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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-001680-8

Inflammasom - Aktivierung in murinen Makrophagen nach Infektion mit Burkholderia pseudomallei und deren Bedeutung für die Virulenz

  • Bei dem gramnegativen Pathogen Burkholderia pseudomallei, auch bekannt als Erreger der ‘Melioidose’, handelt es sich um einen saprophytischen Bodenbewohner, der in den tropischen und subtropischen Regionen Südostasiens und Nordaustraliens endemisch verbreitet ist. Als fakultativ intrazellulärer Erreger ist B. pseudomallei neben einer Vielzahl nicht phagozytierender Zellen auch in professionellen Phagozyten zur Replikation fähig. In Makrophagen sind cytosolische NOD-like Rezeptoren (NLR) als Bestandteil der angeborenen Immunabwehr maßgeblich an der Erkennung intrazellulärer Gefahrensignale beteiligt. Bei entsprechender Signalgebung wird durch Assemblierung eines als ‘Inflammasom’ bezeichneten Multiproteinkomplexes die Rekrutierung und nachfolgende Autoaktivierung von Caspase-1 bewirkt. Nach Infektion mit B. pseudomallei geht die Aktivierung von Caspase-1 in Verbindung mit dem NOD-like Rezeptor Nlrp3 mit der Prozessierung und Sekretion der Cytokine IL-1β und IL-18 einher, wohingegen der Sensor Nlrc4 in erster Linie für die Induktion einer inflammatorischen Form des Zelltodes namens ‘Pyroptose’ verantwortlich ist. Da der Knockout von Caspase-1 bei muriner Melioidose einen signifikanten Anstieg der Mortalitätsrate nach sich zieht, sollten in der vorliegenden Arbeit Caspase-1-vermittelte Effektormechanismen gegenüber B. pseudomallei näher untersucht werden. Infolge der Infektion muriner C57BL/6 Makrophagen mit B. pseudomallei wurde bereits 60 Minuten post infectionem eine Caspase-1 und -9-abhängige Prozessierung von Caspase-7 sowie des DNA-Reparaturenzyms PARP deutlich. Als verantwortlicher Sensor ist hierbei der NOD-like Rezeptor Nlrc4 identifiziert worden. Obwohl in Caspase-1/11 knockout Makrophagen während der Frühphase der Infektion keine Spaltprodukte der drei genannten Caspasen vertreten waren, konnte zu späteren Zeitpunkten eine massive Aktivierung der apoptotischen Caspasen-8, -9, -3 und -7 sowie der Stress-induzierten MAP-Kinasen JNK und p38 beobachtet werden. Vergleichende Proteomanalysen B. pseudomallei-infizierter C57BL/6 Makrophagen ließen ebenfalls eine verstärkte Expression proapoptotischer und proinflammatorischer Signalmoleküle in Caspasen-1/11-defizienten Makrophagen erkennen. Im Gegensatz dazu wies der Knockout von Caspase-7 nach Infektion mit B. pseudomallei weder in vitro noch in vivo einen charakteristischen Phänotyp auf. Im Vergleich zu B. pseudomallei konnte durch die Infektion mit der avirulenten Spezies Burkholderia thailandensis erst bei verhältnismäßig hohen Infektionsdosen eine sichtbare Prozessierung der Caspasen-1, -9 und -7 in C57BL/6 Makrophagen erreicht werden. Darüber hinaus wurde trotz einem mit B. pseudomallei vergleichbaren Replikationsvermögen, ein geringeres Maß an Pyroptose in B. thailandensis - infizierten Makrophagen nachgewiesen. Zur Identifizierung, welche bakteriellen Komponenten von B. pseudomallei für die Aktivierung von Caspase-1 verantwortlich sind, wurden zwei Deletionsmutanten der Bsa T3SS-Proteine BopE und BsaK hergestellt. Dem Bsa T3SS konnte in vorausgehenden Studien eine wesentliche Funktion für die Virulenz von B. pseudomallei im Tiermodell zugeschrieben werden und dessen Bestandteile weisen Homologien zu den Inv/Mxi-Spa-Sekretionssystemen von S. typhimurium und S. flexneri auf. Die Aktivierung der Caspasen-1, -9 und -7 sowie die Spaltung von PARP wurde durch die Infektion muriner Makrophagen mit der Mutante des ‘inner rod proteins’ BsaK vollständig aufgehoben, wohingegen die Mutagenese des Effektors BopE keinen Einfluss ausübte. Neben einer verminderten Freisetzung von LDH und IL-1β konnte dabei auch ein Anstieg der intrazellulären Keimzahl in ΔBsaK-infizierten Makrophagen verzeichnet werden. Demgegenüber führte die Verwendung einer Flagellin-Transposonmutante lediglich zu einer Reduktion der B. pseudomallei-induzierten Prozessierung der Caspase-1, -9 und -7 sowie der Spaltung von PARP. Mittels Überexpressionsstudien in HEK-293 Zellen konnte ferner die potentielle Fähigkeit des Bsa T3SS-Effektors BopE zur Aktivierung von Caspase-1 in Abhängigkeit von der Funktionalität der BopE-eigenen GEF-Domäne demonstriert werden. In verschiedenen in vivo Experimenten wurde gezeigt, dass ΔBsaK-infizierte BALB/c Mäuse im Vergleich zum Wildtyp und in Verbindung mit geringen Keimzahlen in Lunge, Leber und Milz durch eine signifikant verminderte Mortalitätsrate sowie eine Reduktion proinflammatorischer Mediatoren gekennzeichnet sind. Insgesamt betrachtet zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass BsaK, als strukturelle Komponente des Bsa Typ-III-Sekretionsapparates, in murinen Makrophagen sowohl für die B. pseudomallei-induzierte Aktivierung der Caspasen-1, -9 und -7 durch das Nlrc4-Inflammasom als auch den nachfolgenden pyroptotischen Zelltod verantwortlich ist. Durch die Attenuierung der BsaK-Mutante im Mausmodell wird gleichzeitig die Bedeutung von Typ-III-Sekretionssystemen für die Virulenz pathogener Bakterien unterstrichen.
  • The pathogenic bacterium Burkholderia pseudomallei, commonly known as causative agent of melioidosis, is a gram-negative soil saprophyte endemically distributed in tropical and subtropical areas of south-east Asia and northern Australia. As a facultative intracellular pathogen, B. pseudomallei is able to invade and survive within the cytosol of various types of eukaryotic cells including professional phagocytes. Cytosolic NOD-like receptors belong to the innate immune system and are involved in the detection of intracellular danger signals leading to the activation of host defense mechanisms. Signal recognition initiates the assembly of a multiprotein complex called ‘inflammasome’ which serves as scaffold for the recruitment and activation of procaspase-1. It was shown that B. pseudomallei-induced caspase-1 activation via Nlrp3 predominantly results in the processing and release of IL-1β and IL-18, whereas Nlrc4 regulates an inflammatory type of cell death designated as pyroptosis. Since the knockout of caspase-1 is associated with a significant increase of mortality in murine melioidosis, one objective of this thesis was to elucidate caspases-1-mediated effector mechanisms towards B. pseudomallei. It could be demonstrated that already 60 minutes post infection C57BL/6 macrophages are characterized by the processing of caspase-9, caspases-7 and the DNA repair enzyme PARP downstream of the Nlrc4/caspases-1 inflammasome. Although caspases-1/11 knockout macrophages do not show cleavage products of any caspase or PARP during the early phase of infection, at later time points a strong induction of apoptosis could be observed which is accompanied by the activation of classical apoptotic initiator and effector caspases as well as the MAP kinases JNK and p38. Moreover higher transcription rates of the cytokines IL-6 and TNF-α were measured in macrophages lacking caspases-1/11. A comparative proteome analysis of B. pseudomallei-infected macrophages could reveal an increased expression of proapoptotic and proinflammatory signaling molecules in the absence of caspase-1/11. On the contrary the knockout of caspase-7 does not seem to have a distinct phenotype in murine melioidosis, neither in vitro nor in vivo. Processing of the caspases-1, -9 and -7 in C57BL/6 macrophages upon infection with avirulent Burkholderia thailandensis could be detected only by the use of relatively high infectious doses. Despite a comparable ability to replicate intracellularly, B. thailandensis elicits a significantly lower extent of pyroptotic cell death than B. pseudomallei. To determine which bacterial components are responsible for the B. pseudomallei-induced caspases-1 activation, two deletion mutants lacking either the Bsa T3SS-protein BopE or BsaK were constructed. The Bsa T3SS plays an important role for the virulence of B. pseudomallei in different animal models and some of its components share homologies to the Inv/Mxi-Spa type 3 secretion systems of S. typhimurium and S. flexneri. In this study the inner rod protein BsaK mutant failed to induce the processing of the caspases-1, -9, -7 as well as PARP and displayed higher intracellular numbers compared to the wildtype. Furthermore the deletion of BsaK was associated with a lower release of LDH and IL-1β from infected macrophages. Although it could be shown that the Bsa T3SS effector BopE per se, dependent on the functionality of its GEF domain, is able to activate caspases-1 in HEK293 cells, in murine macrophages it seems to be dispensable for the activation of the Nlrc4/caspases-1 inflammasome. Moreover, a slight reduction in the processing of caspases-1 after infection with B. pseudomallei FliC mutant indicates only a partial dependence on cytosolic flagellin. BALB/c mice intranasally infected with the BsaK mutant strain were characterized by a significant decreased mortality rate, lower bacterial loads in organs and reduced levels of proinflammatory cytokines as well as the neutrophil enzyme myeloperoxidase. On the contrary no difference in virulence could be detected between the B. pseudomallei wildtype and the BopE- or FliC mutant strains. Overall the results of this study identify the Bsa T3SS inner rod protein BsaK as crucial element for the early B. pseudomallei-induced activation of the Nlrc4/caspases-1, -9 and -7 cascade and the subsequent pyroptotic cell death. In addition the attenuation of the BsaK mutant in vivo clearly demonstrates the significance of type 3 secretion systems for the virulence of pathogenic bacteria.

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Metadaten
Author: Kathrin Matschinski
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001680-8
Title Additional (English):Activation of the inflammasome in murine macrophages after infection with Burkholderia pseudomallei and its impact on virulence
Advisor:Dr. Antje Bast, Prof. Dr. Ivo Steinmetz
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2014/01/22
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2013/12/13
Release Date:2014/01/22
Tag:IL-1ß, Inflammasom, T3SS
GND Keyword:Apoptose, Burkholderia, Caspasen, Deletionsmutante, Makrophage, Virulenz, Zelltod
Faculties:Universitätsmedizin / Friedrich-Loeffler-Institut für Medizinische Mikrobiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie