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Paul Kraus

• Die Therapie des Melanoms sowie die Erforschung neuer Behandlungsmöglichkeiten stehen im Fokus zahlreicher Forschungsgruppen. Um der Komplexität dieser Erkrankung gerecht zu werden, müssen möglichst genaue Modelle gefunden werden. Tumor-Sphäroide als dreidimensionale Tumorzellkulturen schließen dabei teilweise die Lücke zwischen den herkömmlichen zweidimensionalen Zellmonolayern und den Tiermodellen. Hierdurch lassen sich die zelluläre Heterogenität, die Nährstoffverteilung, der Sauerstoffgradient, die Zell-Zell-Interaktionen sowie die Genexpression genauer abbilden und dadurch untersuchen. Arbeiten von Vinci sowie Howes et al. haben gezeigt, dass adäquate In-vitro-Bedingungen notwendig sind, um die Wirkungen von Medikamenten nicht zu über- beziehungsweise unterschätzen (Vinci et al. 2012, Howes et al. 2007). Ziel dieser Arbeit war, ein Verfahren zu etablieren, welches Sphäroide in einen tissue microarray zur Testung von potenziellen neuen Therapeutika zur Verfügung stellt, wobei in dieser Arbeit die Anwendung von kaltem Atmosphärendruckplasma und gepulsten elektrischen Feldern im Mittelpunkt des Interesses stand. Diese Methode von Ivanov und Grabowska (Ivanov & Grabowska 2017) wurde dazu in leicht modifizierter Form angewandt. Verwendet wurden zwei Melanomzelllinien (SK-Mel-28 MNT-1), für die zunächst optimale Wachstumsparameter festgelegt werden mussten, um stets vergleichbare und reproduzierbare Sphäroide mit einer Größe von 300-500 µm zu erhalten. Das etablierte Verfahren ist zeitsparender und ermöglicht eine automatische Bildaufnahme im Hochdurchsatz (high throughput screening) von bis zu 60 Sphäroiden pro Präparat. Die Immunfluoreszenzfärbung stellt aufgrund ihrer hohen Sensitivität und der dadurch möglichen Verkleinerung der Proben eine der wichtigsten Detektionsmethoden der Zukunft dar (Hertzberg et al. 2000). Es wurden parallel vier verschiedene Farbstoffe (DAPI, AlexaFluor 488, Alexafluor 594, AlexaFluor 647) mit zu testenden Targets markiert und mittels des CLS-Gerätes aufgenommen sowie quantitativ ausgewertet. Exemplarisch wurden 21 Fluorophore, innerhalb von sieben thematischen Sets und vier verschiedenen Behandlungsformen (direkte, indirekte Plasmabehandlung, H2O2-Behandlung, µsPEF-Behandlung) betrachtet. Hierdurch wurden unterschiedliche Plasma-induzierende Effekte auf die Zellmorphologie sowie ansatzweise auf die Verteilung innerhalb der Sphäroide untersucht. Bereits lichtmikroskopisch ließen sich eine Auflockerung der Peripherie sowie eine Verdichtung der zentralen Regionen der Sphäroide nach einer direkten Plasmabehandlung beobachten. Mittels der Immunfluoreszenz wurden sowohl bekannte Plasmaeffekte, wie die Apoptoseinduktion plasmabehandelter SK-Mel-28-Sphäroide mit hohen Plasmabehandlungsintensitäten, als auch verschiedene Signalwege, wie die antioxidative Zellantwort, beobachtet. Teilweise wurden kontroverse Ergebnisse gemessen, die die Notwendigkeit der Heterogenitätsanalyse innerhalb der Sphäroidschnitte aufzeigen. Beispielsweise weist die aufgelockerte Peripherie eine besonders hohe Apoptoserate auf, die mittels der TUNEL-IF-Färbung detektiert wurde (Abb. 38; Abb. 39). Zu der gesteigerten Apoptoserate lässt sich eine verstärkte Expression von HMOX1 bei den SK-Mel-28-Sphäroiden nach einer direkten sowie indirekten Plasmabehandlung nachweisen (Abb. 44). Hierraus lassen sich grundsätzliche Plasmaeffekte ableiten, wie die Einbringung von ROS und RNS. Zudem konnte die Größenreduktion der Sphäroiddurchmesser mittels µsPEF-Behandlung sowohl lichtmikroskopisch (Abb. 33) als auch am CLS-Gerät über die Gesamtfläche (Abb. 37) gezeigt werden. Diese Ergebnisse entsprechen denen von Nuccitelli et al. am Mausmodell (Nuccitelli et al. 2006, Nuccitelli et al. 2009). Des Weiteren wurden alternative Methoden angewandt, durch die die Antikörperverteilungen in ganzen Sphäroiden untersucht werden könnte (vgl. Kapitel 3.4.4). Insgesamt liefert diese Methode, aufgrund der schnelleren sowie kostengünstigeren Durchführbarkeit und der potenziellen Automatisierung am CLS-Gerät, ein ausgesprochen mächtiges Verfahren zur Erforschung neuer Krebstherapien im Labor.
• Abstract Research into new approaches in the therapy of melanoma are the focus of several research groups. To consider the complexity of the disease, most precise models have to be found. Tumor-spheroids are three-dimensional tumor cultures that close in part the gap between conventional twodimensional cellular monolayer cultures and animal models. Thereby the cellular heterogeneity, distribution of nutrients, oxygen gradient, cell-cell interactions and gene expression maybe depicted and examined in more detail. Previous work by Vinci and Howes et al. has shown that adequate invitro conditions are necessary not to over- or underestimate drug actions (Vinci et al. 2012, Howes et al. 2007). Aim of the work was, to establish a procedure, which would use spheroids in a tissue microarray for the testing of potential new therapeutics. In particular, the use of cold atmospheric plasma and pulsed electrical fields were considered in a modification of the method by Ivanov and Grabowska (Ivanov & Grabowska 2017). Using the melanoma cell lines SK-Mel-28 and MNT-1, optimal growth parameters were established to reliably produce spheroids of 300-500 µm in size. This approach is time saving and allows an automated image acquisition in a high throughput screening context with up to 60 spheroids scanned per sample. Immunofluorescence staining with its high sensitivity allows the downsizing of samples (Hertzberg et al. 2000). Four dyes (DAPI, AlexaFluor 488, 594 and 647) were marked with the targets to be tested and imaged in a CLS-analyzer and quantitatively evaluated. 21 Fluorophores in seven thematic sets and the following four different therapeutic approaches were considered: direct and indirect plasma treatment, H2O2- and µsPEF-therapy. Thereby different plasma-induced effects upon cell morphology and distribution within the spheroids were examined. Following direct plasma treatment, a loosening of the periphery and a condensation of the central regions of the spheroids could be detected under the light microscope. Immunofluorescence revealed known effects of plasma treatment such as the induction of apoptosis in SK-Mel-28 spheroids with high plasma therapy intensities as well as different signal pathways such as the antioxidative cellular response. Controversial results underlined the necessity of establishing the heterogeneity within spheroid sections. For example, the breaking-up in their periphery goes along with a high rate of apoptosis, which was detected by TUNEL-IF staining. In addition, along with the high apoptotic rate, an increased expression of HMOX1 could be shown in SK-Mel-28-spheroids following direct and indirect plasma treatment. Principle effects of plasma treatments such as the introduction of ROS and RNS can thereby be deducted. Finally, a reduction in size of spheroid diameters by µsPEF-therapy could be shown over the whole surface both by light microscopy and CLS-analysis. The results are in line with the findings by Nuccitelli in a mouse model (Nuccitelli et al. 2006, Nuccitelli et al. 2009). Furthermore, we used alternative methods with which the distribution of antibodies in whole spheroids may be examined. In summary, due to its fast and affordable operability and the potential for automation in CLS-analyzer, this method presents a powerful procedure for research into new cancer treatments in the laboratory