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Einfluß von Histondeacetylase-Inhibitoren auf die Tumorzellyse durch Immunzellen

  • Histondeacetylase-Inhibitoren (HDIs) bilden eine Gruppe relativ neuer vielversprechender anti-neoplastischer Wirkstoffe. Sie hemmen die Funktion der Histondeacetylasen und greifen somit in die Regulation der genomweiten Transkription ein. HDIs besitzen direkte tumortoxische Wirkung, lassen nicht transformierte Zellen jedoch weitgehend unbeeinflußt. Darüber hinaus verstärken sie die zytotoxischen Aktivitäten einer Vielzahl anderer Tumortherapeutika und sensibilisieren Tumorzellen für die zytolytischen Effekte aktivierter NK-Zellen. Die Einbindung des Immunsystems in die Tumortherapie wirft jedoch die Frage nach einer direkten, möglicherweise hemmenden Wirkung der HDIs auf Immunzellen auf. In dieser Arbeit wurde untersucht, welcher Mechanismus dem Synergismus von HDIs und aktivierten NK-Zellen zugrunde liegt, ob HDIs Tumorzellen auch für die zytolytischen Effekte tumorspezifischer T-Zellen sensibilisieren und welche direkte Wirkung HDIs auf Immunzellen ausüben. Alle Arbeiten wurden in vitro mit humanen Zellen/Zellinien durchgeführt. Als HDIs kamen Suberoylanilid-Hydroxamsäure (SAHA) und Natriumbutyrat (NaB) zum Einsatz. Aufbauend auf ein bereits etabliertes in-vitro-Testsystem, wurde gezeigt, daß nach IL-2-Aktivierung von PBMCs im wesentlichen NK-Zellen Tumorzelltod induzierten. Dabei war die Funktionsfähigkeit der aktivierenden NK-Rezeptoren NKG2D, DNAM-1 und der NCRs kritisch für Erkennung und Lyse der Tumorzellen, wie der Einsatz blockierender Antikörper deutlich machte. Sowohl bei unbehandelten als auch bei HDI-behandelten Tumorzellen führte die Maskierung all dieser Rezeptoren zu einer vollständigen Inhibition der Tumorzellyse, d.h. die Induktion alternativer aktivierender NK-Liganden durch HDIs wurde ausgeschlossen. Wurden nur ein oder zwei aktivierende Rezeptoren maskiert, ergab sich hingegen ein Unterschied zwischen unbehandelten und HDI-behandelten Tumorzellen: Der protektive Effekt der Maskierung fiel bei HDI-behandelten Tumorzellen deutlich geringer aus. HDIs erhöhen also die Redundanz der schon zuvor involvierten aktivierenden NK-Rezeptoren. Oberflächenfärbungen legten nahe, daß diese Redundanzerhöhung – und somit die Sensibilisierung der Tumorzellen – auf die HDI-induzierte Heraufregulation aktivierender NK-Liganden auf Tumorzellen zurückzuführen ist. Ein Einfluß der HDIs auf die Expression der Todesrezeptoren Fas, DR4 und DR5 wurde ausgeschlossen. Um die Untersuchungen auf das Zusammenwirken von HDIs und zytotoxischen T-Zellen auszuweiten, wurde ein Primingsystem zur Generation tumorspezifischer T-Effektorzellen etabliert. Allogene Spender-T-Zellen wurden mit Hilfe CD86-transfizierter Zellen der Melanomzellinie SkMel63 geprimt, d.h. in diesem System dienten Alloantigene als Ersatz für Tumorantigene. Starke T-Zellproliferation und die Sekretion T-Zell-spezifischer Zytokine zeigten ein erfolgreiches Primen der T-Zellen an. Geprimte tumorspezifische T Zellen lysierten Wildtyp-SkMel63-Zellen effektiv ohne die Notwendigkeit eines Ko-Stimulus. Die Vorbehandlung mit SAHA sensibilisierte die SkMel63-Zellen für die Zelltodinduktion durch T-Zellen. Eine mögliche Ursache für den Synergismus könnte auch hier die verstärkte Expression der NKG2D-Liganden sein, da NKG2D auf T-Zellen als ko-stimulierender Rezeptor fungiert. Da funktionsfähige Immunzellen eine Voraussetzung für die beschriebenen sensibilisierenden HDI-Effekte sind, wurde auch die direkte Wirkung der HDIs auf NK- und T-Zellen untersucht. Tumortoxische Konzentrationen von SAHA verhinderten ihre aktivierungsinduzierte Proliferation und Zytokinsekretion, beeinträchtigten die CD107a-Mobilisierung und hemmten die zytolytische Aktivität der Immunzellen. Diese Beobachtungen spiegeln zwei Phänomene wider: Erstens übt SAHA eine zytotoxische Wirkung auf die Immunzellen aus, und zweitens inhibiert SAHA die IL-2-Aktivierung von NK-Zellen sowie das Primen tumorspezifischer T-Zellen. In starkem Gegensatz dazu wurden NK- und T-Zellen, die in Abwesenheit von HDIs aktiviert wurden, resistent gegen deren zytotoxische und immunsuppressive Wirkung und zeigten später – auch in Anwesenheit hoher HDI-Konzentrationen – normale zytolytische Aktivität. Die Sensibilität von NK- und T-Zellen für suppressive HDI-Effekte hängt also von ihrem Aktivierungszustand ab, und nur vollständig aktivierte Immunzellen sind resistent gegen HDIs. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen ein großes therapeutisches Potential der Kombination von HDIs und immunstimulierender Behandlung auf. Als eine vielversprechende therapeutische Strategie erscheint daher ein sequentieller Ansatz, bestehend aus der Immunstimulation der Tumorpatienten gefolgt von der HDI-vermittelten Sensibilisierung der Tumorzellen für die Angriffe des patienteneigenen Immunsystems.
  • Histone deacetylase inhibitors (HDIs) are a group of relatively new promising anti-neoplastic agents. They inhibit the function of histone deacetylases, thereby influencing the regulation of genome-wide transcription. HDIs are tumour-toxic but leave untransformed cells largely unimpaired. Furthermore, they enhance the cytotoxic effects of other therapeutic regimens and sensitize tumour cells for the cytolytic effects of activated NK cells. Integrating the immune system into tumour therapy raises the question whether HDIs would negatively affect immune cells. In this thesis, the underlying mechanism of the synergism of HDIs and activated NK cells was explored. It was investigated whether HDIs also sensitize tumour cells for the cytolytic effects of tumour-specific T cells and whether HDIs directly influence immune cells. All tests were performed in vitro. HDIs used were suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) and sodium butyrate (NaB). Based on an already established in vitro testing system it was shown that after IL-2 activation of PBMCs mainly NK cells induced cell death in tumour cells. Recognition and lysis of tumour cells was dependent on the functional capability of the activating NK receptors NKG2D, DNAM-1 and the NCRs as was demonstrated by the application of blocking antibodies. Masking all of these receptors led to complete inhibition of lysis of untreated as well as of HDI-treated tumour cells, i.e. HDIs did not induce alternative activating NK ligands. However, when only one or two activating receptors were masked the protective effect of the antibodies was less in HDI-treated tumour cells than in untreated. Thus, HDIs enhance the redundancy of the involved activating receptors. Surface staining of tumour cells suggests that enhanced redundancy – and consequently sensitizing of tumour cells – can be ascribed to HDI-induced up-regulation of activating NK ligands on tumour cells. HDIs did not influence the expression of the death receptors Fas, DR4 or DR5. To investigate the interaction of HDIs and cytotoxic T cells a priming system for the generation of tumour-specific T effector cells was established. Allogeneic donor T cells were primed using CD86-transfected melanoma cells SkMel63. In this system, alloantigens served as surrogate tumour antigens. Strong T cell proliferation and the secretion of T cell-specific cytokines indicated successful priming of T cells. Primed tumour-specific T cells effectively lysed wild-type SkMel63 cells without the need of a co-stimulus. SAHA-treated SkMel63 cells were sensitized for cell death induction by T cells. Again, this may be caused by the enhanced expression of NKG2D ligands since NKG2D functions as a co-stimulatory receptor on T cells. Since functional immune cells are required for the sensitizing HDI effects, the direct impact of HDIs on NK and T cells was examined. Tumour-toxic concentrations of SAHA prevented their activation-induced proliferation and cytokine secretion, impaired CD107a mobilization and inhibited the cytolytic activity of the immune cells. This observation reflects two phenomena: Firstly, SAHA has a cytotoxic effect on immune cells, and secondly, SAHA inhibits the IL-2 activation of NK cells as well as the priming of tumour-specific T cells. In contrast, NK and T cells which had been activated in the absence of HDIs became resistant to the cytotoxic and immunosuppressive effects. Once activated, they performed normal cytolytic activity even in the presence of high HDI doses. Thus, the sensitivity of NK and T cells for suppressive HDI effects depends on their activation state, and immune cells have to be completely activated to gain resistance to HDIs. The results of this thesis reveal a therapeutic potential of the combination of HDIs and immune stimulation. A promising strategy might be a sequential therapy: First the immune system of tumour patients should be stimulated, and then the tumour cells could be sensitized for the attack of the patients’ own immune system.

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Metadaten
Author: Mareike Schmudde
URN:urn:nbn:de:gbv:9-000827-8
Title Additional (English):Influence of histone deacetylase inhibitors on tumour cell lysis by immune cells
Advisor:Prof. Dr. Barbara Bröker
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2010/08/12
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2010/06/28
Release Date:2010/08/12
Tag:Histondeacetylase-Inhibitor, Natürliche Killerzelle
GND Keyword:T-Lymphozyt, Tumor, Zelltod
Faculties:Universitätsmedizin / Institut für Immunologie u. Transfusionsmedizin - Abteilung Immunologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie