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Uwe Wegner

• In den letzten Jahren gewannen ω-Transaminasen zunehmend an Bedeutung. Ihr breites Substratspektrum, das sowohl Aminosäuren als auch Amine umfasst, macht sie interessant für biotechnologische Anwendungen. Im Gegensatz zu α-Aminotransferasen sind ω-Aminotransferasen nicht auf α-Aminosäuren als Aminodonor bzw. α-Ketosäuren als Aminoakzeptoren beschränkt. Auch sind einige ω-Transaminasen in der Lage, Aldehyde oder Ketone zu aminieren. Dadurch sind sie vielseitig einsetzbar. Seit ihrer Entdeckung wurden ω-Transaminasen in einer Vielzahl von Organismen nachgewiesen. Viele dieser Enzyme stammen aus Pilzen und Bakterien. Da es ständig Bedarf an neuen Transaminasen gibt, wurden verschiedene Organismen auf das Vorhandensein solcher Enzyme untersucht. Die Hefe Blastobotrys raffinosifermentans LS3 ist einer dieser Organismen. Für diese Hefe existiert bereits eine Vielzahl biotechnologischer Anwendungen, was unter anderem an ihren vielseitigen physiologischen Möglichkeiten liegt. Um das Spektrum dieses Stammes noch zu erweitern, wurde sein Genom auf ORFs gescannt. Die ermittelten ORFs wurden translatiert und die so erhaltenen, theoretischen Proteine in einer Proteindatenbank gespeichert. Die Einträge dieser Datenbank wurden einem „hmmerscan“ (hmm ist kurz für „hidden Markov model“) unterzogen. Dabei werden die Proteine in sogenannte Pfams, kurz für Proteinfamilien, eingeteilt. Drei Proteine wurden der Familie PF00202.21 zugeordnet. Das ist die sogenannte Aminotran_3 Familie. In dieser Familie befinden sich eukaryotische ω-Transaminasen. Die Gene brota1, brota2 und brota3 codieren für diese Enzyme. Jeweils eins der Gene wurde in den Vektor XPLOR®3 kloniert, damit die potentiellen ω-Transaminasen in B. raffinosifermentans G1212 [aleu2 atrp1:ALEU2] [1] überexprimiert werden können. Eine Besonderheit von BroTA1 ist, dass es neben der Aminotran_3 Domäne noch eine AAA Domäne aufweist. Deshalb ist es mit etwa 85 kDa auch deutlich größer als die meisten ω-Transaminasen, die meist zwischen 45 und 50 kDa liegen. BroTA2 und BroTA3 beinhalten nur die Aminotran_3 Domäne. Alle drei Enzyme zeigen niedrige Aktivität bei der kinetischen Auflösung racemischer β-Aminosäuren. Neben den eukaryotischen ω-Transaminasen wurden auch einige bakterielle Enzyme untersucht. Literatursuche und das Screenen der Stammsammlung der Arbeitsgruppe Hefegenetik des Leibniz-Instituts für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung führten zu mehreren potentiellen bakteriellen ω-Transaminasen. Das zu Beginn dieser Arbeit noch als hypothetisches Protein bezeichnete Enzym von Variovorax boronicumulans hat sich als ω-Transaminase herausgestellt. Das Enzym wurde detailliert hinsichtlich des Substratspektrums und seiner biochemischen Eigenschaften charakterisiert. Es handelt sich hierbei um eine ω-Transaminase mit β-Aktivität. Diese Transaminase akzeptiert sowohl aromatische als auch aliphatische β-Aminosäuren als Substrat. Sequenzvergleiche dieses Enzyms mit anderen ω-Transaminasen, die nur aliphatische Aminosäuren akzeptieren, führten zu tieferen Einblicken in konservierte Bereiche dieser beiden Gruppen von ω-Transaminasen. Der dritte Ansatz war das Anpassen einer bekannten ω-Transaminase des thermophilen Bakteriums Sphaerobacter thermophilus an ein potentielles Motiv für aromatische ω-Transaminasen. Dadurch sollte die Aktivität des Enzyms erhöht werden. Dieser Ansatz führte zu 7 Varianten des Enzyms mit höherer Aktivität als der Wildtyp. Durch diese Versuche wurden einige für die Transferaseaktivität wichtige Aminosäurereste offenbart. So hat sich zum Beispiel herausgestellt, dass N70 offenbar wichtig für den Umsatz von γ-Aminosäuren ist, da ein Austausch gegen Glutamat zu einer verminderten Aktivität mit γ-Aminopentansäure führte.
• In recent years, ω-transaminases have become increasingly important. Their wide range of substrates, which includes both amino acids and amines, makes them interesting for biotechnological applications. In contrast to α-aminotransferases, ω-aminotransferases are not limited to α-amino acids as amino donors or α-keto acids as amino acceptors. Some ω-transaminases are also able to aminate aldehydes or ketones. This makes them versatile. Since their discovery ω-transaminases have been identified in a variety of organisms. Many of these enzymes derive from fungi and bacteria. Since there is a constant need for new transaminases, various organisms have been examined for the presence of such enzymes. The yeast Blastobotrys raffinosifermentans is one of these organisms. A large number of biotechnological applications already exist for this yeast. To expand the spectrum of this strain, its genome was scanned for ORFs. The determined ORFs were translated and the theoretical proteins obtained in this way were stored in a protein data base. The entries in this data base were subjected to a hmmerscan (hmm is short for “hidden Markov model”). The proteins are assigned to so-called pfams, short for protein families. Three proteins have been assigned to family PF00202.21. This is the so-called Aminotran_3 family. In this family are eukaryotic ω-transaminases. The genes brota1, brota2 and brota3 code for these enzymes. One gene each was cloned into the vector XPLOR®3 so that the potential ω-transaminases in B. raffinosifermentans G1212 [aleu2 atrp1:ALEU2] [1] can be overexpressed. A special feature of BroTA1 is that it has a AAA domain in addition to the Aminotran_3 domain. Therefore, at about 85 kDa, it is also significantly larger than most ω-transaminases, which are usually between 45 and 50 kDa. BroTA2 and BroTA3 contain only the aminotran_3 domain. All three enzymes show low activity in the kinetic resolution of racemic β-amino acids. In addition to the eukaryotic ω-transaminases, some bacterial enzymes have also been studied. A literature search and screening of the strain collection of the yeast genetics group of the Leibniz-institute for plant genetics and crop science led to several potential bacterial ω-transaminases. The enzyme from Variovorax boronicumulans, which was still described as a hypothetical protein at the beginning of this work, turned out to be an ω-transaminase. The enzyme was characterized in detail with regard to the substrate spectrum and its biochemical properties. It is an ω-transaminase with β-activity. This transaminase accepts both aromatic and aliphatic β-amino acids as a substrate. Sequence comparisons of this enzyme with other ω-transaminases that only accept aliphatic amino acids led to deeper insights into conserved regions of these two groups of ω-transaminases. The third approach was the adaptation of a known ω-transaminase from the thermophilic bacterium Sphaerobacter thermophilus to a potential motif for aromatic ω-transaminases. This should increase the activity of the enzyme. This approach resulted in 7 variants of the enzyme with higher activity than the wild type. These experiments revealed some amino acid residues important for transferase activity. For example, it turned out that N70 is apparently important for the conversion of γ-amino acids, since replacing it with glutamate led to reduced activity with γ-aminopentanoic acid.