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Martin Pagels

• Compared to other human pathogens, S. aureus outstands with a remarkably broad spectrum of deseases: from minor skin infections over endocarditis, pneumoniae, and osteomyelitis, to septic shock. The prerequisite is an arsenal of adaptation strategies, encoded in the core and variable genome. It includes the coordinated expression of adhesins and toxins, evasion of the immune system, response to stress and starvation, adaptation of the metabolism, formation of biofilms and capsules, antibiotic resistance, and persistence on the skin, in nasal epithelial cells, and even in the inner of macrophages after phagocytosis. All these adaptation strategies enable S. aureus to colonize a diversity of niches within the human host. The inevitable requirement is the ability to activate the appropriate adaptation strategy at the right time and at the right place. S. aureus overcomes this challenge with a sophisticated regulatory network. This PhD thesis covers a broad spectrum of transcriptional regulators, involved in S. aureus pathogenesis: (1) the quorum sensing system Agr (regulation of early- and late stage virulence factors), (2) the Sar family (regulation of early- and late stage virulence factors), (3) SaeRS (regulation of accessory exotoxins and adhesins), (4) CodY (response to amino acid starvation, including extracellular proteases), (5) Sigma B (general stress response, including virulence factors), (6) Rex (anaerobic energy metabolism), (7) CtsR and HrcA (protein quality control), (8) PerR and Fur (oxidative stress response), and (9) antibiotic resistance. Traditionally, Proteomics constitute the long-lasting reputation of the Institute. In fact, the majority of investigations presented in this PhD thesis was initialized by proteomic analyses as the ultimate starting point. From the first day, a major goal of this PhD thesis was to add regulator-promoter interaction studies to the methodical spectrum. In particular, to complement transcriptomic and proteomic results by answering the logical follow-up question: Which regulator is responsible for the observed changes in gene expression and protein synthesis after application of a specific stimulus? The first chapter provides specific analyses for three major regulators: Rex, CodY, and SarA. Publications were achieved for Rex (Hecker et al., 2009; Pagels et al., 2010). Results were mainly achieved by establishing regulator-promoter interaction methods (in particular EMSA and “footprinting”). Additionally, this chapter describes method development of a novel easy-to-apply method, named REPA (restriction endonuclease protection assay). The second chapter presents method development for the genome-wide identification of regulator-promoter interactions, named “global footprinting”. This approach combines two already well-established methods: (A) Purification of a recombinant Strep-tagged regulator via Strep-tag affinity chromatography. The modification in “global footprinting” is to incubate the regulator with fragmented genomic S. aureus DNA, resulting in co-purification and enrichment of DNA streches with specific regulator binding sites. (B) Identification and quantification of these DNA streches via “next generation sequencing” (NGS). Using this combined approach, this PhD thesis was able to localize the most affine promoter binding site for the regulator Rex precisely down to one single base pair across the whole S. aureus genome. The third chapter describes the assembly of a data library, collecting the majority of DNA microarray data and regulator-promoter interaction studies from the worldwide literature. This data library summarizes more than 50,000 regulatory events and more than 2,000 regulator binding sites. As published in the perspectives in Fuchs et al. (2018), this data library can be incorporated into the free-accessible online data base “Aureowiki” (provided and maintained by the Department of Functional Genomics, University of Greifswald). The major effort is the consolidation of these “big data” via in silico cluster analysis, comparing 282 different experimental conditions at once. The major finding of this analysis is the identification of seven functional and regulatory gene clusters in S. aureus pathogenesis that are conserved across S. aureus strain diversity. These findings allowed the creation of a prediction tool, to provide novel experimental starting points for the worldwide S. aureus research community. This prediction tool was successfully applied on several topics, and partially published: functional and regulatory prediction for a set of 20 selected lipoproteins as potential virulence factors (Graf et al., 2018), and prediciton of protein complexes (Liang et al., 2016). Alltogether, this PhD thesis provides new insights into the molecular mechanisms of three pathogenesis-relevant regulators: Rex, CodY, and SarA. It describes the development of three novel experimental methods for wet and dry lab applications that can be used on research topics beyond S. aureus: REPA, “global footprinting”, and cluster analysis. Finally, cluster analysis identifies seven conserved fuctional and regulatory gene clusters, involved in S. aureus pathogenesis. This cluster anaysis is used as a prediction tool to provide novel experimental starting points, and to predict the physiological mode of action of newly discovered anti-staphylococcal agents.
• Im Vergleich zu anderen Krankeitserregern sticht S. aureus mit einem bemerkenswert breiten Spektrum an Krankeitsbildern im Menschen heraus: von Hautinfektionen über Endocarditis, Pneumonie und Osteomyelitis bis hin zum septischen Schock. Die Grundvoraussetzung ist ein Arsenal an Adaptationsstrategien, die im Kern- und variablen Genom kodiert sind. Es beinhaltet die koordinierte Expression von Adhäsinen und Toxinen, die Umgehung des Immunsystems, die Antwort auf Stress und Hunger, die Anpassung des Stoffwechsels, die Bildung von Biofilmen und Kapseln, Resistenz gegenüber Antibiotika und die Persistenz auf der Haut, in nasalen Epithelzellen und sogar im Inntern von Makrophagen nach Phagozytose. All diese Adaptationsstrategien ermöglichen S. aureus die Besiedelung einer Vielzahl von Nischen im menschlichen Wirt. Die notwendige Bedingung ist die Fähgigkeit, die passende Adaptationsstrategie zur richtigen Zeit am richtigen Ort zu aktivieren. S. aureus meistert diese Herausforderung mit einem ausgefeilten regulatorischen Netzwerk. Diese Promotionsarbeit deckt ein breites Spektrum von Regulatoren der Transkription ab, welche relevant für die Pathogenese von S. aureus sind: (1) Das Quorum-Sensing-System Agr (Regulation von Virulenzfaktoren der frühen und späten Phase), (2) die Sar-Familie (Regulation von Virulenzfaktoren der frühen und späten Phase), (3) SaeRS (Regulation von zusätzlichen Exotoxinen und Adhäsinen), (4) CodY (Antwort auf Aminosäuremangel, inklusive extrazelluläre Proteasen), (5) Sigma B (generelle Stressantwort, inklusive Virulenzfaktoren), (6) Rex (anaerober Energiestoffwechsel), (7) CtsR und HrcA (Proteinqualitätskontrolle), (8) PerR und Fur (oxidative Stressantwort), und (9) Resistenz gegenüber Antibiotika. Die traditionelle Reputation des Instituts basiert auf Proteomics. Tatsächlich wurde der Großteil der Untersuchungen dieser Promotionsarbeit durch Proteomanalysen als ultimativer Startpunkt initialisiert. Vom ersten Tag dieser Promotionsarbeit an war es eines der Hauptziele, Regulator-Promoter-Interaktionsstudien dem methodischen Spektrum hinzuzufügen. Insbesondere um die transkriptomischen und proteomischen Ergebnisse zu ergänzen und die logische Folgefrage zu beantworten: Welcher Regulator ist verantwortlich für die beobachteten Änderungen in Genexpression und Proteinsynthese nach Anwendung eines bestimmten Stimulus? Das erste Kapitel bietet spezifische Analysen für drei Hauptregulatoren: Rex, CodY und SarA. Publikationen wurden für Rex erreicht (Hecker et al., 2009; Pagels et al., 2010). Die Ergebnisse wurden hauptsächlich durch die Etablierung von Regulator-Promoter-Interaktionsstudien ermöglicht (insbesondere EMSA und “footprinting”). Zusätzlich beschreibt dieses Kapitel die Entwicklung einer neuen, leicht anwendbaren Methode, genannt REPA (restriction endonuclease protection assay). Das zweite Kapitel präsentiert die Entwicklung einer neuen Methode zur Genom-weiten Identifizierung von Regulator-Promoter Interaktionsstudien, genannt “global footprinting”. Dieser Ansatz kombiniert zwei bereits gut etablierte Methoden: (A) Reinigung eines rekombinanten Strep-tag-Regulators mittels Strep-tag Affinitätschromatografie. Als Modifikation in “global footprinting” wird der Regulator mit fragmentierter genomischer S. aureus DNA inkubiert, was zur Co-Purifikation und Anreicherung von DNA-Abschnitten führt, welche spezifische Regulator-Bindestellen tragen. (B) Die Identifizierung und Quantifizierung dieser DNA-Abschnitte mittels “next generation sequencing” (NGS). Mit diesem Ansatz ist es dieser Promotionsarbeit gelungen, die affinste Promoter-Bindestelle für den Regulator Rex bis auf das Basenpaar genau im gesamten S. aureus Genom zu lokalisieren. Das dritte Kapitel beschreibt die Zusammenstellung einer Daten-Bibliothek, bestehend aus der Gesamtheit aller DNA-Microarray-Daten und Regulator-Promoter-Interaktionsstudien aus der weltweiten Literatur. Sie umfasst mehr als 50.000 regulatorische Ereignisse und mehr als 2.000 Regulator-Bindestellen. Wie in den „perspectives” in Fuchs et al. (2018) publiziert kann diese Daten-Bibliothek in die frei zugängliche Online-Datenbank “Aureowiki” integriert werden (betrieben vom Institut für funktionelle Genomforschung, Universität Greifswald). Die Hauptleistung ist die Zusammenfassung der “big data” dieser Daten-Bibliothek mittels in silico Cluster-Analyse, welche 282 verschiedene experimentelle Bedingung auf einmal vergleicht. Das Ergebnis dieser Analyse ist die Identifizierung von sieben funktionellen und regulatorischen Gen-Clustern, die pathogenese-relavant und konserviert über die Stammvielfalt von S. aureus sind. Mit diesen Ergebnisse wird ein Vorhersagewerkzeug erschaffen, um der weltweiten S. aureus Forschungsgemeinschaft neue experimentelle Startpunkte bereitzustellen. Es wurde bereits in verschiedenen Forschungsthemen erfolgreich angewendet und teilweise veröffentlicht: funktionelle und regulatorische Vorhersage für 20 ausgewählte Lipoproteine als potentielle Virulenzfaktoren (Graf et al., 2018) und die Vorhersage von Protein-Komplexen (Liang et al., 2016). Zusammengefasst bietet diese Promotionsarbeit neue Einblicke in die molekularen Mechanismen von drei Pathogenese-relevanten Regulatoren: Rex, CodY und SarA. Sie beschreibt die Entwicklung von drei neuen experimentellen Methoden die auf Forschungsthemen über diese Promotionsarbeit hinaus angewendet werden können: REPA, “global footprinting” und Cluster-Analyse. Abschließend identifiziert die Cluster-Analyse sieben konservierte funktionelle und regulatorische Gen-Cluster die in der Pathogenese von S. aureus involviert sind. Diese Cluster-Analyse wird als Vorhersagewerkzeug für neue experimentelle Startpunkte benutzt und trifft Vorhersagen für den Wirkmechanismus von neu entdeckten anti-staphylokokkalen Substanzen.