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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002452-0

Regulation des ABC-Transporters MRP4 (ABCC4)

  • Das MRP4(ABCC4)-Protein gehört zur ABC-Transporter-Familie und ist neben einem vielfältigen Expressionsmuster durch ein sehr breites Substratspektrum charakterisiert. Es wird in zahlreichen Geweben, beispielsweise in der Niere, im Gehirn, in Blutzellen und in vaskulären glatten Muskelzellen exprimiert. Das MRP4-Protein vermittelt den Efflux und damit auch Resistenz gegenüber einer großen Anzahl exogener Substanzen, wie z.B. Nukleosid-basierten Standardtherapeutika der antiviralen und zytostatischen Krebstherapie, aber auch den zellulären Export verschiedener endogener Signalmoleküle insbesondere von zyklischen Nukleotiden. Der Export zyklischer Nukleotide durch MRP4 gewann hinsichtlich der Beeinflussung intrazellulärer cAMP-Spiegel in jüngster Vergangenheit immer mehr an Beachtung. Während die Daten zur Expression und zum Substratspektrum von MRP4 schon recht umfangreich sind, ist bislang sehr wenig über die Regulationsmechanismen des Transporters bekannt. Im Hinblick darauf war es das zentrale Thema der vorliegenden Arbeit neue Erkenntnisse bezüglich der Regulation von MRP4 zu gewinnen. Dabei wurden insbesondere zwei Aspekte untersucht, die den Einfluss des zyklischen Nukleotids cAMP auf transkriptioneller und der Proteinkinase C (PKC) auf posttranslationaler Ebene in den Fokus stellen. Mithilfe von Reportergen-Analysen, quantitativer Real-Time PCR sowie proteinanalytischen Methoden konnte gezeigt werden, dass die MRP4-Expression durch eine langanhaltende Steigerung der intrazellulären cAMP-Konzentrationen signifikant erhöht wird. Untersuchungen zu den involvierten Signalwegen dieser Regulation deuten auf eine Beteiligung der direkt durch cAMP aktivierten EPAC-Proteine hin, die über die MEK/ERK Proteinkinasen-Kaskade zur Aktivierung der MRP4/ABCC4-Transkription führt. In der Folge resultiert ein erhöhter Efflux von cAMP und möglicherweise weiterer MRP4-Substrate. Bei dieser Art der Regulation könnte es sich um einen autoregulatorischen feedback-Mechanismus handeln. Pharmakologisch bedeutend könnte dies hinsichtlich einer Langzeittherapie mit cAMP-steigernden Arzneistoffen, beispielsweise Phosphodiesterase-Hemmstoffen oder β-Adrenozeptor-Agonisten, sein, da dieser Rückkopplungsmechanismus zu einer Toleranzentwicklung mit einer Abnahme der Wirkung beitragen kann. Ein weiterer Teil dieser Arbeit fokussierte sich auf den Einfluss der PKC auf die MRP4Expression und -Lokalisation. Anhand von Transportstudien und Immunfluoreszenzanalysen konnte eine PKC-vermittelte MRP4-Regulation gezeigt werden. Es wurde ein signifikant verringerter Substratexport mit einhergehender Abnahme des MRP4-Anteils in der Plasmamembran in verschiedenen Zellsystemen beobachtet. Dabei wurde nach Aktivierung der PKC eine vermehrte Lokalisation von MRP4 in intrazellulären Vesikeln beobachtet, deren Herkunft aufgrund von Versuchen mit einer Biotin-Markierung der Zelloberfläche der Plasmamembran zugeordnet werden konnte. Im Anschluss an die Internalisierung kam es zur Verschmelzung mit frühen Endosomen, über die durch Recycling-Prozesse der erneute Protein-Einbau in die Membran realisiert werden kann. Untersuchungen mit einer CFP-getaggten MRP4Deletionsvariante ohne die carboxy-terminale PDZ-Bindedomäne ließen auf eine Beteiligung des PDZ-Interaktionsmotivs im Rahmen der PKC-modulierten MRP4Regulation schließen. Möglicherweise kommt es über dieses Bindungsmotiv zu einer Interaktion zwischen MRP4 und möglichen Adapterproteinen, die für diesen regulatorischen Mechanismus notwendig sein könnten. Da keine Zelltyp-abhängigen Unterschiede festgestellt wurden, könnte es sich bei dieser posttranslationalen Art der MRP4-Regulation um einen ubiquitär verbreiteten Mechanismus handeln, der mittlerweile auch für bestimmte andere Transporter beobachtet wurde und in vivo auch die Aufnahme bzw. Elimination von Pharmaka beeinflussen könnte. Diese Arbeit lieferte neue Erkenntnisse zur Regulation von MRP4 auf transkriptioneller und posttranslationaler Ebene. Durch weitere Untersuchungen sollte die pharmakologische und physiologische Relevanz dieser Regulationsmechanismen noch intensiver charakterisiert werden.
  • The MRP4 (ABCC4) protein belongs to the ABC transporter family and is characterized by a very wide range of substrates in addition to a diverse expression pattern. It is expressed in numerous tissues, for example, in the kidney, brain, blood cells and in vascular smooth muscle cells. The MRP4 protein mediates the efflux and thus also resistance to a large number of exogenous substances, such as nucleoside based therapeutics of antiviral and cytostatic cancer therapy, as well as the cellular export of various endogenous signaling molecules in particular of cyclic nucleotides. Recent studies showed that the MRP4-mediated export of cyclic nucleotides influenced intracellular cAMP levels. While data for expression and spectrum of substrates of MRP4 are already exist, so far very little is known about the regulatory mechanisms of the transporter. In this regard, it was the central theme of this work to gain new insights into the regulation of MRP4. In particular, two aspects were in focus: the influence of the cyclic nucleotide cAMP at the transcriptional level and the protein kinase C (PKC) on posttranslational level. Using reporter gene analysis, quantitative real-time PCR and protein analytical methods, it could be shown that MRP4 expression is significantly increased by a long-lasting increase in intracellular cAMP levels. Studies on the signaling pathways involved in this regulation indicate an involvement of activated directly by cAMP (EPAC) proteins via the MEK /ERK protein kinases cascade in order to activate the MRP4 /ABCC4 transcription. As a consequence, it could result in increased efflux of cAMP and possibly other MRP4 substrates. This type of regulation could be an autoregulatory feedback mechanism. It is pharmacologically important, because this mechanism could interact with long-term treatment with cAMP-enhancing drugs, such as phosphodiesterase inhibitors or β-adrenoceptor agonists, as this feedback mechanism may contribute to the development of tolerance with a decrease in therapy effect. Another part of this work focused on the influence of PKC on the MRP4 expression and localization. On the basis of transport studies and immunofluorescence analysis a PKC-mediated regulation of MRP4 was shown. It has been observed in different cell systems. A significantly reduced substrate export with concomitant decrease in MRP4 localization in the plasma membrane could be detected. After activation of PKC MRP4 was observed in intracellular vesicles, whose origin could be determined with a biotin labeling, indicating the cell surface of the plasma membrane. Following the internalization, a fusion with early endosomes could be detected, which can realize recycling processes by re-incorporation into the plasma membrane. Investigations with a CFP-tagged MRP4 deletion model without the carboxy terminal PDZ binding domain were done. Analyses showed that this binding motif may be necessary for interaction between MRP4 and possible adapter proteins to realize regulatory mechanisms. Since no cell type-dependent differences were found, this post-translational type of MRP4-regulation could be a ubiquitous mechanism, which has been observed for certain other transporters and could in vivo also influence the uptake and elimination of drugs. This work provided new insights into the regulation of transcriptional and posttranslational level of MRP4. The pharmacological and physiological relevance of these regulatory mechanisms should be characterized more intense by further studies.

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Metadaten
Author: Susanne Bröderdorf
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002452-0
Title Additional (English):Regulation of the ABC transporter MRP4 (ABCC4)
Advisor:Prof. Dr. Stefan H. Engelhardt, Prof. Dr. Heyo Klaus Kroemer
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2016/02/22
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2016/02/19
Release Date:2016/02/22
Tag:ABC-Transporter, ABCC4, MRP4, Proteinkinase C, cAMP
ABC transporter, ABCC4, MRP4, cAMP, protein kinase C, regulation
GND Keyword:Proteine, Regulation
Faculties:Universitätsmedizin / Institut für Pharmakologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie