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Elias Eger

• Antimicrobial resistance (AMR) is of paramount importance in the context of One Health, an integrated and unifying approach that aims to achieve a sustainable balance in the well-being of people, domestic and wild animals, plants, and their shared environments. Whenever bacteria become resistant to the therapeutic effects of antibiotics, they can cause infections that are difficult to treat effectively, increasing the risk of severe disease progression and death. Although AMR can develop naturally over time and is per se “ancient”, the excessive use of antibiotics in human and veterinary medicine over the past century has significantly accelerated its emergence and spread. Opportunistic Gram-negative enterobacteria, particularly Escherichia coli (E. coli ) and Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) strains, increasingly exhibit resistance to multiple classes of clinically used antibiotics, thus presenting multidrug-resistant (MDR) phenotypes. To make matters worse, some of these strains combine multidrug resistance with high-level virulence, posing a threat to both immunocompromised and healthy individuals. Consequently, MDR E. coli and K. pneumoniae have been designated as high-risk pathogens by the World Health Organization, underscoring the urgent need for new antibiotic development. This thesis is motivated by the fact that only a limited number of international high-risk clonal E. coli and K. pneumoniae lineages stand out across all One Health dimensions and dominate the broad pool of MDR enterobacteria. While we only know little about the underlying drivers and contributing factors impacting their occurrence, emergence, and adaptation across different ecologies, this thesis employs a diverse range of bioinformatics and phenotypic approaches to identify the key factors important for the success of these lineages, also in rather under-explored settings. It includes three main components: (i) the analysis of genomic survey data of MDR E. coli isolates from ecologies in sub-Saharan Africa, (ii) the application of functional genomics and phenotyping techniques to characterize bacterial virulence and assess its clinical relevance in a food-borne E. coli strain, and (iii) the investigation of evolutionary pathways that promote the development of resistance to a novel drug combination and exploring compensatory mechanisms in a K. pneumoniae strain. To achieve these objectives, this research integrates genomics and transcriptomics with molecular biology and functional studies encompassing a comprehensive set of in vitro and in vivo virulence and resilience assays to explore MDR bacteria in-depth. We provide compelling evidence for the broad occurrence of successful high-risk clonal lineages in the One Health context and their circulation among clinics, wildlife, and food in international locations. In the first study, we isolated extended-spectrum β-lactamase (ESBL)-producing E. coli strains from houseflies collected from various wards at the University Teaching Hospital of Butare (Rwanda). In a follow-up study, we then examined in-depth the genomes of additional ESBL-producing E. coli from the same clinic and obtained from hospitalized patients, their caregivers, associated community members, and pets. The analyses revealed that the sample sets from this sub-Saharan African context consisted predominantly of globally recognized E. coli lineages, including sequence types (ST)131, ST167, ST410, and ST617. They play a pivotal role in the further dissemination and stabilization of AMR across diverse habitats within the One Health context. Moreover, our genomic results emphasize that these One Health-related high-risk clonal lineages exhibit the ability to successfully combine multidrug resistance with high-level bacterial virulence. To gain a more detailed understanding of the sophisticated interplay of virulence and AMR, we developed and refined a set of in vitro and in vivo methods for virulence phenotyping. These methodologies enabled us to characterize pathogens based on crucial clinical aspects such as biofilm formation, siderophore secretion, resistance to complement-mediated killing, and their capacity to cause mortality in Galleria mellonella larvae. By using a food-borne E. coli strain from an internationally recognized high-risk clonal lineage, we verified the remarkable combination of a MDR phenotype with clinically significant virulence properties, including synthesis of curli fibers and cellulose as part of biofilm formation, extensive secretion of siderophores, resilience against complement-containing human serum and pronounced mortality in the infection model. Nevertheless, the success of One Health-related high-risk clonal lineages does not rely solely on an “ideal” synergistic interplay between bacterial virulence and AMR. It also depends on their ability to rapidly mitigate the fitness costs associated with AMR acquisition, as these costs manifest in the form of reduced competitiveness and virulence in the absence of antibiotics. However, this is at odds with the observation of the global distribution of One Health-related high-risk clonal lineages across various One Health dimensions, even in environments with expectedly low selection pressures. To comprehensively address this, we conducted experimental evolution studies selecting for ceftazidime-avibactam-resistant mutants, which illuminated the rapid adaptations to changing environments. The adaptations and compensatory mechanisms were seemingly driven by major bacterial regulators, including the envelope stress response regulator RpoE on genomic and transcriptomic levels. In conclusion, the results of this thesis shed light on the fundamental principles that govern the character and interplay between AMR and bacterial virulence and advance our understanding of the contributors and drivers of successful MDR international high-risk clonal lineages in the One Health context. This is also important for effective and alternative intervention strategies to prospectively further address the global threat of AMR.
• Die Problematik der antimikrobiellen Resistenz (AMR) steht im Mittelpunkt des One Health Konzepts. Dieses Konzept umfasst einen ganzheitlichen Ansatz zur Sicherstellung eines nachhaltigen Gleichgewichts für das Wohlergehen von Menschen, domestizierten und wildlebenden Tieren, Pflanzen sowie ihrer gemeinsamen Umwelt. Wenn Bakterien gegen die therapeutische Wirkung von Antibiotika resistent werden, können sie Infektionen verursachen, die nur schwer wirksam zu behandeln sind und das Risiko eines schwerwiegenden Krankheitsverlaufs oder sogar des Todes erhöhen. Obwohl sich AMR im Laufe der Zeit natürlich entwickeln kann und daher an sich „vorzeitlich“ ist, hat der übermäßige Einsatz von Antibiotika in der Human- und Veterinärmedizin im letzten Jahrhundert ihr Auftreten und ihre Verbreitung erheblich beschleunigt. Opportunistische gramnegative Enterobakterien, darunter insbesondere Stämme von Escherichia coli (E. coli ) und Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), weisen zunehmend Resistenzen gegen mehrere Klassen klinisch eingesetzter Antibiotika auf und zeigen somit multiresistente (MR) Phänotypen. Das Problem wird dadurch verschärft, dass einige dieser Stämme nicht nur MR, sondern auch hochvirulent sind, was sowohl für immungeschwächte als auch für gesunde Individuen ein ernsthaftes Risiko darstellt. Aus diesem Grund wurden MR E. coli und K. pneumoniae von der Weltgesundheitsorganisation als Hochrisikoerreger eingestuft, was den dringenden Bedarf an der Entwicklung neuer Antibiotika unterstreicht. Diese Dissertation ist durch die Tatsache motiviert, dass nur eine begrenzte Anzahl internationaler Hochrisiko-Klonlinien von E. coli und K. pneumoniae in allen Dimensionen des One-Health-Konzepts prävalent sind und die große Gruppe der MR Enterobakterien dominieren. Obwohl nur wenig über die zugrundeliegenden bakteriellen Triebkräfte und Faktoren bekannt ist, die ihr Auftreten, ihre Evolution und ihre Anpassung in verschiedenen Ökosystemen beeinflussen, verwendet diese Dissertation eine Vielzahl bioinformatischer und phänotypischer Methoden, um die Schlüsselfaktoren zu identifizieren, die für den Erfolg dieser klonalen Linien, auch in weniger erforschten Umgebungen, entscheidend sind. Die Arbeit gliedert sich daher in drei Hauptkomponenten: (i) die Analyse genomischer Daten von MR E. coli Stämmen aus Ökosystemen in Afrika südlich der Sahara, (ii) die Anwendung funktioneller Genomik und Phänotypisierung zur Charakterisierung der bakteriellen Virulenz und zur Bewertung der klinischen Relevanz am Beispiel eines E. coli Stammes aus rohem Fleisch und (iii) die Untersuchung der evolutionären Wege, die die Resistenzentwicklung gegenüber einer neuartigen Kombination von Wirkstoffen begünstigen, einschließlich der Untersuchung kompensatorischer Mechanismen in einem K. pneumoniae Stamm. Um diese Ziele zu erreichen, werden Genomik und Transkriptomik mit Molekularbiologie und funktionellen Studien kombiniert, einschließlich einer umfassenden Reihe von in vitro- und in vivo-Virulenz- und Resilienztests, um MR Bakterien im Detail zu untersuchen. Unsere Forschung präsentiert überzeugende Belege für das breitete Vorkommen von erfolgreichen Hochrisiko-Klonlinien im One-Health-Kontext, die sich in Krankenhäusern, der Tierwelt und Lebensmitteln an verschiedenen internationalen Standorten verbreiten. In unserer ersten Studie isolierten wir extended-spectrum β-lactamase (ESBL)-produzierende E. coli Stämme aus Stubenfliegen, die in verschiedenen Abteilungen des Universitätskrankenhauses in Butare (Ruanda) gesammelt wurden. In einer anschließenden Studie analysierten wir die Genome weiterer ESBL-produzierender E. coli Stämme aus derselben Klinik. Diese Stämme wurden sowohl von hospitalisierten Patienten, deren Betreuern sowie von Familienmitgliedern und Haustieren isoliert. Die Analysen zeigten, dass sich die Proben aus diesem subsaharisch-afrikanischen Kontext hauptsächlich aus international anerkannten E. coli Klonlinien zusammensetzten, einschließlich der Sequenztypen (ST)131, ST167, ST410 und ST617. Diese Klonlinien spielen daher eine entscheidende Rolle bei der weiteren Verbreitung und Konsolidierung von AMR in verschiedenen Habitaten des One-Health-Kontextes. Darüber hinaus unterstreichen unsere genomischen Ergebnisse, dass diese One-Health-bezogenen Hochrisiko-Klonlinien die Fähigkeit besitzen, erfolgreich Multiresistenz mit hoher bakterieller Virulenz zu kombinieren. Um dieses komplexe Zusammenspiel von Virulenz und AMR besser zu verstehen, haben wir eine Reihe von in vitro- und in vivo-Methoden zur Phänotypisierung der Virulenz entwickelt und optimiert. Diese Methoden ermöglichen die Charakterisierung von MR Bakterien hinsichtlich klinisch relevanter Aspekte, wie der Biofilmbildung, der Sekretion von Siderophoren, der Resistenz gegen Komplement-vermittelte Abtötung und ihrer Fähigkeit, Infektionen in Galleria mellonella Larven hervorzurufen. Unter Verwendung eines E. coli Stammes, der zu einer international anerkannten Hochrisiko-Klonlinie gehört und in Lebensmitteln gefunden wurde, konnten wir die bemerkenswerte Kombination eines MR Phänotyps mit klinisch bedeutsamen Virulenzeigenschaften, einschließlich der Synthese von Curli Fasern und Zellulose als Teil der Biofilmbildung, einer ausgeprägten Siderophor-Sekretion, der Widerstandsfähigkeit gegenüber menschlichem Serum und einer deutlichen Mortalität im Infektionsmodell bestätigt. Der Erfolg von One-Health-bezogenen Hochrisiko-Klonlinien beruht jedoch nicht nur auf einem „idealen“ synergistischen Zusammenspiel zwischen bakterieller Virulenz und AMR. Vielmehr resultiert er auch aus der Fähigkeit der MR Bakterien, die mit dem Erwerb von AMR verbundenen Fitnesskosten schnell zu reduzieren, um ihre Konkurrenzfähigkeit und Virulenz in Abwesenheit von Antibiotika aufrechtzuerhalten. Um dies umfassend zu untersuchen, haben wir experimentelle Evolutionsstudien durchgeführt, bei denen Mutanten selektiert wurden, die gegen Ceftazidim-Avibactam resistent sind. Diese Mutanten zeigten schnelle Anpassungen an veränderte Umweltbedingungen. Die Anpassungen und Kompensationsmechanismen scheinen auf genomischer und transkriptomischer Ebene durch wichtige bakterielle Regulatoren, wie den Regulator der membranständigen Stressantwort RpoE, gesteuert zu werden. Zusammenfassend tragen die Ergebnisse dieser Dissertation dazu bei, grundlegende Prinzipien aufzuklären, die den Charakter und die Interaktion von AMR und bakterieller Virulenz bestimmen. Gleichzeitig erweitern sie unser Verständnis der Faktoren und treibenden Kräfte erfolgreicher internationaler MR Hochrisiko-Klonlinien im One-Health-Kontext. Diese Erkenntnisse sind auch wichtig für die Entwicklung effektiver und alternativer Interventionsstrategien, um der globalen Bedrohung durch AMR proaktiv zu begegnen.