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Molecular analysis of Streptococcus pneumoniae virulence factor genes and their prevalence among pneumococcal strains and clinical isolates in Germany

  • Streptococcus pneumoniae, more commonly known as the pneumococcus, is a Gram-positive bacterium colonizing the human upper respiratory tract as a commensal. However, these apparently harmless bacteria have also a high virulence potential and are known as the etiologic agent of respiratory and life-threatening invasive diseases. Dissemination of pneumococci from the nasopharynx into the lungs or bloodstream leads to community-acquired pneumonia, septicaemia and meningitis. Pneumococcal diseases are treated with antibiotics and prevented with polysaccharide-based vaccines. However, due to the increase of antibiotic resistance and limitations of the current vaccines, the burden of diseases remains high. Interactions of pneumococci with soluble host proteins or cellular receptors are crucial for adherence, colonization, transmigration of host barriers and immune evasion. The pneumococcal surface-exposed proteins are the main players involved in this host-pathogen interaction. Therefore, combating pneumococcal transmission and infections has emphasized the need for a new generation of immunogenic and highly protective pneumococcal vaccines, based on surface-exposed adhesins virtually expressed by all pneumococcal strains and serotypes. The genomic analysis of S. pneumoniae strains helped to identify pneumococcal virulence factors such as pili, PsrP and PavB, which have been demonstrated to interact with human proteins playing an important role during the pathogenic process of pneumococci, and are currently considered as new potential vaccine candidates against S. pneumoniae. A subclass of pneumococcal strains produces pili that are encoded by the pathogenicity islet pilus islet-1 (rlrA islet) and/or the pilus islet-2. Both types of pili are implicated in bacterial adherence to host cells. A further pathogenicity islet encoded protein is PsrP. The presence of the psrP-secY2A2 islet correlated positively with the ability of pneumococci to cause invasive pneumococcal diseases. Recent studies indicated that PsrP is a protective adhesin interacting with keratin 10 on lung epithelial cells. In this study, the genomic loci of the pneumococcal virulence factors pili, PsrP and PavB were molecularly analyzed and used as molecular markers for molecular epidemiology studies of S. pneumoniae. The genotyping results obtained here showed the impact of the PCV7 immunization of children, started in July 2006, on the distribution of these pneumococcal virulence factors among clinical isolates in Germany. These findings gave more insights into the role of pili, PsrP and PavB in pneumococcal pathogenesis and may strongly support the idea of including these pneumococcal constituents in a broad coverage protein-based vaccine against pneumococcal infections produced by invasive serotypes in the future. The mature PavB protein contains a variable number of repetitive sequences referred to as the Streptococcal Surface Repeats (SSURE). PavB has been demonstrated to interact with fibronectin and plasminogen in a dose-dependent manner and it was identified as a surface-exposed adhesin with immunogenic properties, which contributes to pneumococcal colonization and respiratory airways infections. The complete molecular analysis performed here for PavB, allowed to know more accurately its structure and to estimate the real number of SSURE units in different pneumococcal strains. With these findings, a new primary sequence-based structural model was constructed for the PavB protein and its SSURE domain, and, at least for TIGR4, the complete pavB gene and PavB protein sequences with five SSURE units was reported in the GenBank database of the NCBI website. Due to its immediate neighborhood on the pneumococcal genome with the tcs08 genes, PavB is likely linked with this pneumococcal TCS. Here, a significant reduction of the PavB protein expression was observed in delta-tcs08-mutant strains, which may strongly suggest that the TCS08 does play a role in pneumococcal virulence and metabolisme, as further observed in growth behaviour experiments carried out with the TCS08-deficient mutants, cultured in chemically defined medium. Despite several studies suggest that the molecular mechanism underlying the bacterial signal transduction is very sophisticated, the majority of reports in prokaryotic TCS, including those for S. pneumoniae, are still focused in single cognate pairs. The pneumococcal genome encodes 14 TCSs and an orphan response regulator. It is obvious that TCS pathways are often arranged into complex circuits with extensive cross-regulation at a variety of levels, thereby endowing cells with the ability to perform sophisticated information processing tasks. This study established also the experimental and molecular bases for the construction of a comprehensive genome-wide interaction map of the complex TCS pathways for its application in the gene regulation of pneumococcal virulence factors.
  • Streptococcus pneumoniae, auch als Pneumokokken bezeichnet, sind Gram-positive Bakterien, die als Kommensalen den Respirationstrakt des Menschen besiedeln. Diese anscheinend harmlosen Bakterien besitzen andererseits aber auch ein hohes virulentes Potenzial und verursachen respiratorische und lebensbedrohliche invasive Erkrankungen beim Menschen. Die Ausbreitung der Pneumokokken vom Nasopharynx in die Lunge oder den Blutstrom führt zu ambulant-erworbenen Pneumonien, Septikämien und Meningitiden. Infektionen mit Pneumokokken werden mit Antibiotika therapiert und die Prävention kann mittels Polysaccharid-basierten Impfstoffen erfolgen. Aber durch den Anstieg der Antibiotika-resistenten Isolate und der Limitationen der zurzeit zur Verfügung stehenden Impfstoffe verbleiben die durch Pneumokokken-Erkrankungen verursachten Schäden auf einem konstant hohen Niveau. Die Interaktionen der Pneumokokken mit löslichen Wirtsproteinen oder zellulären Rezeptoren sind essentiell für die Adhärenz, Kolonisierung und das Überschreiten der Wirtsbarrieren sowie die Immunevasion der Bakterien. Die wichtigsten Komponenten in der Wirt-Pathogen Interaktion stellen die auf der Oberfläche der Pneumokokken exponierten Proteine dar. Um die Transmission und Infektionen der Pneumokokken zu bekämpfen sind daher neue Generationen von wirksamen Impfstoffen notwendig, die auf Proteinen basieren. Die genomische Analyse von S. pneumoniae Stämmen erleichterte die Identifikation von bakteriellen Virulenzfaktoren wie Pili, PsrP und PavB, die alle mit Wirtsproteinen interagieren und eine Bedeutung in der Pathogenese der Pneumokokken haben. Diese Faktoren werden als neue vielversprechende Kandidaten für einen Pneumokokken-Impfstoff betrachtet. Nur ein Teil der Pneumokokken produzieren Pili, die durch Gene auf der Pilus-Pathogenitätsinsel-1 (rlrA PAI) oder der Pilus-2 PAI kodiert werden. Beide Pili sind an der Adhärenz der Bakterien an Wirtszellen beteiligt. Eine weitere PAI kodiert für das Protein PsrP und die Präsenz der psrP-secY2A2 PAI korreliert mit der Fähigkeit der Pneumokokken invasive Erkrankungen auszulösen. PsrP ist ein protektives Antigen, das an Keratin 10 von Lungenepithelzellen bindet. In dieser Arbeit wurden die genomischen Regionen der Virulenzfaktoren Pili, PsrP und PavB von S. pneumoniae auf molekularer Ebene analysiert und als genotypische marker in epidemiologischen Studien verwendet. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten den Einfluss der PCV7 Immunisierung bei Kindern auf das Vorkommen der Pili und PsrP in den ab 2008 isolierten klinischen Pneumokokkenisolaten in Deutschland. Die Ergebnisse unterstützen außerdem den Ansatz die PAI-kodierten Proteine als Kandidaten für einen Protein-basierten Impfstoff zu betrachten, der gegen invasive Infektionen schützen kann. Das prozessierte PavB Protein besteht aus einer variablen Anzahl von repetitiven Sequenzen, die als Streptococcal-Surface-Repeats (SSURE) bezeichnet werden. Die SSURE Peptiden interagieren mit Fibronektin und Plasminogen. PavB ist ein Oberflächenprotein mit immunogenen Eigenschaften, welches die Kolonisierung und Infektion des Respirationstrakts fördert. Die in dieser Arbeit durchgeführte molekulare Analyse von PavB ermöglichte die exakte Bestimmung der Anzahl der SSURE Einheiten in verschiedenen Pneumokokken und, basierend auf der Primärnukleotidsequenz, die Konstruktion eines Strukturmodels für PavB und die SSURE Domänen. So wurde für das PavB vom Stamm TIGR4 auch zum ersten Mal die vollständige pavB Sequenz mit fünf SSURE Einheiten bestimmt. Die Daten wurden in GenBank hinterlegt. Durch die unmittelbare genomische Nähe des pavB-Gens zu den tcs08 Genen wurde eine Verbindung dieser Regionen und eine Regulation der pavB-Genexpression über das TCS08 vermutet. Hergestellte tcs08-Mutanten im zeigten eine signifikante Reduktion der PavB Proteinproduktion. Diese Ergebnisse und weitere Wachstumsversuche der tcs08-Mutanten im CDM deuteten auf eine wichtige Funktion des TCS08 in der Pneumokokken-Virulenz bzw. im Metabolismus dieser Bakterien hin. Die meisten Studien zu TCS sind auf die einzelnen genetisch verwandten Gene fokussiert, obwohl bekannt ist, das die molekularen Mechanismen der bakteriellen Signaltransduktion wesentlich komplizierter sind. Im Genom der Pneumokokken sind die Gene für 13-TCS und ein Gen für einen verwaisten Response-Regulator vorhanden. Es ist weiterhin vorstellbar, dass die TCS Signalwege oft in komplizierten Schaltkreisen mit vielfältigen Kreuzreaktionen auf unterschiedlichen Ebenen arrangiert sind. Dadurch sind die Bakterien mit der Fähigkeit ausgestattet, anspruchsvolle Informationsabläufe variabel zu gestalten. Etablierte Methoden und hergestellte molekulare Konstrukte stellen nun die Basis für vollständige und genomweite Interaktionsstudien der TCS Signaltransduktionswege dar. Dadurch kann die Genregulation auf Ebene der TCS sowie der Einfluss der TCS Signaltransduktionssysteme auf die Virulenzfaktoren aufgeklärt werden kann.

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Metadaten
Author: Gustavo Adolfo Gamez de Armas
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001182-6
Title Additional (German):Molekulare Analyse von Streptococcus pneumoniae Virulenzfaktorgenen und deren Verbreitung in Pneumokokkenstämmen und klinischen Isolaten in Deutschland
Advisor:Prof. Dr. Sven Hammerschmidt
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2012/03/06
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2012/02/29
Release Date:2012/03/06
Tag:Antibiotics, PCV7, PavB, Pilus Islet-1, Pilus Islet-2, PsrP
GND Keyword:Adhäsine, Epidemiologie, Impfstoff, Pili, Streptococcus pneumoniae, Virulenz
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Mikrobiologie - Abteilung für Genetik & Biochemie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie