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Florian Gellert

• In this thesis, I was able to provide answers to transport processes in lipid monolayers, which are ultimately, all of biological relevance. In particular, I was interested in lipid oxidation and dynamic compression/expansion processes of surfactant monolayers at the air-water interface: Lipid oxidation was shown to be a consequence of the formation of a high concentration of reactive oxygen species (ROS) during cell respiration, which finally can lead to severe cell damage. It is not yet understood clearly, which part of the lipid molecules is especially prone to a ROS attack. I was particularly interested in the role of the double bonds of the acyl chains of the lipid molecules during oxidation. Further, I wanted to know the time scales of lipid interaction with the ROS. Compared to lipid vesicles, lipid monolayers have the advantage that many parameters of the system can be adjusted easily. In our system, I made use of this by setting the lateral pressure to low values during H2O2 treatment, which facilitated the ROS to reach the double bonds in the acyl chains. A prime example of biological systems out of thermal equilibrium was given in the alveolus surface, which is covered with a surfactant monolayer. During breathing, these monolayers undergo such a highly dynamic compression and expansion. Arising flows from breathing could disrupt a film and consequently, it would lose its protective role. One of my goals was to understand flows and their influence on domain shape. Dependent on the strength of the flows, I expected different growth regimes, with differing prevailing transport processes. Once understanding the underlying mechanisms in domain shaping would allow me to draw conclusions on biological systems. In order to address these questions, I established two systems, both based on the compression of lipid monolayers. I used isotherms to study the phase behavior of the lipids:9 During compression, the lipids can undergo phase transitions from the gaseous phase to the liquid expanded phase (LE-phase) and further from the LE-phase to the liquid condensed phase (LC-phase). A coexistence regime is observed in between the LE-phase and the LC-phase, characterized by a flat increase of lateral pressure with decreasing molecular area. Some lipids exhibited LC-phase domains. These were further investigated with Brewster angle microscopy (BAM). The used BAM was equipped with an integrated Scheimpflug optics, enabling an overall focused image plane. Furthermore, time-resolved observation of the growth of the domains was possible by recording videos (20 frames per seconds). The first system enabled the investigation of lipid peroxidation, when the lipids were exposed to ROS. I chose DMPC, POPC, DOPC and PLPC, since these are phospholipids differing in the number and position of double bonds in acyl chains, but not in the head group. I used a H2O2 enriched phosphate buffered saline (PBS) solution, which served as a precursor for more reactive ROS, like hydroxyls (.OH). PBS was chosen, since it resembles the cell environment best. During defined waiting times of H2O2 treatment, the ROS diffused vertically from the subphase towards the monolayer. The lipid molecules were in the LE-phase, which facilitated the ROS molecules to reach also the double bonds of the acyl chains. The oxidized monolayers were then compressed at constant compression speed. Since the corresponding isotherms could be measured with high precision, the relative area increase δA/A between oxidized and non-oxidized monolayer along the isotherm proved to be a good measure for lipid peroxidation. The area increase δA in the molecular area of the oxidized molecules was explained by the eventually added, more hydrophilic −OOH group at the position of a carbon atom adjacent to a double bond in the unsaturated acyl chain. The −OOH group is drawn to the hydrophilic head group of the lipid. This leads to a kink in the acyl chain, which increases the molecular area A by δA. A model, which explained this peroxidation process in lipid vesicles, could be adopted to monolayers. I compared the oxidation of phospholipids, differing in the number and position of the double bonds of their acyl chains. I found that δA/A increased with the growing number of double bonds in one acyl chain. However, a comparison of DOPC with POPC also showed the importance of the position of the acyl chain. I determined a slow reaction kinetic. It could be estimated by a √t dependence of the number density N_surface, which denominates the ROS sticking on the monolayer. The transport of ROS towards the monolayer was found to be diffusive, because it was the slowest process in the reaction. This interpretation was reinforced by a comparison of the temperature dependence of the relative area increase δA/A with the Stokes-Einstein diffusion coefficient of water molecules. The initial ROS concentration c_0 in the trough could be traced back (c_0~ 50 nM), which is indeed a realistic value found in human cells. Concluding, our results can be understood as a feasibility study. The complexity of the monolayer can be arbitrarily increased, for example by the addition of proteins, allowing the investigation of other oxidative processes occurring in the cell membrane. The second system allowed the investigation of growth of LC domains during fast compression processes of monolayers. I chose erucic acid monolayers, due to its low line tension and a continuous nucleation phase, enabling the formation of fractal domains. The monolayers were investigated with isotherms and BAM videos. Since v_C (compression speed of the monolayer) was continuous over the whole compression time, I had a system with well-defined hydrodynamic conditions. This allowed me a complete analysis of the system, starting with descriptive features of the observed domains to a classification of the observed growth regimes by means of hydrodynamic theory, through to the distinction and quantification of different kind of flows and supersaturations, involving Ivantsov theory: Dependent on the compression speed v_C, I observed seaweed or dendritic domains. The LE/LC phase transition pressure pi_t was slightly increased compared to pi_inf of the equilibrium isotherm. A high compression speed v_C induced a supersaturation Δc. I introduced the excess lateral pressure Δpi=pi-pi_inf as an appropriate quantity to describe the supersaturation Δc. I showed a linear behavior of Δc on Δpi. Δc is a macroscopic quantity since it is averaged over the whole monolayer area. I characterized the domains of the seaweed and dendritic regime with respect to tip radii, branch lengths, side branch separations and fractal dimensions. I calculated the growth speed of the main branches. A roughly doubling of the growth speed of dendritic domains, compared to seaweed domains was observed. This was an evidence of adjunctive (Marangoni) flow in the subphase. For each monolayer, I observed drifts during domain growth, which I explained by an anisotropy in the LE-phase, caused by the continuous nucleation of the domains. These kind of surface flows were superimposed to bulk flows in the subphase. Since I had a well established system, I could analyze the influence of these surface flows on domain shape, in terms of magnitude, direction and duration of the surface flows. I therefore used FFT spectra and directionality histograms. At low flows, the FFT showed six-fold symmetry. Higher drifts exhibited incisions in the FFT, eventually leading to dumbbell shaped FFTs at very high drifts. The domains grew preferentially in the direction parallel to the incision. I used directionality histograms to analyze the angular distribution of the growing domains. They showed that the drift direction always correlated with a minimum in the histogram. In order to analyze drift duration, I split the domain in downstream and upstream side. I could show that for small drift durations, downstream growth was preferred. However, for longer drift durations, the flows got more isotropic and consequently growth was more balanced then. I could observe only a weak correlation between drift velocity v_D and compression speed v_C. However, dendrites were formed when the compression speed v_C was high, while seaweed domains were formed when v_C was small. Domain distortion occurred in the same way, independent if seaweed or dendritic domains were considered. I further showed that hydrodynamic flows in the subphase and surface flows are superimposed and scale differently. Consequently, they have different impact on domain shape: hydrodynamic flows act on μm scale and influence the domain morphology (distance between side branches, and tip radius) and the growth speed of the main branches. Surface flows act on the mm to cm scale, cause an anisotropic flow in the LE phase surrounding the domain, and thus affect the overall domain shape. The anisotropy in the LE-phase led to a locally different degree of supersaturation. To take this into account, I introduced a local normalized supersaturation Δ, based on the Ivantsov solution. Therefore, I calculated Péclet numbers p of measured quantities of the system. I obtained values of 0.88 ≤Δ≤0.90 for the seaweed regime (p<5) and 0.93 ≤Δ≤0.96 for the dendritic regime (p>6). Since the Ivantsov solution can only be applied for purely diffusive processes, I applied a modified Ivantsov solution Δ_mod, which calculates Δ at a distance 𝛿 ahead of the dendrite tip. I was able to determine the progression of the diffusive layer 𝛿, however a quantitative determination failed. Applying hydrodynamic theory allowed me to classify the two growth regimes with respect to the Boussinesq number Bq. Since for both growth regimes, I achieved values of Bq<1, bulk viscous losses dominated over surface viscous losses. Further, a cross-over length 𝜉 was calculated, from which one can distinguish, whether advective transport dominates over diffusion. I further connected the two defined supersaturations Δ and Δc via the excess lateral pressure Δpi. From this, I saw differences in the seaweed and dendritic growth regimes: The local normalized supersaturation Δ of seaweed growth seemed to be quite stable for a further increase of the lateral excess pressure Δpi, whereas it reacted quite sensitive in the dendritic regime. This was found to be an indication of a non-equilibrium regime, caused by the strong coupling of the monolayer to the subphase. It reinforces therefore the theory of Marangoni-flow. The findings of this thesis emphasize the importance of understanding highly dynamic compression/expansion processes arising in surfactant monolayers. Using the example of the compression of the alveolus surface, it can be seen that a more realistic model of the pulmonary alveolus is not only enabled by increasing the complexity of the surfactant monolayer (e.g. by adding specific proteins or lipid mixtures to the monolayer). Equally important is the understanding in transport processes and the consequences for the monolayer structure. By the analysis of domain shapes, I presented a method, which is suitable for such a study.
• In dieser Arbeit konnte ich Antworten auf Transportprozesse in Lipidmonoschichten geben, die letztlich alle von biologischer Relevanz sind. Insbesondere interessierte ich mich für Lipidoxidation und dynamische Kompressions-/Expansionsprozesse von Lipid-Monoschichten an der Luft-Wasser-Grenzfläche: Es ist bekannt, dass die Lipidoxidation eine Folge einer hohen Konzentration reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) während der Zellatmung ist, die letztendlich zu schweren Zellschäden führen kann. Es ist noch nicht klar, welcher Teil der Lipidmoleküle besonders anfällig für einen ROS-Angriff ist. Besonders interessierte mich die Rolle der Doppelbindungen der Alkylketten der Lipidmoleküle bei der Oxidation. Darüber hinaus wollte ich die Zeitskalen der Lipidinteraktion mit den ROS bestimmen. Im Vergleich zu Lipidvesikeln haben Lipidmonoschichten den Vorteil, dass viele Parameter des Systems einfach angepasst werden können. In unserem System machte ich mir dies zunutze, indem ich den Laterarldruck während der H2O2-Behandlung auf niedrige Werte einstellte, was es den ROS erleichterte, die Doppelbindungen in den Alkylketten zu erreichen. Ein Paradebeispiel für biologische Systeme außerhalb des thermischen Gleichgewichts ist die Alveolenoberfläche, die mit einer Surfaktant-Monoschicht bedeckt ist. Beim Atmen erfahren diese Monoschichten eine hohe, dynamische Kompression und Expansion. Durch die Atmung entstehende Strömungen könnten den Surfaktantfilm zerstören und so zum Verlust der schützenden Funktion führen. Eines meiner Ziele war es, Flüsse und ihren Einfluss auf die Domänenform zu verstehen. Abhängig von der Stärke der Strömungen erwartete ich unterschiedliche Wachstumsregime mit unterschiedlich vorherrschenden Transportprozessen. Sobald ich die zugrundeliegenden Mechanismen der Domänenbildung verstanden hätte, könnte ich Rückschlüsse auf biologische Systeme ziehen. Um diese Fragen zu beantworten, habe ich zwei Systeme etabliert, die beide auf der Kompression von Lipidmonoschichten basieren. Ich habe Isothermen verwendet, um das Phasenverhalten der Lipide zu untersuchen: Während der Kompression können die Lipide Phasenübergänge von der gasförmigen Phase zur flüssigen expandierten Phase (LE-Phase) und weiter von der LE-Phase zur flüssigen kondensierten Phase (LC-Phase) durchlaufen. Zwischen der LE-Phase und der LC-Phase wird ein Koexistenzregime beobachtet, das durch einen flachen Anstieg des Lateraldrucks mit abnehmender Molekülfläche gekennzeichnet ist. Einige Lipide wiesen LC-Phasendomänen auf. Diese wurden mit Brewster-Winkelmikroskopie (BAM) weiter untersucht. Das verwendete BAM war mit einer integrierten Scheimpflug-Optik ausgestattet, die eine komplett fokussierte Bildebene ermöglichte. Darüber hinaus war eine zeitaufgelöste Beobachtung des Wachstums der Domänen durch die Aufnahme von Videos (20 Bilder pro Sekunde) möglich. Das erste System ermöglichte die Untersuchung der Lipidperoxidation, als die Lipide ROS ausgesetzt waren. Ich habe mich für DMPC, POPC, DOPC und PLPC entschieden: Phospholipide, die sich in der Anzahl und Position der Doppelbindungen in den Alkylketten unterschieden, nicht jedoch in der Kopfgruppe. Ich habe eine mit H2O2 angereicherte phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) verwendet, die als Vorstufe für reaktivere ROS wie Hydroxylionen diente. Die Wahl fiel auf PBS, da es die Zellumgebung am besten wiedergab. Während definierter Einwirkzeiten diffundierten die ROS vertikal von der Subphase in Richtung der Monoschicht. Die Lipidmoleküle befanden sich in der LE-Phase, was es den ROS-Molekülen erleichterte, auch die Doppelbindungen der Alkylketten zu erreichen. Die oxidierten Monoschichten wurden dann mit konstanter Kompressionsgeschwindigkeit komprimiert. Da die entsprechenden Isothermen mit hoher Präzision gemessen werden konnten, erwies sich die relative Flächenzunahme δA/A zwischen oxidierter und nichtoxidierter Monoschicht entlang der Isotherme als gutes Maß für die Lipidperoxidation. Die Flächenzunahme δA in der Molekülfläche der oxidierten Moleküle konnte durch Hinzufügen der hydrophilen −OOH-Gruppe an der Position eines Kohlenstoffatoms neben einer Doppelbindung in der ungesättigten Alkylkette erklärt werden. Die −OOH-Gruppe wird so zur Kopfgruppe des Lipids gezogen. Dies führt zu einem Knick in der Alkylkette, wodurch die Molekülfläche A um δA vergrößert wird. Ein Modell, das diesen Peroxidationsprozess in Lipidvesikeln erklärt, konnte auf Monoschichten übertragen werden. Ich habe die Oxidation von Phospholipiden verglichen, die sich in der Anzahl und Position der Doppelbindungen ihrer Alkylketten unterscheiden. Ich fand heraus, dass δA/A mit der wachsenden Anzahl von Doppelbindungen in einer Alkylkette zunahm. Ein Vergleich von DOPC mit POPC zeigte jedoch auch die Bedeutung der Position der Alkylkette. Ich habe eine langsame Reaktionskinetik festgestellt. Diese konnte durch eine √t-Abhängigkeit der Belegungsdichte N_surface abgeschätzt werden, die die an der Monoschicht haftenden ROS angibt. Der Transport von ROS zur Monoschicht erwies sich als diffusiv, da dies der langsamste Prozess in der Reaktion war. Diese Interpretation wurde durch einen Vergleich der Temperaturabhängigkeit der relativen Flächenzunahme δA/A mit dem Stokes-Einstein-Diffusionskoeffizienten von Wassermolekülen untermauert. Die anfängliche ROS-Konzentration c_0 im Trog konnte zurückverfolgt werden (c_0~ 50 nM), was tatsächlich ein realistischer Wert ist, der in menschlichen Zellen gefunden wird. Zusammenfassend können unsere Ergebnisse als Machbarkeitsstudie verstanden werden. Die Komplexität der Monoschicht kann beispielsweise durch die Zugabe von Proteinen beliebig erhöht werden, wodurch auch andere oxidative Prozesse in der Zellmembran untersucht werden können. Das zweite System ermöglichte die Untersuchung des Wachstums von LC-Domänen während schneller Kompressionsprozesse von Monoschichten. Ich habe mich für Erukasäure-Monoschichten entschieden, da diese eine geringe Linienspannung und eine kontinuierliche Keimbildungsphase aufweisen und die Bildung fraktaler Domänen ermöglichen. Die Monoschichten wurden mit Isothermen und BAM-Videos untersucht. Da v_C (Kompressionsgeschwindigkeit der Monoschicht) über die gesamte Kompressionszeit kontinuierlich war, hatte ich ein System mit wohldefinierten hydrodynamischen Bedingungen. Dies ermöglichte mir eine vollständige Analyse des Systems, beginnend mit beschreibenden Merkmalen der beobachteten Domänen über eine Klassifizierung der beobachteten Wachstumsregime mittels hydrodynamischer Theorie bis hin zur Unterscheidung und Quantifizierung verschiedener Arten von Strömungen und Übersättigungen unter Einbeziehung der Ivantsov-Theorie: Abhängig von der Kompressionsgeschwindigkeit v_C beobachtete ich Seegras oder dendritische Domänen. Der LE/LC-Phasenübergangsdruck pi_t war im Vergleich zu pi_inf der Gleichgewichtsisotherme leicht erhöht. Eine hohe Kompressionsgeschwindigkeit v_C induzierte eine Übersättigung Δc. Ich habe den Überschussdruck Δpi=pi-pi_inf als geeignete Größe zur Beschreibung der Übersättigung Δc eingeführt. Ich habe ein lineares Verhalten von Δc mit Δpi zeigen können. Δc ist eine makroskopische Größe, da sie über die gesamte Monoschichtfläche gemittelt wird. Ich habe die Domänen des Seegras- und Dendritenregimes bezüglich Spitzenradien, Astlängen, Seitenarmabständen und fraktaler Dimension charakterisiert. Ich habe die Wachstumsgeschwindigkeit der Hauptarme berechnet. Es wurde eine Verdoppelung der Wachstumsgeschwindigkeit dendritischer Domänen im Vergleich zu Seegrasdomänen beobachtet. Dies war ein Hinweis für einen Zusatzfluss (Marangoni) in der Subphase. Für jede Monoschicht beobachtete ich Drifts während des Domänenwachstums, die ich durch eine Anisotropie in der LE-Phase erklärte, die durch die kontinuierliche Keimbildung der Domänen verursacht wurde. Diese Art von Oberflächenströmungen wurden den Volumenströmungen in der Subphase überlagert. Da ich über ein gut etabliertes System verfügte, konnte ich den Einfluss dieser Oberflächenströmungen auf die Domänenform hinsichtlich Größe, Richtung und Dauer der Oberflächenströmungen analysieren. Ich habe dafür FFT-Spektren und Richtungshistogramme verwendet. Bei niedrigen Flüssen zeigte die FFT eine sechszählige Symmetrie. Höhere Drifts zeigten Einschnitte in der FFT, die schließlich bei sehr hohen Drifts zu hantelförmigen FFTs führten. Die Domänen wuchsen bevorzugt parallel zum Einschnitt. Ich habe Richtungshistogramme verwendet, um die Winkelverteilung der wachsenden Domänen zu analysieren. Sie zeigten, dass die Driftrichtung immer mit einem Minimum im Histogramm korrelierte. Um die Driftdauer zu analysieren, habe ich die Domäne in Downstream- und Upstream-Seite aufgeteilt. Ich konnte zeigen, dass für kurze Driftdauern das stromabwärts gerichtete Wachstum bevorzugt wurde. Bei längerer Driftdauer wurden die Strömungen jedoch isotroper und das Wachstum war dann ausgeglichener. Ich konnte nur eine schwache Korrelation zwischen Driftgeschwindigkeit v_D und Kompressionsgeschwindigkeit v_C beobachten. Allerdings bildeten sich Dendriten, wenn die Kompressionsgeschwindigkeit v_C hoch war, während sich Seegrasdomänen bildeten, wenn v_C klein war. Die Domänenverzerrung trat auf die gleiche Weise auf, unabhängig davon, ob Seegras- oder dendritische Domänen berücksichtigt wurden. Ich habe außerdem gezeigt, dass hydrodynamische Strömungen in der Subphase und Oberflächenströmungen sich überlagern und unterschiedlich skalieren. Folglich haben sie unterschiedliche Auswirkungen auf die Domänenform: Hydrodynamische Strömungen wirken im μm-Maßstab und beeinflussen die Domänenmorphologie (Abstand zwischen Seitenarmen und Spitzenradius) und die Wachstumsgeschwindigkeit der Hauptarme. Oberflächenströmungen wirken auf der Skala von mm bis cm, verursachen eine anisotrope Strömung in der die Domäne umgebenden LE-Phase und beeinflussen somit die gesamte Domänenform. Die Anisotropie in der LE-Phase führte zu einem lokal unterschiedlichen Grad der Übersättigung. Um dies zu berücksichtigen, habe ich eine lokal normalisierte Übersättigung Δ eingeführt, die auf der Ivantsov-Lösung basiert. Daher habe ich die Péclet-Zahlen p aus gemessenen Größen des Systems berechnet. Ich habe Werte von 0,88 ≤ Δ ≤0,90 für das Seegrasregime (p<5) und 0,93 ≤ Δ ≤0,96 für das dendritische Regime (p>6) erhalten. Da die Ivantsov-Lösung nur auf rein diffusive Prozesse angewendet werden kann, habe ich eine modifizierte Ivantsov-Lösung Δ_mod bestimmt, die Δ in einem Abstand 𝛿 vor der Dendritenspitze berechnet. Den Verlauf der Diffusionsschicht 𝛿 konnte ich zwar bestimmen, eine quantitative Bestimmung war jedoch nicht möglich. Mithilfe der hydrodynamischen Theorie konnte ich die beiden Wachstumsregime anhand der Boussinesq-Zahl Bq klassifizieren. Da ich für beide Wachstumsregime Werte von Bq<1 erhielt, dominierten die Volumenviskositätsverluste gegenüber den Oberflächenviskositätsverlusten. Darüber hinaus wurde eine Crossover-Länge 𝜉 berechnet, anhand derer unterschieden werden kann, ob der advektive Transport gegenüber der Diffusion dominiert. Die beiden so definierten Übersättigungen Δ und Δc habe ich außerdem über den lateralen Überschussdruck Δpi verknüpft. Daraus habe ich Unterschiede im Seegras- und dendritischen Wachstumsregime erkannt: Die lokal normalisierte Übersättigung Δ des Seegraswachstums schien für einen weiteren Anstieg des lateralen Überschussdrucks Δπ recht stabil zu sein, wohingegen sie im dendritischen Regime recht empfindlich reagierte. Dies ist ein Hinweis auf ein Nichtgleichgewichtsregime, das durch die starke Kopplung der Monoschicht an die Subphase verursacht wird. Es bestärkt daher die Theorie von Marangoni-Fluss. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstreichen die Bedeutung dynamischer Kompressions-/Expansionsprozesse, die in Surfaktant-Monoschichten auftreten. Am Beispiel der Kompression der Alveolenoberfläche lässt sich erkennen, dass ein realistischeres Modell der Lungenalveole nicht nur durch die Erhöhung der Komplexität der Surfaktant-Monoschicht (z. B. durch Zugabe spezifischer Proteine oder Lipidmischungen zur Monoschicht) ermöglicht wird. Ebenso wichtig ist das Verständnis der Transportprozesse und deren Konsequenzen für den Monoschichtaufbau. Mit der Analyse von Domänenformen habe ich eine Methode vorgestellt, die für eine solche Untersuchung geeignet ist.