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Synthese und biologische Aktivität von Nucleotidanaloga und 2-Arylessigsäurehydrazonen

  • Abschnitt I: Die Klasse II-Adenylylcyclasen (AC) stellen eine Gruppe von löslichen Toxinen dar, welche die Pathogenität einer ganzen Reihe von Krankheitserregern vermitteln, darunter Bacillus anthracis (Milzbrand), Bordetella pertussis (Keuchhusten) und Pseudomonas aeroginosa (u. a. Pneumonien). Im Rahmen des ersten Abschnittes dieser Arbeit wurde der aus B. anthracis stammende, sogenannte "Ödemfaktor" als Modellenzym ausgewählt, um die biologische Aktivität eines experimentellen Nucleotidanalogons gegenüber Adenylylcyclasen zu testen. Die gestellten Anforderungen an diese Verbindung, sowie die entsprechenden Lösungsansätze waren: 1) Einführung einer sterisch anspruchslosen, fluoreszierenden Reporterfunktion für in vitro-Bindungsstudien (N-Methylanthranylsäure), 2) Verhinderung von Acylübertragungsreaktionen des Fluorophors (Amid- statt Esterbindung) und 3) Erhöhung der Hydrolysestabilität des Triphosphatrestes (bioisosterer Austausch der terminalen Phosphoranhydridbindung). Die Synthese des Nucleotides ging von 2'-Amino-2'-Desoxyadenosin aus und wurde in zwei Schritten vollzogen. Zunächst wurde mit Hilfe eines Festphasenreagenz-unterstützten Protokolls N-Methylanthranilsäure amidartig an die 2'-Position geknüpft. Anschließend wurde dann in einem Ein-Topf-Verfahren an die 5'-Position eine triphosphatanaloge Seitenkette angebracht, in der die beta- und gamma-Phosphoratome statt über eine Dichlormethylenbrücke verbunden waren. Der Ki-Wert der so erhaltenen Verbindung (2'-MANT-2'-dAppCCl2p) gegenüber der isolierten AC-Domäne des B. anthracis-Ödemfaktors wurde in einem alpha[32P]-ATP-basierten kinetischen Assay mit 8,8 mM ermittelt. Diese Untersuchungen wurden durch einen FRET-basierten Bindungsassay ergänzt. Obwohl die Aktivität der Zielverbindung damit um ein bis zwei Größenordnungen niedriger war, als die von unmittelbar verwandten Substanzen, konnten nichtsdestotrotz die gestellten strukturellen Anforderungen an ein molekulares Werkzeug realisiert werden. Abschnitt II: Die Entstehung reaktiver Sauerstoffspezies, wie z. B. von Wasserstoffperoxid, ist ein unvermeidbarer Vorgang in allen anaerob lebenden Organismen. Daher entstanden im Laufe der Evolution eine ganze Reihe von biologischen Mechanismen, welche diese i. d. R. toxischen Verbindungen effektiv zu beseitigen vermögen. Ein Vertreter ist das selenhaltige Enzym Glutathionperoxidase (GPx), welches Wasserstoffperoxid und andere organische Hydroperoxide zu Wasser bzw. den korrespondierenden Alkoholen unter Verbrauch von Glutathion abbaut. Darüber hinaus wird aber auch zunehmend die Rolle von Wasserstoffperoxid als einem proapoptotischen Signalstoff diskutiert, was GPx zu einem interessanten pharmakologischen Ziel werden lässt. Durch Überexpression von GPx könnte die Apoptoseneigung eines Tumors gesenkt und somit dessen Vitalität erhöht werden, was sich unter anderem in einer gesteigerten Resistenz gegenüber bestimmten Zytostatika äußern kann. Auf dieser Arbeitshypothese aufbauend wurde die Synthese eines reversiblen GPx-Inhibitors angestrebt. Als Leitstruktur diente N'-(4-Hydroxybenzyliden)-2-(2-Methylimidazol-1-yl)essigsäurehydrazid, welches in einer Vorarbeit in einem in silico-Screening aufgedeckt worden war. In einem kombinatorischen Ansatz wurde sowohl die Arylessigsäure-Untereinheit (5 Varianten), als auch die Benzyliden-Komponente (7 Varianten) abgewandelt. Zur Darstellung der so projektierten Substanzbibliothek mussten zunächst die benötigten Arylessigsäurehydrazide synthetisiert werden. Diese wurden anschließend unter Einsatz eines Mikrowellen-gestützten Syntheseprotokolls mit den entsprechenden Benzaldehyden kombiniert. Von allen theoretisch möglichen Kombinationen konnten 30 Acylhydrazone in ausreichender Menge und Reinheit synthetisiert werden. Aufgrund technischer Probleme bei der Durchführung des Mikrotiterplatten-basierten GPx-Assays lagen zum Abschluss dieser Arbeit noch keine biologischen Daten vor.
  • Section I: The class II adenylyl cyclases (AC) represent a group of soluble toxins, which mediate the pathogenicity of a number of germs, including Bacillus anthracis (anthrax), Bordetella pertussis (whooping cough) and Pseudomonas aeroginosa (pneumonia, amongst others). In the context of the first section of the presented work, the so-called "edema factor" of B. anthracis was selected as model enzyme, to verify the biological activity of an experimental nucleotide analogue against ACs. The demanded requirements, as well as the chosen solutions, were: 1) introduction of a sterically non-demanding, fluorescent reporter function for in vitro-studies (N-methylanthranilic acid), 2) prevention of acyl transfer reactions of the fluorophore (amide instead of ester bond) and 3) an increased stability against hydrolysis of the triphosphate-residue (bioisosteric exchange of the terminal phosphoric anhydride). The synthesis of the nucleotide started from 2'-amino-2'-deoxyadenosine and proceeded in two steps. First, employing a solid-phase-reagent supported protocol, N-methylanthranilic acid was bound as its amide to the 2'-position. Subsequently a triphosphate-analog sidechain was attached to the 5'-position in an one-pot-procedure, with the beta- and gamma-phosphor atoms connected via a dichloromethylene bridge. The Ki value of the derivative produced in the described fashion (2'-MANT-2'-dAppCCl2p) against the isolated AC-domain of B. anthracis edema factor was determined as 8.8 mM in a kinetic alpha[32P]-ATP-based assay. These studies were supported by a FRET-based binding assay. Although the activity ranged one to two orders of magnitude lower compared to directly related compounds, the demanded structural requirements for a molecular tool could nonetheless be realised. Section II: The production of reactive oxygen species, e.g. hydrogen peroxide, is an inevitable process in all aerobic living organisms. Thus, a whole range of biological mechanisms were evolutionally developed, which are able to remove these usually toxic species. One representative is the selenium-containing enzyme glutathione peroxidise (GPx), which decomposes hydrogen peroxide and other organic hydroperoxides to water resp. the corresponding alcohols. Beyond that, the role of hydrogen peroxide as pro-apoptotic is increasingly discussed, which renders GPx a value pharmacological target. By overexpression of GPx the tendency for apoptosis of a tumour could be decreased, thus enhancing its viability. This could manifest, amongst other phenomena, in an increased resistance against certain cytostatics. Based on this working hypothesis, the synthesis of a reversible GPx-inhibitor was pursued. A lead served N'-(4-hydroxybenzylidene)-2-(2-methylimidazol-1-yl)acetic hydrazide, which was discovered during the course of an in silico-screening in a preceding work. Employing a combinatorial approach, the arylacetic acid-moiety (5 variations), as well as the benzylidene component (7 variations) were altered. For the realisation of such a projected substance library, the required arylacetic hydrazides were needed to be prepared first. Subsequently, these were combined with the corresponding benzaldehydes, making use of a microwave-assisted synthesis protocol. Out of all theoretically possible combinations 30 acylhydrazones could be prepared in a sufficient amount and purity. Due to technical problems with the microtiter plate-based GPx-assay, no biological data were available upon the conclusion of this work.

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Metadaten
Author: Thomas Emmrich
URN:urn:nbn:de:gbv:9-001220-6
Title Additional (English):Synthesis and biological activity of nucleotide analogues and 2-arylacetic hydrazones
Advisor:Prof. Dr. Andreas Link
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2012/04/24
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2011/11/09
Release Date:2012/04/24
Tag:Acylhydrazone, Adenylylcyclase, Glutathionperoxidase, Inhibition, Nucleotidanaloga
acylhydrazones, adenylylcyclase, glutathione peroxidase, inhibition, nucleotide analogues
GND Keyword:Enzyminhibitor, Kombinatorische Synthese, Organische Synthese
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Pharmazie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie