Bitte verwenden Sie diesen Link, wenn Sie dieses Dokument zitieren oder verlinken wollen: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:gbv:9-002635-3

[7.7]Paracyclophane produzierende Cyanobakterien als Quelle biologisch aktiver Naturstoffe

  • Cyanobakterien sind eine vielversprechende Quelle an strukturell diversen und biologisch hochaktiven Naturstoffen für die Entwicklung neuer Wirkstoffe. Bislang konnte die Strukturklasse der [7.7]Paracyclophane nur in fädigen Cyanobakterien der Gattungen Nostoc und Cylindrospermum nachgewiesen werden. Vorangegangene Arbeiten zeigten, dass gerade die Carbamidocyclophane chemisch und biologisch interessante Verbindungen darstellen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden vor allem die Carbamidocyclophane produzierenden Cyanobakterien Nostoc sp. CAVN2 und Nostoc sp. CAVN10 unter besonderer Berücksichtigung der strukturellen Vielfalt an biosynthetisierten Metaboliten sowie deren antimikrobieller Aktivität umfassend charakterisiert. Um das biosynthetische Potenzial auf der metabolischen Ebene zu untersuchen, wurde im Vorfeld eine spezifische [7.7]Paracyclophan-Analytik etabliert, die skalierbare Methoden für alle Aufarbeitungsschritte beinhaltet. Die Optimierung endete in einem validierten sowie arbeits- und zeitsparenden einstufigen Extraktions- und Aufreinigungsverfahren mittels eines Zweiphasensystems und anschließender LC-UV-Analyse, um biologische Proben reproduzierbar zu analysieren und enthaltene Carbamidocyclophane zu quantifizieren. Kultivierungsstudien zum Einfluss der Temperatur an metabolisch aktiven und defizienten Nostoc-sp.-CAVN10-Kulturen ergaben einen direkten Zusammenhang zwischen der Biomassezunahme und der Temperaturerhöhung. Im Gegensatz dazu zeigten die einzelnen Carbamidocyclophan-Gehalte ein eher differenzierteres Bild über die verschiedenen Wachstumsphasen und Temperaturen hinweg. Da nur eine geringe Korrelation zwischen der spezifischen Wachstumsrate und der spezifischen Carbamidocyclophan-Produktionsrate ermittelt werden konnte, ist eine Relevanz dieser Verbindungen für den primären Zellstoffwechsel nicht ersichtlich. Bei Kultivierungsexperimenten an Nostoc sp. CAVN2 hatte der Zusatz von Chlorid- oder Bromid-Ionen eine drastische Erhöhung der Basalrate und Strukturdiversität der [7.7]Paracyclophane zur Folge. Das gleichzeitige Vorhandensein beider Halogenide im Medium zeigte kompetitive Effekte, wobei Chlorid als Substrat für den Halogenierungsprozess favorisiert wurde. Mit Hilfe eigens entwickelter Kultivierungsprozedere und Separierungsstrategien konnten insgesamt 25 Verbindungen aus Stamm CAVN2 isoliert und strukturell aufgeklärt werden. Dabei bilden die Carbamidocyclophane H–U neue chlorierte, bromierte und nicht halogenierte Naturstoffe. Zusätzlich konnten aus Stamm Cylindrospermum stagnale PCC 7417 neben den bekannten Cylindrocyclophanen A, B und D die drei neuen Cylindrofridine A–C erhalten werden. Diese stellen den Cylindrocyclophanen strukturell eng verwandte lineare Mono- und Dialkylresorcinole dar. Die vergleichende Evaluierung der Bioaktivität von 30 Reinsubstanzen ergab, dass viele Verbindungen sehr starke antimikrobielle Aktivität gegen grampositive Bakterien zeigen – besonders gegen Antibiotika-resistente Kokken mit minimalen Hemmkonzentrationen von oftmals deutlich unter 1 µM. Dabei bedingten die verschiedenen Substituenten (Carbamoyl- und Acetoxy-Reste sowie Hydroxygruppen oder Halogene) z.T. signifikante Aktivitätsunterschiede. Die Zytotoxizität der [7.7]Paracyclophane ist vor allem an das Vorhandensein des Makrozyklus gebunden, da lineare Derivate (Cylindrofridine B/C) kaum biologisch aktiv waren. Eine Ausnahme stellt dabei das nicht zytotoxische, aber antimikrobiell aktive Cylindrocyclophan-D-Monomer Cylindrofridin A dar. Die phylogenetische Analyse der 16S-rDNA-Daten bestätigte die morphologisch-taxonomische Identifizierung der Stämme CAVN2 und CAVN10 als Cyanobakterien der Gattung Nostoc und ergab weiterhin, dass alle Carbamido- und Cylindrocyclophane produzierenden Nostoc-Stämme Bestandteil einer monophyletischen Gruppe sind, die phylogenetisch distinkt zu anderen [7.7]Paracyclophan-Produzenten ist. Des Weiteren konnten keine Nukleotidunterschiede zwischen Stamm CAVN2 und CAVN10 auf den untersuchten Markergen-Sequenzen festgestellt werden, was beide auf der phylogenetischen Ebene als identisch erscheinen lässt und sie somit nur metabolisch aufgrund der strukturellen Diversität und Quantität an [7.7]Paracyclophanen differenzierbar sind. Mit Hilfe von molekulargenetischen Analyseverfahren und bioinformatorischer Auswertung konnte in Stamm CAVN2 das Carbamidocyclophan-Biosynthesegencluster mit einer Gesamtgröße von ca. 26,9 kbp identifiziert werden. Dieses beinhaltet 13 offene Leserahmen (cabA-cabM), wobei das Gen cabL für eine putative Carbamoyltransferase codiert. Ein neuer Halogenase-Typ in Verbindung mit einer Tandem-ACP-Domänen-Struktur in der Typ I Polyketidsynthase CabD könnte für die Ausbildung halogenierter Derivate verantwortlich sein. Der Nachweis eines codierenden Bereichs mit Rieske-Domäne (cabM) lässt eine direkte oxidative intermolekulare Makrozyklisierung bei der Assemblierung vermuten.
  • Cyanobacteria are a promising source of structurally diverse and highly biologically active natural products for the development of new drug substances. The structural class of [7.7]paracyclophanes has so far only been found in filamentous cyanobacteria of the genera Nostoc and Cylindrospermum. Previous work showed that the carbamidocyclophanes are chemically and biologically interesting compounds. Within the scope of this thesis, especially the carbamidocyclophane-producing cyanobacteria Nostoc sp. CAVN2 and Nostoc sp. CAVN10 have been investigated extensively with particular reference to the structural diversity of biosynthesized metabolites as well as their antimicrobial activity. In order to study the biosynthetic potential at the metabolic level, a specific [7.7]paracyclophane analysis has been established in advance, which includes scalable methods for all processing steps. The optimization procedure culminated in a validated as well as work- and time-saving single-stage extraction and purification process using a two-phase system and subsequent LC-UV analysis for both the reproducible analysis of biological samples and the quantification of carbamidocyclophanes. Cultivation studies on the influence of temperature on metabolically active and deficient Nostoc-sp.-CAVN10 cultures showed a direct correlation between biomass growth and temperature increase. In contrast, the individual carbamidocyclophane contents showed a more differentiated outcome over the various growth phases and temperatures. Since only a small correlation between specific growth rate and specific carbamidocyclophane production rate could be determined, a biological relevance of these compounds for the primary metabolism is not apparent. Cultivation experiments on Nostoc sp. CAVN2 revealed that the addition of chloride or bromide ions caused a drastic increase in the basal rate and structural diversity of [7.7]paracyclophanes. The simultaneous presence of both halides in the medium showed competitive effects, with chloride being favored as a substrate for the halogenation process. By means of specially developed cultivation procedures and separation strategies, a total of 25 compounds could be isolated from strain CAVN2 and structurally elucidated. Among these derivatives, the carbamidocyclophanes H-U represent new chlorinated, brominated and non-halogenated natural products. In addition to the known cylindrocyclophanes A, B and D, the three novel cylindrofridins A–C could be obtained from strain Cylindrospermum stagnale PCC 7417. These compounds are cylindrocyclophane-related linear mono- and dialkylresorcinols. A comparative evaluation of the bioactivity of 30 pure substances revealed that many compounds exhibit very strong antimicrobial activity against Gram-positive bacteria – especially against antibiotic-resistant cocci with minimal inhibitory concentrations of often well below 1 µM. In this context, the various substituents (carbamate and acetoxy moieties, hydroxy groups or halogen atoms) attached to the [7.7]paracyclophane carbon skeleton partly caused significant differences in activity. The cytotoxicity of [7.7]paracyclophanes is mainly due to the presence of the macrocycle since linear derivatives (cylindrofridine B/C) were hardly biologically active. An outstanding exception is the non-cytotoxic but antimicrobially active cylindrocyclophane D monomer cylindrofridin A. The phylogenetic analysis of the 16S rDNA data confirmed the morphological and taxonomic identification of strains CAVN2 and CAVN10 as cyanobacteria of the genus Nostoc, and further revealed that all carbamidocyclophane- and cylindrocyclophane-producing Nostoc strains are part of a monophyletic group, which is phylogenetically distinct from other [7.7]paracyclophane producers. Furthermore, no nucleotide differences between strain CAVN2 and strain CAVN10 on the investigated marker gene sequences could be determined. Thus, both strains appear to be identical on the phylogenetic level and can be differentiated only metabolically due to the structural diversity and quantity of containing [7.7]paracyclophanes. Using molecular genetic methods and bioinformatics, the carbamidocyclophane biosynthetic gene cluster could be identified in strain CAVN2. It has a total size of approx. 26.9 kpb and comprises 13 open reading frames (cabA-cabM), whereby the gene cabL is encoding for a putative carbamoyltransferase. A novel type of halogenase coupled with a tandem ACP domain structure in the type I polyketide synthase CabD might be responsible for the formation of halogenated derivatives. Furthermore, the detection of a coding region with a Rieske domain (cabM) suggests a direct oxidative intermolecular macrocyclization during carbamidocyclophane assembly.

Download full text files

Export metadata

Additional Services

Share in Twitter Search Google Scholar
Metadaten
Author: Michael Preisitsch
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002635-3
Title Additional (English):[7.7]Paracyclophane-producing cyanobacteria as source of biologically active natural products
Advisor:Dr. Sabine Mundt
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2016/10/14
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2016/09/29
Release Date:2016/10/14
Tag:Alkylresorcinole, Carbamidocyclophane, Cylindrocyclophane, Cylindrospermum
Cylindrospermum, alkylresorcinols, carbamidocyclophanes, cylindrocyclophanes
GND Keyword:Cyanobakterien, MRSA, Nostoc, Paracyclophane
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Pharmazie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 540 Chemie
MSC-Classification:92-XX BIOLOGY AND OTHER NATURAL SCIENCES / 92Cxx Physiological, cellular and medical topics / 92C40 Biochemistry, molecular biology
92-XX BIOLOGY AND OTHER NATURAL SCIENCES / 92Exx Chemistry (For biochemistry, see 92C40) / 92E99 None of the above, but in this section
92-XX BIOLOGY AND OTHER NATURAL SCIENCES / 92Fxx Other natural sciences (should also be assigned at least one other classification number in this section) / 92F05 Other natural sciences (should also be assigned at least one other classification number in section 92)