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Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002005-5

Die Interaktion des Plättchenfaktors 4 mit Nukleinsäuren - Implikationen für die biologische Rolle des Plättchenfaktors 4 und den therapeutischen Einsatz von Aptameren

  • Die Heparin-induzierte Thrombozytopenie (HIT) ist eine seltene, aber lebens-bedrohliche unerwünschte Wirkung einer Therapie mit Heparin. Ausgelöst wird sie durch die Bildung von Antikörpern, die gegen Komplexe aus dem positiv geladenem Thrombozytenprotein Plättchenfaktor 4 (PF4) und negativ geladenem Heparin gerichtet sind und Thrombozyten aktivieren können, welches sich klinisch in einer schweren prothrombotischen Diathese bei gleichzeitiger Thrombozytopenie äußert. Bemerkenswert ist, dass im Widerspruch zur klassischen Immunantwort bei der HIT auch von Heparin-naiven Patienten binnen weniger Tage anti-PF4/Heparin-Antikörper der Immunglobulinklasse G gebildet werden, welche eigentlich eine sekundäre Immunantwort repräsentieren. Darüber hinaus ist bekannt, dass PF4 auch mit verschiedenen polyanionischen Nichtheparinen Komplexe bildet, die von anti-PF4/Heparin-Antikörpern erkannt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob Nukleinsäuren, die aufgrund ihres Reichtums an Phosphatgruppen ebenfalls stark negativ geladenen sind, mit PF4 Komplexe bilden, die von anti-PF4/Heparin-Antikörpern erkannt werden. Da eine Bildung antigener Komplexe mit PF4 für therapeutisch eingesetzte Nukleinsäuren von hoher praktischer Relevanz wäre, wurde außerdem die Interaktion von PF4 mit verschiedenen Aptameren untersucht. Dazu wurde die Interaktion zwischen PF4 und Nukleinsäuren in systematischen Bindungsstudien mit verschieden strukturierten Nukleinsäuren charakterisiert. Mittels Circulardichroismus-Spektroskopie wurde der Einfluss eines Modellaptamers auf die Sekundärstruktur von PF4 mit dem Einfluss von Heparin auf die PF4-Struktur verglichen. Die Kreuzreaktivität von anti-PF4/Heparin-Antikörpern gegen PF4/Nukleinsäure- bzw. PF4/Aptamer-Komplexe wurde mittels Immunassay und Thrombozytenfunktionstest untersucht. Schließlich wurde im Mausmodell die in-vivo-Immunogenität eines PF4/Aptamer-Komplexes überprüft. Es konnte gezeigt werden, dass Nukleinsäuren längen- und strukturabhängig mit PF4 interagieren. Die Neigung zur Komplexbildung mit PF4 stieg mit der Länge der Nukleinsäure und dem Anteil doppelsträngiger Abschnitte. PF4/Nukleinsäure-Komplexe wurden von anti-PF4/Heparin-Antikörpern erkannt und konnten in Gegenwart dieser Antikörper eine Thrombozytenaktivierung vermitteln. Mit PF4/Aptamer-Komplexen immunisierte Mäuse produzierten anti-PF4/Aptamer-Antikörper, welche gegen PF4/Heparin-Komplexe kreuzreagierten. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass insbesondere Aptamere mit hohem Anteil an doppelsträngigen Abschnitten mit PF4 Komplexe bilden können, die ein ähnliches Epitop exprimieren wie PF4/Heparin-Komplexe und damit ein potentielles Risiko für die Erzeugung HIT-ähnlicher prothrombotischer Komplikationen bergen. Nukleinsäuren könnten einen endogenden Interaktionspartner von PF4 darstellen und das höhere HIT-Risiko von Patienten nach großen orthopädischen Eingriffen oder schweren Infektionen erklären, welche mit höheren Plasmaspiegeln zellfreier Nukleinsäuren einhergehen. Darüber hinaus könnte die Interaktion von PF4 mit endogenen Nukleinsäuren eine Erklärung für die frühe Produktion von anti-PF4/Heparin-Antikörper der Immunglobulinklasse G liefern.
  • Heparin-induced thrombocytopenia is a rare but life-threatening adverse drug reaction. It is due to antibodies targeting high-molecular complexes formed by heparin and the platelet protein platelet factor 4, which cause platelet activation and the clinical paradox of concurrent thrombocytopenia and thrombosis. Remarkably, even in heparin-naïve patients anti-PF4/heparin antibodies of IgG class are formed within few days after heparin exposure, paralleling a secondary immune response. Several polyanions other than heparin are known to form complexes with PF4 that are also recognized by anti-PF4/heparin antibodies. Nucleic acids represent a source of endogenous polyanions as they are highly negatively charged due to their phosphate groups. In the present study was assessed whether PF4 and nucleic acids also form complexes that are detected by anti-PF4/heparin antibodies. Because of the clinical relevance of the formation of antigenic complexes between PF4 and therapeutic nucleic acids, a special focus was put on the interaction between PF4 and aptamers. First, the structure-function-relationship of the interaction between PF4 and nucleic acids was assessed by flow cytometry, using nucleic acids differing in length and structure. By circular dichroism spectrometry, the influence of an aptamer on the secondary structure of PF4 was compared to the effect of heparin on the PF4 structure. Cross-reactivity of anti-PF4/heparin antibodies against PF4/nucleic acid complexes was tested by EIA and a platelet activation assay. Last, immunogenicity of PF4/aptamer complexes was studied in a mouse model. Flow-cytometry revealed that PF4 and nucleic acids formed high-molecular complexes on the platelet surface, whereby complex formation between nucleic acids and PF4 increased with chain length and number of double-stranded domains of the nucleic acids. PF4/nucleic acid complexes were recognized by anti-PF4/heparin – antibodies in the EIA and induced platelet activation in the presence of anti-PF4/heparin antibodies. Mice immunized with PF4/aptamer complexes produced anti-PF4/aptamer antibodies, which cross-reacted against PF4/heparin complexes. These results suggest that especially aptamers with a high proportion of double-stranded domains can form high-molecular complexes with PF4 that expose an epitope which is also found on PF4/heparin complexes. Hence they may bear the risk of prothrombotic side effects resembling HIT. Moreover, nucleic acids may be an endogenous complex partner of PF4. This may give an explanation for the higher frequency of HIT in patients after major surgery or severe inflammation, as these are conditions with higher plasma levels of cell-free nucleic acids – and the early production of anti-PF4/heparin IgG in heparin-naïve patients.

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Metadaten
Author: Miriam Elisabeth Jaax
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002005-5
Title Additional (English):The interaction of platelet factor 4 and nucleic acids - implications for the biological role of platelet factor 4 and the therapeutic use of aptamers
Advisor:Prof. Dr. Andreas Greinacher
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2014/10/06
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Universitätsmedizin (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2014/06/19
Release Date:2014/10/06
GND Keyword:Aptamer, Arzneimittelnebenwirkung, Heparin, Thrombozytopenie
Faculties:Universitätsmedizin / Institut für Immunologie u. Transfusionsmedizin - Abteilung Transfusionsmedizin
DDC class:600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 610 Medizin und Gesundheit