Applying immunoprecipitation and in-vivo-crosslinking using HeLa cells and Grx2c expressing HeLa cells (HeLa-Grx2c cells), we could, however, not detect a direct interaction between Sra1/Cyfip1 and CRMP2. Instead, we discovered a co-immunoprecipitation between Sra1/Cyfip1 and MICAL2, suggesting a direct interaction between these two proteins. Western blot signal pattern after in vivo crosslinking provided evidence for an indirect interaction between CRMP2 and MICAL2. Using Western blotting, we also observed significant compensatory changes in the expression pattern of the proteins investigated between HeLa control and HeLa-Grx2c cells. E.g. we observed higher Sra1- and beta-actin levels together with lower MICAL2 levels in HeLa-Grx2c-cells. Based on the results presented in this thesis, we propose a new model based on the indirect interaction of CRMP2, MICAL2 and Sra1/Cyfip1 via Plexin A (part of the semaphorin3A receptor). In this model MICAL2 acts through oxidation and Grx2c through reduction of CRMP2, leading to a conformational change in CRMP2. The oxidized, closed conformation sequestrates and inhibits Sra1 through MICAL2 binding, whereas the reduced, open conformation releases and activates Sra1, which in the end leads to actin nucleation and branching. This mechanism has a crucial role in the pathogenesis of various malignant and neurological diseases. Further studies on the role of the thiol-disulfide redox switch in CRMP2, the detailed knowledge of its involvement in specific signaling pathways, like the semaphorin 3A signaling pathway, based on our new model may evince, in the future, new therapeutical strategies targeting cancer and neurodegenerative diseases.

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Metadaten
Author: Christoph Voigt
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002464-3
Title Additional (English):The influence of the redox state of CRMP2 on cytoskeletal dynamics
Advisor:Dr. Christopher Horst Lillig, Prof. Dr. Reinhard Walther
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2016/03/21
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Universitätsmedizin (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2016/03/10
Release Date:2016/03/21
Tag:CRMP2, Grx2, MICAL, Protein-Protein-Interaktion, Sra1/Cyfip1
CRMP2, Grx2, MICAL, Sra1/Cyfip1, protein-protein interaction
GND Keyword:CRMP2, Grx2, MICAL, Protein-Protein-Interaktion, Sra1/Cyfip1
Faculties:Universitätsmedizin / Institut für Med. Biochemie u. Molekularbiologie
DDC class:600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 610 Medizin und Gesundheit