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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-000635-5

Expression und Funktion von Arzneistofftransportproteinen in der Plazenta

  • Bis zum jetzigen Zeitpunkt wurden in der Plazenta über 30 membranständige Transportproteine identifiziert, die zum einen in der maternal zugewandten (apikalen) oder zum anderen in der fetal zugewandten (basalen) Membran der Synzytiotrophoblasten lokalisiert sein können. Trotz vieler Hinweise auf die Existenz plazentarer Transportproteine verfügen wir bis heute über kein umfassendes Wissen über ihre Funktion und Expression. Die vorliegende Arbeit wurde initiiert, um die Kenntnisse über plazentare Transportproteine zu vervollständigen und ein möglichst komplexes Wissen über ihre Expression und Funktion in der Plazenta zu gewinnen. Dazu wurden die Transportproteine ABCB1 (P-glycoprotein) und ABCC2 (multidrug resistance protein 2, MRP2) als Vertreter der Effluxtransporter einerseits und OCT3 (organic cation transporter 3) als Vertreter der Aufnahmetransporter anderseits zur weiteren Charakterisierung ausgewählt. Zuerst wurden die Untersuchungen zur plazentaren Expression der Transportproteine ABCB1, ABCC2 und OCT3 durchgeführt und der Einfluss von intrauteriner Entwicklung, schwangerschaftsassoziierten Erkrankungen und Genotyp auf die Expression geprüft. Anschließend wurde die Funktion von ABCB1, ABCC2 und OCT3 mittels Modellsubstraten und selektiver Hemmer untersucht. Die Expression wurde auf mRNA-Ebene mittels real-time RT-PCR (TaqMan®) und auf Protein-Ebene mittels quantitativer Western Blot-Analyse bestimmt. Die funktionellen Untersuchungen wurden an OCT3 überexprimierenden MDCKII-Zellen, plazentaren Membranvesikel, mittels der dualen ex vivo Perfusion der Rattenplazenta und des dualen in vitro Perfusionsmodells der menschlichen Plazenta durchgeführt. Die plazentare ABCC2-Expression in der Spätschwangerschaft war deutlich höher als die Expression von ABCB1. In Untersuchungen zur intrauterinen Entwicklung wurde ein signifikanter gestationsaltersabhängiger Anstieg der OCT3-Expression auf mRNA- und Protein-Ebene beobachtet. Die schwangerschaftsassoziierten Erkrankungen Präeklampsie und Gestationshypertonie verminderten signifikant die OCT3-Expression auf mRNA- und Protein-Ebene. In Untersuchungen zur Veränderungen der Expression in Abhängigkeit vom Genotyp waren die Polymorphismen C3435T und G2677T im ABCB1-Gen und C3972T und C24T im ABCC2-Gen mit einer veränderte Expression der Transporter verbunden. In den funktionellen Untersuchungen wurde zuerst der Einfluss von pharmakologisch relevanten Substanzen auf die Aufnahme des OCT3-Modellsubstrats 1-Methyl-4-phenyl-pyridinium (MPP) in die MDCKII-OCT3-Zellen getest. Einen signifikanten Hemmeffekt auf die MPP-Aufnahme zeigten Imipramin, Fluoxetin, Ecstasy, Nikotin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) und der bekannte OCT3-Inhibitor Disprocynium 24 (D24). Um die Funktion von OCT3 näher zu charakterisieren, wurde die MPP-Aufnahme in die apikalen und basalen Membranvesikel der menschlichen Plazenta untersucht. In den apikalen Vesikel zeigten Fluoxetin, Amphetamin und MPTP eine signifikante Hemmung des MPP-Transports. In den basalen Vesikel haben D24, Imipramin und Ecstasy die MPP-Aufnahme gehemmt. Im nächsten Schritt wurde die Funktion von Abcb1 und Abcc2 mit Hilfe der dualen ex vivo Perfusion der Rattenplazenta an Abcc2-defizienten- und Wildtyp-Ratten untersucht. Die Abwesenheit eines funktionsfähigen Abcc2-Transporters führte bei Abcc2-defizienten-Ratten zu einer erhöhten materno-fetalen Permeabilität des Modellsubstrats Talinolol, die durch Zugabe des Abcb1-Hemmers PSC833 weiter anstieg. Bei den Wildtyp-Ratten verursachte die Zugabe von PSC833 und dem Abcc2-Hemmer Probenecid einen Anstieg der materno-fetalen Permeabilität von Talinolol. Dies spricht für Beteiligung beider Transportproteine an der Plazentabarriere. Im dualen in vitro Perfusionsmodell der menschlichen Plazenta wurde ein unidirektionaler feto-maternaler Transfer des ABCB1- und ABCC2-Modellsubstrats Talinolol bewiesen. Dieser Transfer war durch den ABCC2-Inhibitor Probenecid und den unselektiven Inhibitor Verapamil modulierbar. Der ABCB1-Inhibitor PSC833 hatte dagegen keinen Einfluss auf die diaplazentare Permeabilität von Talinolol. Dies und die hohe ABCC2-Expression in der Terminplazenta spricht für eine größere Bedeutung von ABCC2 in der Spätschwangerschaft. Weitere Untersuchungen mittels des dualen in vitro Perfusionsmodells der menschlichen Plazenta wurden zur Beschreibung der Funktion von OCT3 durchgeführt. In der vorliegenden Arbeit wurde eine höhere materno-fetale Permeabilität des OCT3-Modellsubstrats MPP festgestellt. Der selektive OCT3-Hemmer D24 verminderte die materno-fetale Permeabilität des Modellsubstrats MPP signifikant. Daraus folgern wir, dass OCT3 in den diaplazentaren Transfer von organischen Kationen in fetale Richtung involviert sein muss. Psychopharmaka wie Fluoxetin, Imipramin oder illegale Drogen wie Ecstasy können die Funktion von OCT3 beeinflussen und damit den diaplazentaren Transfer von kationischen Substanzen verändern.
  • Expression and Function of Placental Transporters PhD Thesis Summary Veronika Rozehnal Placental syncytiotrophoblasts are known to express a wide variety transporters which are involved in diaplacental transfer of nutrients, xenobiotics and drugs. In this PhD thesis, expression and function of efflux transporters ABCB1 (P-gp) and ABCC2 (MRP2) and uptake transporter OCT3 was evaluated. The multidrug transporter proteins ABCB1 (P-gp) and ABCC2 (MRP2) are supposed to be a functional part of the human placental barrier. We studied the influence of the P-gp inhibitor PSC833 and the MRP2 inhibitor probenecid on the placental transfer of the probe drug talinolol. Further, the expression and localisation of both transporters in human term placenta were evaluated. Permeability of talinolol (0.8 µM) in normal term placentas was measured in the presence of PSC833 (1,9 µM, n=6) or probenecid (10 mM, n=6) using the dual in-vitro perfused human placental lobe model. Permeability of antipyrine (0.4 mM) and creatinine (1.3 mM) which cross the placenta by non-ionic diffusion were used as reference. Perfusion volume, glucose consumption and lactate production were measured to control viability of the perfused cotyledon. Expression of both transporters was determined by real-time RT-PCR and Western blot. The permeability of talinolol relative to creatinine permeability was significantly higher in presence of probenecid (0,68 ± 0,13 vs 0,59 ± 0,15; p<0.028, Wilcoxon). There was no effect of PSC833 on the transplacental transfer of talinolol (0,48 ± 0,11 vs. 0,46 ± 0,09; p< 0.345, Wilcoxon). Compare to P-gp expression MRP2 expression was significantly higher on mRNA level. Our results suggested that MRP2 in contrast to P-gp plays a significant role in the human placental barrier which may protect the fetus from potentially harmful compounds. In the second part of the PhD thesis expression and function of organic cation transporter 3 (OCT3) was examinated. The organic cation transporter 3 (OCT3) is localized to placental sycytiotrophoblasts and is involved in diaplacental transfer of monoamines and cationic drugs. So far it is unknown whether its expression is influenced by maturation and diseases. Therefore, we studied the influence of pre-eclampsia (PE), pregnancy induced hypertension (PIH) and gestational age on the placental expression of OCT3. Furthermore, we evaluated the function of OCT3 in placentas obtained from normotensive pregnancies at term. Expression of OCT3 was determined by real-time RT-PCR and Western blot in normotensive term (n=40), preterm (n=45) and early preterm placentas (n=40), and in placentas from women with PE (n=15) and PIH (n=10). Transport function of OCT3 was evaluated by measuring the uptake of MPP+ into OCT3 transfected MDCK cells and into vesicles prepared from basal (BMVs) and apical (AMVs) membranes of the human placenta. The quality of the vesicles and expression of OCT3 in BMVs were confirmed by Western blot. Furthermore the function of OCT3 was evaluated using dual in vitro placenta perfusion model. There was an age-dependent increase of placental OCT3 mRNA expression (early preterm 1.90, preterm 4.23, term 53.17; p<0.05, Mann-Whitney). In placentas of patients with PIH, OCT3 expression was significantly lower both on mRNA and protein level (33.40 vs. 53.17 and 0.21 vs. 5.25; p<0.05; Mann-Whitney). The uptake of MPP+ into BMVs was inhibited by disprocynium 24 (10 ìM), a selective inhibitor of OCT3. The uptake of MPP+ into AMVs was inhibited by MPTP (100 µM) and fluoxetine (100 ìM). In MDCK/OCT3 cells, disprocynium D24, MPTP and fluoxetine showed inhibitory effect. In dual in vitro placenta perfusion model MPP permeability was significantly reduced in the presence of D24 (1,01 0,13 vs. 0,62 0,05; p<0,05; Mann-Whitney-Test) and significantly elevated in the presence of fluoxetine (1,10 0,22 vs. 0,62 0,05; p<0,05; Mann-Whitney-Test). To sum up, OCT3 is involved in diaplcental transport of cationic drugs and its placental expression undergoes gestational maturation and is influenced by pre-eclampsia and pregnancy induced hypertension.

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Metadaten
Author: Veronika Rozehnal
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000635-5
Title Additional (English):Expression and function of transporters in the placenta
Advisor:Prof. Dr. Werner Siegmund
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2009/06/30
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2009/06/15
Release Date:2009/06/30
Tag:ABCB1, ABCC2, OCT3, Plazenta, Transportprotein
ABCB1, ABCC2, OCT3, placenta, transporter
GND Keyword:ABCB1, ABCC2, OCT3, Plazenta, Transportprotein
Faculties:Universitätsmedizin / Institut für Pharmakologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie