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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001527-9

Evolution und Charakterisierung von Aptameren gegen Plättchenfaktor 4

  • Im Rahmen dieser Arbeit sollten Aptamere selektiert und charakterisiert werden, die an PF4 binden. PF4 ist ein kleines Cytokin, das aufgrund seiner Beteiligung an der Heparin induzierten Thrombozytopenie von gesteigertem klinischen Interesse ist und dessen biologische Funktion noch weitgehend unklar ist. Aptamere können aufgrund ihres breiten Anwendungsspektrums einen Beitrag leisten unbekannte Funktionen von Proteinen aufzuklären bzw. pathogene Effekte von Proteinen zu verhindern.Zu diesem Zweck wurden zwei unterschiedliche Selektionen durchgeführt. In einer ersten Selektion wurden die Bedingungen so angepasst, dass vor allem Sequenzen im Pool verblieben, die besonders große Komplexe mit PF4 bilden. Solch große Komplexe aus PF4 und Heparin stellen das Hauptantigen der HIT dar und durch strukturelle Untersuchungen könnten Vorhersagen getroffen werden, welche therapeutisch eingesetzten Aptamere potentiell immunogen wirken könnten. Nach Analyse der Sekundärstrukturen der erhaltenen Sequenzen durch Faltungsprogramme konnten neben stäbchenförmigen Sekundärstrukturen vor allem three- und four-way junctions als dominierende Sekundärstrukturmerkmale identifiziert werden. Auf Grundlage dieser Resultate wurde ein Modell entwickelt, wonach die Ausbildung großer Komplexe zwischen RNA und PF4 durch das Vorhandensein mehrerer Helices in einem Molekül RNA gefördert wird und dadurch große Netzwerke aus RNA und PF4 entstehen. Um einen Anhaltspunkt zu erhalten, welches der selektierten Aptamere eine erhöhte Neigung zur Komplexbildung aufweist, wurden die Bindungseigenschaften zunächst qualitativ im Gelshift-Assay bei erhöhten NaCl-Konzentrationen untersucht. Dabei kristallisierten sich fünf Aptamere heraus, die auch bei NaCl-Konzentrationen höher als die der finalen Selektionsrunde noch zur Bindung fähig waren.Diese Sequenzen wurden mittels Photonenkorrelationsspektroskopie untersucht um Aussagen zur Komplexgröße und Stabilität zu erhalten. Basierend auf den Ergebnissen der PCS erfolgte die Synthese zweier Derivate der vielversprechendsten Sequenz. Für alle drei Konstrukte konnte die Komplexbildung im Gelshift Assay nachgewiesen werden. In einer zweiten Selektion wurden die Bedingungen so gewählt, dass an deren Ende spezifisch bindende Aptamere erhalten wurden. Zunächst erfolgte ein Vergleich der Bindungseigenschaften der in dieser Selektion erhaltenen Aptamere mit denen der vorangegangenen Selektion. Dabei konnten deutlich Unterschiede mittels Gelshift-Analyse nachgewiesen werden. Zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten wurde versucht einen eigenen Sensorchip aufzubauen unter Verwendung vonPolyethylenglykol. Auch dies führte nicht zum gewünschten Erfolg und führte dazu, dass versucht wurde die Dissoziationskonstanten durch Immobilisierung von PF4 zu bestimmen. Durch die Struktur von PF4, in der die Monomere nichtkovalent miteinander verbunden sind, gelang es wiederum nicht eine stabile Oberfläche zu generieren, wodurch sich die Verwendung des Biacors zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten als ungeeignet herausstellte. Aus diesem Grund wurde versucht die Dissoziationskonstanten durch CD-Spektroskopie zu ermitteln. Nach Auswertung der Spektren konnte festgestellt werden, dass durch die Bindung der RNA an PF4 eine Strukturänderung im Protein induziert wird, durch die der Anteil antiparalleler β-Faltblätter zunimmt und der Anteil α-helikaler Bereiche und β-Turns abnimmt. Gleichzeitig wurde deutlich, dass sowohl spezifische- als auch elektrostatische Interaktionen einen Beitrag zur Bindung der Aptamere an PF4 leisten, wobei bei hohen Konzentrationen der Beitrag der elektrostatischen Wechselwirkungen überwiegt. Durch diese Kombination aus spezifischen und elektrostatischen Wechselwirkungen ist eine genaue Bestimmung der Dissoziationskonstanten nicht möglich und für die Aptamere konnte nur ein erster Anhaltspunkt, bestimmt werden.
  • Within the scope of this work the selection and characterization of aptamers targeting platelet factor 4 (PF4) was realized. PF4 is a small cytokine, which is involved in the heparin induced thrombocytopenia (HIT), a serious autoimmune disease while its biological function remains obscure to this point. Aptamers possess a wide application spectrum, which includes functional studies of proteins and therapeutic approaches. For this purpose, two separate selections were carried out while the first one stood under the premise of identifying secondary structure elements that are particularly prone to interact with PF4. This information might be helpful to facilitate the development of aptamers as therapeutic tools, since this could give early information if potential therapeutic aptames might show cross ractivity with PF4 and might therefore have immunogenic effects. After the selection we were able to identifiy mainly aptamers that form 3- and 4-way junctions, respectively, and developed a model which explains why these structures in particular form large, multimolecular complexes with PF4. To get an idea which of the selected aptamers forms more stable complexes with PF4, they were qualitatively analyzed using the gel shift assay. Under high NaCl-concentrations five of the selected aptamers were capable of binding PF4 and their complex stability was investigated using photon correlation spectroscopy (PCS). Based on the sequence of the best binder, identified in the PCS, we synthesized two derivatives, a truncated and an extended one, which also showed complex formation in the native gel. In a second selection, we chose conditions to obtain aptamers that bind PF4 specifically. After the selection process the binding characteristics of these aptamers were compared to those obtained after the first selection. Using native gel electrophoresis significant differences in the binding of the aptamers could be identified. Furthermore we tried to determine the dissociation constants using surface plasmon resonance (SPR). Due to a lot of unspecific interactions of PF4 with various surface materials we could not determine the KD-values and also the immobilization of PF4 was not successful. For that reason we tried to obtain the dissociation constants using circular dichroism (CD). After evaluating the spectra, we identified a structural rearrangement in the protein. Deconvolution revealed that upon binding the RNA the amount of α-helical domains and β-turn decreases, while β-sheets increase. Parallel it became clear that the interaction of PF4 and the aptamers consists of a “specific” and an electrostatic part, which made the determination of the KD-value not trivial and we got the indication, that the KD-value should be around 100 nM.

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Metadaten
Author: Thomas Marschall
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001527-9
Title Additional (English):Evolution and Characterization of Aptamers targeting Platelet Factor 4
Advisor:Prof. Dr. Sabine Müller
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2013/06/14
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2013/06/03
Release Date:2013/06/14
Tag:Plättchenfaktor 4, SELEX
Aptamers, Platelet Factor 4, SELEX
GND Keyword:Aptamer
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Chemie und Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie
MSC-Classification:92-XX BIOLOGY AND OTHER NATURAL SCIENCES / 92Cxx Physiological, cellular and medical topics / 92C40 Biochemistry, molecular biology