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The role of uptake and efflux transporters in the pharmacokinetics of ß1-receptor blocker talinolol
(2016)
Introduction: The β1-adrenergic receptor antagonist talinolol is a probe drug for P-glycoprotein (P-gp). It is absorbed erratically and incompletely from the gastrointestinal tract. However, its pharmacokinetics might also be influenced by further uptake and efflux transporters as concluded from interaction studies with naringin and verapamil in human. Additionally, the transcellular transport through the different tissues, including enterocytes, hepatocytes and kidney tubular cells, is not completely understood so far. Therefore, we aimed to measure the affinity of talinolol to drug transporting proteins (OCT1-3, PEPT1, OCTN2, ASBT, NTCP, MRP 1-3 and P-gp as well as OATP 1B1, 1B3, 2B1 and 1A2) and some of their genetic variants known to be of pharmacokinetic relevance (OATP1A2 *2 and*3 as well as OATP2B1 V201M, R312Q and S486F). In a further step, we retrospectively evaluated the impact of clinically relevant genetic polymorphisms of transporters on the pharmacokinetics of talinolol in healthy subjects. Materials and Methods: Time and concentration-dependent uptake assays with [3H]-talinolol were performed either in stable transfected HEK293 or MDCKII cells expressing OATP1A2 *1, *2 and *3, OATP1B1, OATP1B3, OATP2B1 (and its genetic variants p.V201M, p.R312Q and p.S486F), NTCP, ASBT, PEPT1, OCTN2, OCT 1-3 and the respective vector control or in inside-out lipovesicles expressing the efflux transporters MRP1-3 and P-gp. Talinolol was quantified by liquid scintillation counting. The transport rates were then corrected by the transporter proteomics measured in the cellular membrane. Regarding the pharmacogenomic evaluation, it was carried out retrospectively in 39 healthy subjects who had participated in former pharmacokinetic studies with talinolol. This evaluation included a variety of transporter related genetic variants, known to be of a clinical meaning for their substrates. Results: Among the uptake transporters, talinolol was shown to be a substrate of OATP1B3 (Km= 153 ± 137 μmol/l; Vmax= 168 ± 30.3 μmol/mgxmin), OATP1B1 (Km= 301 ± 133 μmol/l; Vmax= 1135 ± 348 μmol/mgxmin), OATP2B1 (Km= 459 ± 260 μmol/l; Vmax= 4.32 ± 1.33 μmol/mgxmin), OATP1A2 (Km= 477 ± 158 μmol/l; Vmax= 0.61 ± 0.1 μmol/mgxmin) and NTCP (Km= 2560 ± 781 μmol/l; Vmax= 15944 ± 3741 μmol/mgxmin) but not a substrate of OCT1-3, OCTN2, PEPT1 or ASBT. When it comes to the efflux transporters, talinolol was transported by both P-gp (Km = 175 ± 206 mol/l; Vmax = 14 ± 10.8 nmol/mgxmin) and MRP3 (Km= 86.8 ± 62.8 μmol/l; Vmax= 133 ± 51.5 μmol/mgxmin) but not by MRP2. The pharmacogenomic analysis supported the in-vitro results, as it showed a significant decrease in talinolol absorption (AUC and Cmax) in subjects with the loss of function variant MRP3 211C>T and in those with a decreased P-gp function due to having less than 5 T-allels in the haplotype P-gp 1236-2677-3435-TTT. No significant changes were found associated with other transporters’ genetic variants. Conclusion: Our in-vitro results suggested the vectorial transport of talinolol through the enterocytes to consist mainly of apical OATP2B1 and P-gp and basolateral MRP3. Additionally in the hepatocytes, apical OATP1B1, OATP1B3 and NTCP seem to be involved as well. This vectorial transport was demonstrated in-vivo for the first time by our pharmacogenomic analysis, where talinolol absorption was significantly influenced by both P-gp and MRP3 genetic variants.
Trotz intensiver Forschungsarbeit stellt die kardiale Toxizität von Doxorubicin auch heute noch ein therapielimitierendes Problem in der chemotherapeutischen Behandlung dar und ist nur unzureichend verstanden. In früheren Studien konnte gezeigt werden, dass sowohl in vitro als auch in vivo lipidsenkende Medikamente, wie Statine oder Probucol, in Komedikation positive Auswirkungen auf diese Nebenwirkung besitzen. Der bereits 1985 erstmalig beschriebene Anstieg des Serumcholesterolsspiegels konnte darüberhinaus in eigenen Voruntersuchungen im akuten Doxorubicin-Mausmodell bestätigt werden. Gleichzeitig wurden erhöhte Spiegel oxigenierter Cholesterolderivate in Serum, Herz und Leber nachgewiesen. Vor diesem Hintergrund, wurde die Hypothese aufgestellt, dass Doxorubicin die Bildung von Oxysterolen begünstigt und somit Einfluss auf die Cholesterolhomöostase nimmt. Es ist bekannt, dass erhöhte Cholesterol- und Oxysterolspiegel die Elektrophysiologie, genauer die Kalziumhomöostase in Kardiomyozyten beeinträchtigen, was auf eine mögliche Bedeutung dieser Beobachtung für die Kardiotoxizität hinweist. In der vorliegenden Arbeit konnte diese Hypothese erhärtet werden, indem zunächst sowohl auf RNA- und Proteinebeneeine gesteigerte Expression der Cholesteroleffluxtransporter ABCA1 und ABCG1 in Kardiomyozyten aber auch eine erhöhte Aktivität gezeigt werden konnte. Ursächlich für diese Beobachtung konnte in der Folge eine verstärkte Aktivierung des nukleären Transkriptionsfaktors und Oxysterolliganden LXR unter Doxorubicinexposition identifiziert und durch die Koinkubation von Doxorubicin mit LXR-Agonisten und–Antagonist bestätigt werden. Bei der Charakterisierung verschiedener Oxysterole konnte zudem für 24(S) Hydroxy- und 7 Ketocholesterol ein dem Doxorubicin-vergleichbaren Effekt auf die Expression Karditoxizitäts-assoziierter Gene (wie Gata4, Edn1, Tgfb) festgestellt werden, insbesondere das 7-Ketocholesterol zeigte zudem auch eine ausgeprägte Toxizität im HL-1-Zellmodell. Vor diesem Hintergrund wurde ein Tierversuch durchgeführt, bei dem der Einfluss einer Vorbehandlung mit einem LXR-Agonisten zur Verminderung der zellulären Cholesterolkonzentration durch Aufregulation der genannten Effluxtransporter einen Einfluss auf die akute Doxorobicin-induzierte Kardiotoxizität besitzt. Drei Tage nach der Doxorubicingabezeigte sich dabei für die Ejektionsfraktion in den mit dem LXR-Agonisten vorbehandelten Tieren ein signifikant verbesserter Wert. Dieser Effekt konnte allerdings in der Folge nicht aufrechterhalten werden. Ein Grund hierfür könnte in der zu geringen Halbwertszeit des LXR Agonisten, da dieser mit der Doxorubicingabe abgesetzt wurde, liegen. Trotzallem weisen die Daten auf eine Kardioprotektion hin, so dass weitere Untersuchung in diesem Bereich angestrebt werden sollten.
Das Glioblastoma multiforme (GBM) ist der häufigste und zugleich aggressivste primär maligne Hirntumor des Erwachsenen. Trotz des multimodalen Therapieregimes (neurochirurgische Resektion und adjuvante Radiochemotherapie) beträgt die mediane Überlebenszeit der Patienten weniger als 15 Monate nach Diagnosestellung. Das aggressive biologische Verhalten dieses Tumors, insbesondere seine Therapieresistenz und hohe Rezidivneigung, werden zumindest partiell einer Subpopulation innerhalb der GBM-Zellen, den sog. GBM-Stammzellen, zugeschrieben. Es ist bislang nicht gelungen, GBM-Stammzellen präzise zu charakterisieren. Die Entdeckung von exklusiven und verlässlichen Markerproteinen könnte es ermöglichen, diese Zellen und damit die Ursprünge des Glioblastoms zielgerichtet zu bekämpfen. Gegenstand dieser Arbeit war deshalb die Untersuchung der Expression potenzieller Stammzell- und Differenzierungsmarker in humanem Glioblastomgewebe verglichen mit nicht-malignem Hirngewebe. Eine statistisch signifikant erhöhte Expression konnte für die Stammzellmarker Nestin, CD44 und MEF sowohl auf mRNA- als auch Proteinebene nachgewiesen werden, während CD95 vermindert exprimiert wurde. Dagegen ergaben sich für CD133 und ABCG2 keine Expressionsunterschiede. Unter den analysierten astrozytären Differenzierungsmarkern zeigte Sparc im Gegensatz zu GFAP signifikant erhöhte mRNA- und Proteinexpressionswerte. Eine Assoziation mit dem Überleben der Patienten und damit eine prognostische Relevanz konnte nur für CD95 und GFAP nachgewiesen werden, sodass sich insbesondere CD95 aufgrund seiner Tumorzell-relevanten Funktionen als neues Zielmolekül für eine targeted therapy eignen könnte. Des Weiteren erfolgte die Durchführung von in vitro-Experimenten zur Untersuchung des Einflusses einer pharmakologischen Pim1-Inhibition (mittels LY294002, Quercetagetin und TCS) auf die mRNA- und Proteinexpression von ausgewählten Stammzell- und Differenzierungsmarkern in den beiden humanen GBM-Zelllinien LN18 und U87MG. Dabei zeigte sich, dass die Expression von Nestin, MEF und CD133 signifikant herunterreguliert wird. Im Gegensatz dazu wurde der potentielle Stammzellmarker CD44 signifikant hochreguliert. Interessanterweise fand sich in beiden Zelllinien nach Applikation von TCS ein signifikanter Expressionsanstieg von GFAP auf Proteinebene. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass der Stammzellphänotyp durch eine Pim1-Inhibition verändert werden kann, was diese Kinase zu einem vielversprechenden Zielmolekül einer targeted therapy macht.
Thrombozyten sind von zentraler Bedeutung sowohl für die Blutstillung als auch für die Regulation von Entzündungsprozessen. Nach der Aktivierung setzen sie proinflammatorische Mediatoren wie Sphingosin-1-Phosphat (S1P) frei. Die spezifischen Mechanismen der S1P-Freisetzung aus Thrombozyten sind jedoch noch weitgehend unbekannt. In der vorliegenden Arbeit konnte anhand eines vesikulären Transportassays bestätigt werden, dass ein ATP-abhängiges Transportsystem für S1P in Thrombozytenmembranen vorliegt. Der ATP-abhängige Transport von fluoreszenzmarkiertem S1P (F-S1P) in inside-out-Membranvesikel von humanen Thrombozyten wurde durch das organische Anion MK571, einen Inhibitor von ABC-Transportern der Multidrug Resistance Protein (MRP)-Subfamilie, gesenkt. Anhand von Transportversuchen mit inside-out-Membranvesikeln von MRP4 (ABCC4)-überexprimierenden Sf9-Insektenzellen und MRP5 (ABCC5)-überexprimierenden V79-Fibroblasten konnten MRP4 und MRP5 als S1P-Transporter identifiziert werden. Die Untersuchung von MRP4-defizienten Mäusen ergab signifikante Abnahmen der S1P-Spiegel im plättchenreichen Plasma dieser Tiere. Die S1P-Spiegel der MRP5-defizienten Männchen glichen dem WT, während die Weibchen nahezu eine Verdopplung des S1P-Gehalts im plättchenarmen Plasma im Vergleich zum Wildtyp zeigten. Die Ergebnisse bei den genetisch veränderten Mäusen lassen vermuten, dass der Transporter MRP4 auch physiologisch an der S1P-Speicherung und -Freisetzung aus Thrombozyten beteiligt ist, während MRP5 die S1P-Plasmaspiegel eher unabhängig von den Thrombozyten zu beeinflussen scheint. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass der MRP4-vermittelte Transport von F-S1P durch Fluvastatin mit einer IC50 von 52 µM und Rosuvastatin mit einer IC50 von 32 µM gehemmt wird. Darauf aufbauend konnte mittels Massenspektrometrie (LC-MS/MS) nachgewiesen werden, dass die Vorinkubation mit Fluvastatin bzw. Rosuvastatin die endogene stimulierte S1P-Freisetzung aus humanen Thrombozyten ex vivo senkt. Diese inhibitorische Wirkung der Statine auf den Transport des proinflammatorischen S1P stellt einen neuen möglichen Mechanismus dar, mit dem die Statine pleiotrope entzündungshemmende Effekte ausüben können. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass MRP4 als S1P-Transporter identifiziert wurde und Statine den MRP4-vermittelten Transport beeinträchtigen.
Die Antibiotikatherapie Rhodococcus equi-bedingter Pneumonien in Fohlen sollte grundsätzlich in Abhängigkeit vom Allgemeinzustand, jedoch erst ab einem Abszess-Score ≥ 10 cm gemäß der wait-and-see-Strategie begonnen werden, um die verwendete Antibiotikamenge zu reduzieren. Die vorliegende Arbeit hat gezeigt, dass die lange Zeit etablierte Wirkstoff-Kombination von Rifampicin und Clarithromycin aus pharmakokinetischer Sicht für die Therapie ungeeignet ist, unabhängig davon ob die Wirkstoffe gleichzeitig oder, wie von der FDA bei hohem Interaktionspotential zweier Wirkstoffe gefordert, zeitversetzt appliziert werden. In Kombination mit Rifampicin kommt es, aufgrund der PXR-vermittelten Erhöhung der Expression von P-gp und CYP3A4, zu einer dramatischen Abnahme der Bioverfügbarkeit von Clarithromycin, was zu Cmax-Konzentrationen unterhalb der MIC90 für R. equi im systemischen Kompartiment führt. Im Gegensatz dazu konnte für die Kombination von Rifampicin und Gamithromycin, einem bisher ausschließlich bei Schweinen und Rindern zur Behandlung von Atemwegserkrankungen eingesetzten Makrolidantibiotikum, eine deutliche AUC-Erhöhung beobachtet werden. Eine mögliche Erklärung ist, dass Gamithromycin, anders als Clarithromycin, kein Substrat von P-gp und CYP3A4 ist und damit Efflux und Metabolismus unter Rifampicin-Gabe nicht induziert sind. Zudem wird Gamithromycin, intravenös appliziert, sodass die Interaktion zwischen Makrolidantibiotikum und intestinalem P-gp von Beginn an unterbunden wird. In vitro wurde mit Hilfe stabil transfizierter Zellen ein Vertreter der OATP-Familie (hOATP2B1) als Transporter für Gamithromycin identifiziert werden. Auf Grund dieser Ergebnisse liegt es nahe, dass der OATP-Inhibitor Rifampicin die Aufnahme und den Efflux von Gamithromycin in und aus Hepatozyten hemmt. Für diese Theorie spricht die in der in vivo-Studie beobachtete reduzierte Clearance sowie verlängerte MRT im Fall der Kombinationstherapie mit Rifampicin. Die Applikation von Gamithromycin sollte nach Herstellerangaben einmal wöchentlich erfolgen. In diesem Fall sinken die Konzentrationen des Makrolidantibiotikums nach intravenöser Gabe jedoch innerhalb kürzester Zeit (< 1 h) unter die MIC90 von R. equi. Die MIC90 wird also > 99 % des Dosierungsintervalls von 168 h unterschritten. Deshalb erscheint es sinnvoll, ein verändertes Therapieschema mit einer höheren Initialdosis und einem reduziertem Dosierungsintervall (z.B. 48 h oder 72 h) in zukünftigen Studien zu prüfen. Die Einführung von PK/PD-Indizes lässt eine theoretische Einschätzung der Effizienz von Antibiotika zu. Es konnte gezeigt werden, dass Rifampicin die definierten Grenzwerte für T > MIC90 für das systemische Kompartiment selbst dann erfüllt, wenn die Dosis von 2 × 10 mg/kg/d bzw. 1 × 20 mg/kg/d auf 1 × 10 mg/kg/d reduziert wird. Da eine Konzentration > 4 × MIC90 bei zeitabhängig wirkenden Antibiotika nachweislich keinen zusätzlichen Effekt hat und hohe Antibiotika-Konzentrationen zusätzlich die Selektion resistenter Bakterienstämme begünstigen, wird aus pharmakokinetischer Sicht die Rifampicin-Dosisreduktion auf 1 × 10 mg/kg/d empfohlen. Das intrazelluläre Bakterium R. equi stellt das Antibiotikum allerdings vor besondere Herausforderungen (u.a. hohes Verteilungsvolumen, Membranpermeabilität etc.). Aus diesem Grund sind die etablierten PK/PD-Indizes, welche ausschließlich die Wirkstoff-Konzentrationen im systemischen Kompartiment berücksichtigen, ungeeignet zur Beschreibung der Wirksamkeit. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher, in Anlehnung an bestehende Indizes, eigene Surrogat-Parameter entwickelt, die sich zur theoretischen Einschätzung der Wirksamkeit besser eignen: CELF/MIC90 und CBALC/MIC90. Diese Indizes sind für alle untersuchten Antibiotika stets deutlich > 4, mit Ausnahme der einmal täglichen RIF-Gabe von 10 mg/kg (hier: CELF/MIC90 = 2, CBALC/MIC90 = 3). Die Parameter T > MIC90, ELF bzw. T > MIC90, BALC konnten in dieser Arbeit nicht eindeutig bestimmt werden, da die BAL aus praktischen Gründen ausschließlich nach 12 oder 24 h durchgeführt wurde. Dieser Zeitpunkt entspricht für Clarithromycin bzw. Rifampicin dem Ende des Dosierungsintervalls. Da die gemessenen Konzentrationen im ELF und den BALC stets > MIC90 sind, kann T > MIC90 (ELF) bzw. T > MIC90 (BALC) mit 100 % angegeben werden. Im Fall von Gamithromycin wurde die BAL ebenfalls nach 24 h durchgeführt, wobei die Konzentration in den BALC ebenfalls deutlich oberhalb der MIC90 für R. equi liegt. Hier muss allerdings beachtet werden, dass das Dosierungsintervall von Gamithromycin 168 h beträgt und damit die eigentlichen Talspiegel in der vorliegenden Arbeit nicht erfasst wurden. Die Reduktion des Dosierungsintervalls könnte, neben der Erhöhung der systemischen Antibiotika-Konzentrationen, ein Absinken der Konzentrationen im Lungenkompartiment in den „Sub-MIC-Bereich“ verhindern.
Die Physiologie des Magens mit den unterschiedlichen Gegebenheiten im proximalen und distalen Magen stellt einen relevanten Einflussfaktor auf die Pharmakokinetik von oral applizierten Wirkstoffen dar. Innerhalb der peroralen Pharmakotherapie nimmt die Sondenapplikation von Arzneimitteln dabei eine Sonderrolle ein, da je nach Lokalisation des Sondenendes die Applikation tendenziell eher in proximale oder distale Anteile des Magens erfolgt. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Pharmakokinetik bei Sondenapplikation hinsichtlich der Variablen Sondenlage‚ Nahrungsaufnahme und Nüchternmotilität. Hierzu wurde in einer kontrollierten, randomisierten, drei-armigen Cross-Over-Studie an zwölf gesunden, männlichen Probanden 540 mg einer Paracetamol-Suspension über einen Zeitraum von sechs Stunden jeweils in den distalen und proximalen Magen infundiert. Unsere Ergebnisse konnten zeigen, dass die Bedingungen „proximale Applikation“ und „Nahrungsaufnahme“ die Wahrscheinlichkeit einer Retention im proximalen Magen erhöht. Merkmale hierfür waren größere Abweichungen der Invasionskinetik von der Applikationsrate im Sinne einer verspäteten Anflutung, vermehrt Schwankungen der Invasionsrate und mehr Nachflutungen in der Eliminationsphase. Umgekehrt ging die distale Applikation mit einer größeren Kontinuität der Invasion einher. Hinsichtlich der Invasionskinetik häuften sich bei Nahrungskarenz und proximaler Sondenlage Merkmale, die für einen Einfluss der interdigestiven Motilität auf die Pharmakokinetik sprechen. Limitiert wurde die Aussagekraft zum Einfluss der Nüchternmotilität durch das Fehlen einer simultanen Aufzeichnung der Motilität, zum Beispiel mittels elektrischer Impedanzmessung. Die angewandte Methodik mit kontinuierlicher Infusion der Prüfsubstanz, regelmäßigen Messungen der Serumkonzentration und Berechnung der Invasionskinetik mittels schneller Fouriertransformation erwies sich zur Untersuchung der Fragestellung als gut geeignet und kann als Grundlage zukünftiger Forschungen dienen.
Das MRP4 ist ein Mitglied der ABCC-Subfamilie der ATP-binding cassette transporters. Es transportiert eine große Vielfalt an endogenen und xenobiotischen Verbindungen aus der Zelle. Des Weiteren vermittelt MRP4 den Transport von Signalmolekülen wie z.B. zyklische Nukleotide. Das einzigartige Substratspektrum, die Regulation und die zelluläre Lokalisation des MRP4 stehen in Verbindung mit seiner möglichen Funktion beim Zell-Schutz und dem zellulären Signaling. MRP4 ist abhängig vom Zelltyp entweder in der basolateralen (Prostata, Leber) oder apikalen (Nieren, Kapillaren des Gehirns) Membran von polarisierten Zellen lokalisiert. Des Weiteren wird MRP4 auch in Thrombozyten und Erythrozyten exprimiert. Protein-Protein-Interaktionen können die Funktion, Lokalisation und Expression von Transportern in der Plasmamembran beeinflussen. Viele Interaktionen beinhalten die stabile Assoziation von Proteinen innerhalb von Multi-Untereinheitskomplexen sowie die vorübergehende Assoziation von regulatorischen Proteinen. MRP4 weist u.a. ein sogenanntes PDZ-Bindemotiv auf, welches durch die Aminosäuren ETAL charakterisiert wird und die Interaktion mit PDZ-Adaptorproteinen vermitteln kann. Speziell in Thrombozyten ist MRP4 neben der Plasmamembran auch in den δ-Granula lokalisiert. Hier könnten interagierende Proteine eine wichtige Rolle spielen. Änderungen in diesen Proteinen könnten eine Ursache für Störungen der Thrombozytenfunktion mit einer Fehllokalisation von MRP4 sein. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung möglicher Interaktionspartner von MRP4, insbesondere in Thrombozyten. Dafür wurde ein Fusionsprotein aus einem c-terminalen Fragment (117 Aminosäuren) des MRP4 mit der Glutathion-S-Transferase (GST) generiert. Nach Aufreinigung des Fusionsproteins (GST-MRP4) mittels Glutathion-Sepharose wurden pull-down-Experimente mit Thrombozytenlysat durchgeführt. Mittels Western Blot und LC-MS/MS-Analyse konnten als mögliche Interaktionspartner das EBP50/NHERF1, das PSD95, SNX27, die β-Untereinheit des AP3B1 und das HSP90 identifiziert werden. Durch indirekte Immunfluoreszenz konnte außerdem eine partielle Ko-Lokalisation der genannten möglichen Interaktionspartner und MRP4 in den Thrombozyten dargestellt werden. Ein weiterer Ansatz zur Untersuchung der Protein-Interaktion war die Ko-Präzipitation des MRP4 und der daran gebundenen Proteine mittels eines anti-MRP4-Antikörpers, der an magnetische beads gebunden war. Mithilfe der Ko-Immunpräzipitation konnten SNX27, HSP90, AP3B1, EBP50 und PSD95 unterschiedlich stark ko-präzipitiert werden. Es wurde untersucht, inwiefern das PDZ-Bindemotiv des MRP4 für die Interaktion der detektierten Interaktionsproteine essentiell ist. Dafür wurde ein GST-MRP4-Konstrukt ohne das C-terminale PDZ-Motiv generiert. Damit konnte gezeigt werden, dass das PDZ-Bindemotiv nur für die Interaktion mit SNX27, EBP50 und PSD95 notwendig ist, während die Bindung von AP3B1 und HSP90 unabhängig davon erfolgte. Nachdem auf Proteinebene mit verschiedenen Versuchen dargestellt werden konnte, welche Adaptorproteine mit dem MRP4 interagieren, sollte im letzten Abschnitt auf funktioneller Ebene gezeigt werden, inwiefern sich die Lokalisation des MRP4 verändert, sofern das Bindemotiv des MRP4 nicht mehr vorhanden ist bzw. die Adaptorproteine herunterreguliert werden. In Bezug auf das Herunterregulieren der Adaptorproteine wurde die megakaryoblastische Leukämie-Zelllinie M07e als Modell für Thrombozyten-Vorläuferzellen verwendet. Des Weiteren lag das Interesse bei den Interaktionsproteinen AP3, PSD95 und SNX27. Nach Transfektion der M07e-Zellen mit der entsprechenden siRNA und der sich anschließenden Immunfluoreszenz konnte gezeigt werden, dass die Ko-Lokalisation des MRP4 mit den Adaptorproteinen nach knock-down verringert und die Plasmamembran-Lokalisation von MRP4 signifikant gesteigert war. Umgekehrt sollte die Überexpression dieser Adaptorproteine die Plasmamembran-Lokalisation verringern. Dies wurde exemplarisch für SNX27 in MDCK-Zellen untersucht. Dabei sollte auch nochmals die Rolle des PDZ-Bindungsmotivs für die MRP4-Lokalisation gezeigt werden. Dafür wurden die Fluoreszenz-markierten Fusionsproteine CFP-MRP4, SNX27-YFP und das CFP-MRP4(-PDZ) synthetisiert, in MDCK-Zellen transfiziert und ihre Lokalisation mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Es zeigte sich, dass nach Ko-Transfektion des CFP-MRP4 mit SNX27-YFP das MRP4 hauptsächlich im Zell-Inneren lokalisiert war. Außerdem wurde verdeutlicht, dass das PDZ-Bindemotiv für die Internalisierung des MRP4 in das Innere der Zelle durch das Interaktionsprotein SNX27 essentiell ist. Zusammenfassend liefert diese Arbeit wichtige grundlegende Erkenntnisse zu möglichen Protein-Interaktionen von MRP4 und deren Einfluss auf die Lokalisation des Transporters. Deren mögliche physiologische und pathophysiologische Rolle für die MRP4-Funktion in Thrombozyten sollte in weiterführenden Studien näher untersucht werden.
Der Nukleäre Rezeptor SHP1 ist ein zentrales Stellglied zahlreicher biologischer Prozesse. So reguliert SHP1 über direkte Protein-Protein-Interaktion mit Nukleären Rezeptoren Stoffwechselwege, wie den Gallensäure-, Cholesterin- und Lipidmetabolismus sowie die Glucosehomöostase und den Arzneimittelstoffwechsel. Erweiternd konnte kürzlich ein tumorsupprimierender Effekt des SHP1 gezeigt werden. So wurde die Entwicklung eines Hepatozellulären Karzinoms im Mausmodell in Abwesenheit des SHP1 beschrieben. Es ist bekannt, dass SHP1 nicht nur in hepatischem Gewebe, sondern auch in Lunge, Herz, Milz, Dünndarm, Pankreas, Niere, Nebenniere und Hirn exprimiert ist. In einer orientierenden Expressionsanalyse konnten wir eine verminderte SHP1 Expression in Tumorentitäten der Organe Niere, Lunge und Magen zeigen. Diese Ergebnisse konnten in den Proben einer Kohorte von an einem klarzelligen Nierenzellkarzinom erkrankten Patienten verifiziert werden. Es zeigte sich eine signifikant verminderte SHP1 Expression im klarzelligen Nierenzellkarzinom (RCC) im Vergleich zu Nierengewebe. Nachfolgend konnten wir mittels adenoviral vermittelter Überexpression des SHP1 in einem Zellmodell des RCC einen antiproliferativen Effekt des SHP1 im RCC zeigen. Bisher wurde die Vermittlung dieser antiproliferativen Komponente über eine Hemmung des CyclinD1 durch SHP1 vermutet. Zwar konnten wir im Einklang hiermit eine verminderte CyclinD1 Expression im RCC gegenüber Niere detektieren, nach Überexpression des SHP1 zeigte sich jedoch keine Suppression des CyclinD1, so dass davon auszugehen ist, dass die antiproliferative Wirkung des SHP1 im RCC über andere Zielstrukturen vermittelt wird. Da sich das RCC durch eine hohe Chemotherapieresistenz auszeichnet und SHP1 in den Arzneimittelstoffwechsel involviert ist, untersuchten wir den Einfluss des SHP1 auf die Chemosensitivität des RCC. Hier konnten wir zunächst keinen Einfluss des SHP1 auf die Viabilität des zellulären Modells des RCC durch die Substanzen Vinblastin, Temsirolimus und Sunitinib zeigen. Dennoch ist ein Einfluss des SHP1 auf die Proliferationshemmung durch diese Substanzen nicht auszuschließen. Abschließend untersuchten wir Ursachen für die verminderte SHP1 Expression im RCC. Hier zeigte sich, dass sowohl eine verminderte Expression von Aktivatoren des SHP1 als auch genetischen Varianten in der Promotorregion des SHP1 zunächst nicht ursächlich für die Minderexpression im RCC zu sein scheinen. Zusammenfassend konnten wir den Nukleären Rezeptor SHP1 als Tumorsuppressorgen des klarzelligen Nierenzellkarzinoms, dessen Pathogenese nach dem heutigen Wissensstand nicht geklärt ist, identifizieren. Basierend auf der antiproliferativen Wirkung könnte der SHP1 zukünftig ein Zielmolekül einer pharmakologischen Therapie des RCC darstellen.
Die bisherige pharmakologische Therapie von Opioid-induzierter Obstipation in der Schmerztherapie ist limitiert. Opioidrezeptorantagonisten könnten hier Abhilfe schaffen, in dem sie kausal in die Problematik eingreifen und somit zu einer besseren Lebensqualität bei vielen schmerzgeplagten Patienten führen. In klinischen Studien konnte eine Reduktion von intestinalen Transitzeiten nach subkutaner Methylnaltrexon-Gabe (MNTX) beobachtet werden. Auch orale Applikationsformen sowohl von MNTX als auch von Naloxon (NLX) stellten sich teilweise als wirksam dar. Daher war es das Ziel dieser Dissertation die Wirksamkeit hinsichtlich der Prävention einer Opioid-induzierten Obstipation von subkutaner und oraler Applikation von MNTX nach einmaliger Gabe miteinander zu vergleichen, sowie nach wiederholten Gaben die daraus resultierende effektivste Darreichungsform dem retardiert-freisetzenden NLX gegenüberzustellen. Dazu führten wir zwei kontrollierte, randomisierte, doppelblinde klinische Studien in gesunden Probanden durch. Die Obstipation wurde mit Loperamid (LOP) induziert. Die orozökale Transitzeit (OCT) und die Kolon-Transitzeit (CTT) wurden mit Hilfe von Sulfasalazin/ Sulfapyridin und röntgendichten Markern gemessen. Durch die LC-MS/MS-Methode konnten die Wirkstoffe bzw. deren Metaboliten in den Körperflüssigkeiten ermittelt werden und nachfolgend pharmakokinetische Parameter erhoben werden. In der single-dose-Studie konnten wir zeigen, dass retardiert freisetzendes MNTX (MNTX-ER) signifikant die LOP-induzierte Verzögerung im Intestinaltrakt antagonisiert. Subkutanes Methylnaltrexon (MNTX-SC) und schnell freisetzendes Methylnaltrexon (MNTX-IR) hatten keinen signifikanten Einfluss auf die OCT, CTT oder Gesamt-Darm-Transitzeit (WGT). (Publikation 1) Nach der mehrmaligen Applikation von MNTX-ER bzw. NLX-ER in der multiple-dose-Studie Studie konnte NLX-ER eine signifikante Reduktion der durch LOP verlängerten WGT herbeiführen, während MNTX-ER keinen nennenswerten Effekt erzielte. LOP verursachte nur kurzzeitig eine Erhöhung der Darmtransitzeiten. Es erfolgte nach der zweiten Applikation ein Gewöhnungseffekt. (Publikation 2) Aus diesem Grund erscheint LOP nicht geeignet eine anhaltende Obstipation zu induzieren. Die Toleranzentwicklung und auch die Entstehung der Obstipation bei Opioidtherapie lassen noch viele Fragen offen. Weitere Studien sowohl auf zellulärer Ebene als auch in der klinischen Anwendung werden folgen müssen um in diese komplexe Thematik mehr Licht zu bringen.
Trotz intensivster Forschungen in den letzten Jahrzehnten konnte die unzureichende Reendothelialisierung implantierter Drug-eluting Stents (DES) bisher nicht effektiv verhindert werden. Aktuelle DES-Konzepte verfolgen das Ziel einer lokalen Inhibition der frühen Muskelzellproliferation durch den Einsatz hochwirksamer proliferationsinhibierender Wirkstoffe wie Sirolimus und Paclitaxel. Hierdurch werden jedoch auch die Endothelzellen stark in ihrer Proliferation eingeschränkt, was in Folge zu einer stark verzögerten Reendothelialisierung des Stents führt und wiederum die Gefahr von Komplikationen deutlich erhöht. Eine Möglichkeit, dem vorzubeugen, wäre es die proliferationsinhibierende Wirkung zellspezifisch auf die Muskelzellen zu vermitteln. Da die Wirksamkeit einer Substanz in der Regel abhängig von der erreichten intrazellulären Konzentration ist, bietet die differenzielle Expression von Transportproteinen eine interessante und elegante Möglichkeit, eine solche differenzielle Wirkung von Arzneistoffen zu erzielen. In der vorliegenden Arbeit konnten die Transporterexpressionsprofile von glatten Muskelzellen und Endothelzellen bestimmt werden. Bei einem Vergleich dieser Profile konnte für die Gruppe der organischen Kationentransporter (OCTs) eine signifikant erhöhte Expression von OCT1, OCT2 und OCT3 in den glatten Muskelzellen nachgewiesen werden, was zu der Hypothese führte, dass Substanzen die ein Substrat der OCTs darstellen, stärkere Effekte in glatten Muskelzellen hervorrufen sollten. Als erste Bestätigung dieser Hypothese konnte die signifikant erhöhte Akkumulation der kationischen Modelsubstrate MPP+ und TEA in Muskelzellen nachgewiesen werden. Im weiteren Verlauf der Arbeiten konnte ebenfalls für die mit den OCTs interagierenden Platinverbindungen Cisplatin und Oxaliplatin eine differenzielle Wirkung auf Endothel- und Muskelzellen nachgewiesen werden. In diesem Zusammenhang wurden OCT1 und OCT2 überexprimierende MDCKII-Zellsysteme etabliert und charakterisiert, die eine Zuordnung der beobachteten Effekte zu den einzelnen OCT-Vertretern ermöglichen sollten. An diesen Zelllinien und einer bereits vorhanden OCT3-überexprimierenden Zelllinie, konnte die spezifische Interaktion von Cisplatin mit OCT2 sowie die Interaktion von Oxaliplatin mit OCT1, OCT2 und OCT3 nachgewiesen werden. Bei Versuchen mit dem OCT1-Substrat Paclitaxel konnte ebenfalls eine differenzielle Wirkung auf Muskel- und Endothelzellen nachgewiesen werden. Für Paclitaxel konnte in diesem Zusammenhang auch zum ersten Mal eine direkte Aufnahme von [³H]-Paclitaxel über OCT1 und zusätzlich über OCT3 nachgewiesen werden, was bisher in der Literatur nicht beschrieben wurde. Einen weiteren Punkt dieser Arbeit stellt die Entwicklung und Etablierung eines adenoviralen Drug-Delivery-Systems dar, durch welches ein selektives „Drug-Loading“ ausgewählter Zielzellen bewerkstelligt werden kann. Dieses System basiert auf einer adenoviral vermittelten Expression des organischen Kationentransporters OCT1 unter der Kontrolle des muskelzellspezifischen SM22-Promotors. Durch dieses System war es in ersten Versuchen möglich, die Wirkung von Paclitaxel in infizierten Zellen muskelzellspezifisch zu erhöhen. Gleichzeitig wurden infizierte Endothelzellen jedoch nicht von einer erhöhten Paclitaxelaufnahme beeinflusst, wodurch die Funktionsfähigkeit dieses Systems belegt werden konnte.