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Beeinflussung der Wundheilung von respiratorischen Epithelzellen in vitro durch Roxithromycin
(2023)
In der vorliegenden Arbeit sollte der Einfluss des Makrolid-Antibiotikums Roxithromycin auf die frühe Phase der postoperativen Wundheilung am Zellkulturmodell untersucht werden. Gründe für den Einsatz des Medikamentes sind abseits der bekannten bakterios-tatischen Wirkung insbesondere die in der Langzeitanwendung beschriebenen immunmodulatorischen Effekte. Es sollte untersucht werden, ob diese bereits in der Akutsituation zu einem Benefit in der Wundheilung im HNO-Bereich führen, da Wundhei-lung hier sekundär verläuft und Wundheilungsstörungen durch Fibrosierungen und Re- Stenosen nicht selten zu einer operativen Korrektur zwingen.
Gewählt wurden S9-Zellen als Modell für respiratorisches Epithel, welche einer standardi-sierten Wundsetzung durch Stanzung unterzogen wurden. Mittels AlamarBlue-Assay wurden zytotoxische Medikamentenkonzentrationen herausgearbeitet und im Folgenden durch Konzentrationsfindungsversuche über 120 Stunden mit kombinierter Wundsetzung bestätigt. Im Vergleich zur Kontrollgruppe beschleunigt Roxithromycin in Konzentrationen von 10 µg/ml, 20 µg/ml und 40 µg/ml eher die Wundheilung, während Konzentrationen von 80 µg/ml und 160 µg/ml zu einer signifikanten (p ≤ 0.01 bzw. p ≤ 0.05) Hemmung der Wundheilung führen. Die Effekte waren jeweils über die ganze Beobachtungsdauer und im Ausmaß zunehmend nachweisbar. Roxithromycin in einer Konzentration von 160 μg/ml konnte die Zellproliferation 96 und 120 h nach Wundsetzung so stark hemmen, dass die residuale Wundfläche sogar anstieg.
In einem Validierungsansatz konnte zudem herausgearbeitet werden, dass die Wundsetzung konsequenterweise von nur einer/m Experimentierenden erfolgen sollte, um ein re-produzierbares Ergebnis zu erhalten, während sich kein Unterschied in der Auswertung der Wundflächen durch verschiedene Personen zeigte.
Zum Verständnis der molekularbiologischen Effekte des Medikamentes auf Epithelzellen wurden unter Berücksichtigung der in der Literatur beschriebenen maximalen Serumkonzentration bei systemischer Anwendung von Roxithromycin (7,28 ± 1,85 mg/l), fehlenden Hinweisen auf einen zytotoxischen Effekt sowie tendenziell beschleunigter Wundheilung nachfolgend 2D–DIGE-Experimente gekoppelt mit massenspektrometrischen Proteinidentifikationen für die Roxithromycinkonzentration von 10 µg/ml durchgeführt. Es ergaben sich Hinweise auf eine Förderung des Zellwachstums durch Beeinflussung des Polyaminmetabolismus über Induktion der Spermidinsynthase und darüber hinaus Spermidin-abhängige Modifikation des Translationsfaktors EIF5A. Des Weiteren wurde eine Nrf2-assoziierte Antwort auf oxidativen Streß bereits bei niedriger Roxithromycin- Konzentration von 10 µg/ml als protektiver Faktor ermittelt. Durch quantitative LC-MS/MS-Analysen wurde dieser Effekt ebenso für Konzentrationen von 20 und 40 µg/ml Roxithromycin bestätigt. Der weitläufig dokumentierte konzentrationsabhängige zytotoxische Effekt des Medikamentes bei höheren Konzentrationen konnte auch in dieser Arbeit gezeigt werden. Während apoptoseauslösende Proteine in der Konzentration von 10 µg/ml nicht nachgewiesen werden konnten, gelang in höheren Roxithromycin-Konzentrationen eine Darstellung von regulierten Proteinen des intrinsischen und extrinsischen Apoptoseweges, bis hin zur bereits mikroskopisch erfassbaren Zelldepletion bei Konzentrationen von 80 und 160 µg/ml. Insbesondere bei der Konzentration von 20 µg/ml fanden sich Hinweie, dass eine Regulation über den ERK1/2-Pathway stattfindet, welcher umfangreiche Funktionen wie Zytokinfreisetzung, Zellmigration, Zellproliferation und auch Zelltod moderiert.
Die Behandlung mit Roxithromycin führt in niedriger Konzentration (10 µg/ml) tendenziell zu einer beschleunigten Wundheilung ohne Auftreten zytotoxischer Effekte. Grundlage könnte die Aktivierung von Translationsfaktoren (EIF5A) und Protektion vor den Schäden durch oxidativen Streß sein. Damit stellt diese Therapie eine Option in der frühen postoperativen Situation im HNO-Bereich dar, welche allerdings weiterer Untersuchung z. B. durch Testung an Fibroblasten bedarf. Attraktiver erscheint das Outcome bei einer Medikamentenkonzentration von 20 µg/ml, da die epitheliale Wundheilung signifikant schneller abläuft und somit zu einem schnelleren Wundverschluß führt. Die molekularbiologischen Hinweise auf Induktion der Apoptose werden bei dieser Konzentration offenbar noch durch protektive Mechanismen über Beeinflussung der Zellmigration, Neutralisierung von Schäden durch oxidativen Streß und Eingriff in den ERK-Pathway aufgefangen, was bei höheren Roxithromycinkonzentrationen nicht mehr gelingt und in einer Zelldepletion mündet. Daher bietet sich für die Konzentration von 20 µg/ml insbesondere die topische Applikation als Salbenstrang oder Nasenspray an, um die positiven Effekte zu nutzen und die Limitation durch vorheriges Erreichen der maximalen Serumkonzentration zu umgehen. Empfehlenswert ist die Untersuchung des Medikamentes in weiteren Zell-reihen und in vivo da Wundheilung ein multimodaler Prozeß ist. Eine topische Applikation von ggf. höheren lokalen Konzentrationen scheint hier keinen zusätzlichen Nutzen darzustellen.
Mass spectrometry-based Proteome analysis of porcine cells infected with African swine fever virus
(2023)
ASFV, a highly contagious, pathogenic and lethal pathogen of swine, poses a major threat to domestic and wild suids worldwide as neither vaccines nor treatments are available. Compared to other well-characterized similarly complex viruses like herpesviruses or adenoviruses, the understanding of ASFV biology is poor.
To improve the understanding of ASFV biology, following the establishment of a robust protocol for the isolation of primary monocyte-derived porcine macrophages (moMΦ) and their infection with ASFV for mass spectrometry (MS)-based proteome analysis was performed.
Under both conditions, naïve and infected, the isolated cells showed cell type-specific characteristics like phagocytosis and antigen presentation and protein expression patterns, including the expression of swine leucocyte antigens and CD markers. Furthermore, moMΦ could be reproducibly infected with ASFV isolates of different genotypes and pathogenicity.
The ASFV protein expression patterns in moMΦ correlate well with those observed in established cell lines at transcript and protein level. The expression of 27 ASFV proteins was confirmed at the protein level. Among them, 9 members of multi-gene families (MGF) and 12 novel open reading frames (nORFs) were recently predicted based on transcription start site mapping.
The direct comparison of closely related ASFV genotype II isolates revealed no virulence-associated protein expression patterns beyond those expected based on the genome sequences of the isolates.
Using different MS quantification strategies, it was shown that ASFV affects both static protein expression levels and protein synthesis. These changes in protein expression impact proteins and pathways known to be targeted by ASFV, including CD-markers, ER-stress and cell death pathways, and cellular antiviral responses. Beyond these observations that further validated the moMΦ infection model, novel effects of the ASFV infection on the cellular proteome were noticed.
These effects include the decreased expression levels of cathepsins, especially cathepsins D (CTSD), H (CTSH) and L (CTSL) as well as the transient activation of MAPK14/p38 prior to its strong downregulation. In addition to MAPK14/p38 further members of the MAPK14/p38 signaling pathway, like MAPKAPK2, were affected by ASFV infection.
As these modulations of the cellular proteome would in general result in decreased pro-inflammatory responses, it did stand out that the synthesis of interferon-response related genes including MX1 and ISG15 evaded the ASFV-induced global reduction of protein synthesis. In contrast, the synthesis of genes involved in RNA processing and splicing was significantly impaired. In total, the regulations of individual host proteins assessed in the context of the whole cellular proteome integrate well with each other and other cellular responses to ASFV infection and may help to improve the understanding of host-virus interactions.
Overall, this thesis provides novel insights into the expression of ASFV-encoded ORFs of different isolates and the host response to ASFV infection. It points out that the current knowledge of the ASFV coding capacity, temporal protein expression patterns, protein functionality, post-translational modifications and host interactions is still sketchy as many aspects of ASFV replication have yet to be understood. The established moMΦ-model to study ASFV infections in vitro provides a powerful tool for future applications to increase the understanding of ASFV biology.
Hintergrundinformationen: Bakterien gehören zu den ältesten Lebensformen und sind ein elementarer Bestandteil aller ökologischen Lebensräume auf der Erde. Der Mensch als Holobiont ist ein eigenständiges Ökosystem mit einer Vielzahl von ökologischen Nischen und einer großen bakteriellen Vielfalt. Durch innere oder äußere Einflüsse kann es zu Veränderungen der Umweltbedingungen kommen, die eine veränderte Zusammensetzung des Mikrobioms zur Folge haben. Eine solche Dysbiose wirkt sich auf den Gesundheitszustand des Menschen aus und kann zu schweren Krankheiten führen. Das orale Mikrobiom gehört mit zu den komplexesten Mikrobiomen des Menschen. Es bildet eine natürliche Barriere gegen Krankheitserreger und beugt somit u.a. lokalen Krankheiten wie Karies oder Parodontitis vor. Die Metaproteomik ermöglicht es, die exprimierten Proteine des Mikrobioms und deren Interaktion mit dem Wirt zu untersuchen. Diese Technologie überwindet somit die Beschränkung auf Laborkulturen und ermöglicht die Untersuchung des Mikrobioms direkt in seinem natürlichen Lebensraum. Die Metaproteomik bietet eine Reihe von Instrumenten zur Vertiefung des Verständnisses des oralen Mikrobioms hinsichtlich des Gesundheitszustandes des Menschen.
Ziele: Ein Ziel dieser Dissertation war es einen Arbeitsablauf für die Durchführung von Metaproteomstudien des oralen Mikrobioms zu erarbeiten, beginnend bei der Probensammlung über die Präparation der Proben für die Massenspektrometrie bis hin zur bioinformatischen Auswertung. Diesen Arbeitsablauf galt es für das Mikrobiom des Speichels sowie für die Biofilme auf der Zunge und des supragingivalen Plaques zu etablieren bzw. zu adaptieren. Darauf aufbauend wurden Metaproteomstudien durchgeführt, um die drei Mikrobiome bei gesunden Probanden hinsichtlich ihrer exprimierten Proteine, deren metabolischer Bedeutung und Interaktionen mit dem Wirt sowie deren taxonomische Zuordnung zu studieren.
Studiendesign: Die Dissertation umfasst drei Studien mit drei unterschiedlichen Kohorten. Allen Studien ist gemein, dass die Kohorten sich aus oral gesunden Probanden im Alter von 20-30 Jahren zusammensetzten.
In der ersten Studie verglichen wir die Salivette® sowie den Paraffinkaugummi anhand von fünf Probanden, um die effektivste Methode zur Sammlung von Speichel für Metaproteomstudien zu identifizieren.
In der zweiten Studie wurden die Mikrobiome von Speichel und Zunge anhand von 24 Probanden miteinander verglichen und dafür eine Auswertestrategie entwickelt, um der Komplexität dieser Metaproteomstudie gerecht zu werden.
Im Rahmen unserer dritten randomisierten Einzelblindstudie, die auf einem Cross-over-Design basierte, erhielten 16 Probanden vier unterschiedliche lokale Behandlungsschemata, um deren Auswirkung auf das Plaque-Mikrobiom zu untersuchen. Die Behandlungen bestanden aus zwei Lutschtabletten, die Bestandteile des Lactoperoxidase-Systems in unterschiedlichen Konzentrationen enthielten, einer Lutschtablette mit einem Placebo-Wirkstoff sowie Listerine® Total Care™ Mundspülung als Positivkontrolle.
Alle Proben wurden, basierend auf einem Bottom-Up-Ansatz, unter Verwendung von nano LC-MS/MS Massenspektrometern in einer datenabhängigen Messstrategie (DDA, data- dependant acquisition mode) vermessen. Die bioinformatische Auswertung erfolgte für die erste Studie mit Hilfe der Proteome Discoverer Software. Für die Studien zwei und drei wurde die Trans-Proteomic Pipeline eingesetzt. Die taxonomische sowie funktionelle Zuordnung der identifizierten Proteine erfolgte für alle Studien anhand der Prophane Software.
Ergebnisse:
Für den Paraffinkaugummi konnten wir mit 1.005 bakteriellen Metaproteinen dreimal so viele Metaproteine identifizieren im Vergleich zur Salivette® mit 313 Metaproteinen. 76,5 % der Metaproteine der Salivette® wurden ebenfalls mit dem Paraffinkaugummi gefunden. Insgesamt wurden 38 Genera und 90 Spezies identifiziert, wovon 13 Genera und 44 Spezies nur mit dem Paraffinkaugummi identifiziert werden konnten. Die größte funktionelle Diversität wurde ebenfalls mit dem Paraffinkaugummi detektiert.
Das Metaproteom des Speichel- und Zungen-Mikrobioms basiert auf 3.969 bakteriellen Metaproteinen sowie 1.857 humanen Proteinen. Die Anzahl der nur für das Zungen-Mikrobiom identifizierten Metaproteine, war doppelt so hoch, im Vergleich zum Speichel.
Die Metaproteine konnten 107 Genera sowie 7 Phyla zugeordnet werden. Funktionell wurden für das Speichel-Mikrobiom signifikant höhere Metaproteinabundanzen für die Zellmotilität gefunden. Beim Zungen-Mikrobiom hingegen wiesen die Metaproteine der Biosynthese von sekundären Metaboliten, Signaltransduktion oder der Replikation höhere Abundanzen auf.
Im Rahmen der Plaque-Studie identifizierten wir durchschnittlich 1.916 (± 465) bakterielle Metaproteine je Probe, die wir taxonomisch und funktionell 116 Genera sowie 1.316 Proteinfunktionen zuordnen konnten. Die Plaque inhibierende Wirkung von Listerine® zeigte sich durch eine Reduktion der Metaproteinidentifikation von durchschnittlich 23,5 % nach der Behandlung. Darüber hinaus zeigte die Mehrheit der bakteriellen Metaproteine reduzierte relative Abundanzen während für die Metaproteine humanen Ursprungs eine Erhöhung der Proteinabundanzen gegenüber der Kontrolle vor Behandlung zu verzeichnen war. Aus funktioneller Sicht waren insbesondere metabolische Prozesse, welche für das Zellwachstum und die Zellteilung wichtig sind, betroffen. Im Gegensatz dazu erhöhten sich durch die LPO Lutschtabletten sowohl die Identifikation der Metaproteine als auch die relative Abundanz für die Mehrheit der Proteine. Nach den durch die Metaproteomdaten erhaltenen funktionellen Informationen liegen Hinweise für einen wachsenden Biofilm vor. Die Metaproteine, die eine erhöhte Abundanz nach Behandlung mit den LPO-Dragees zeigten, wurden taxonomisch hauptsächlich Erst- (S. gordonii) und Zweitbesiedlern (F. nucleatum) sowie Bakterien zugeordnet, die einem gesunden Biofilm zuträglich sind.
Fazit: Im Rahmen dieser Dissertation wurde ein vollständiger Metaproteom Arbeitsablauf von der Probensammlung, über die Probenpräparation bis hin zu Datenanalyse für das Speichel-, Zungen- und Plaque-Mikrobiom erarbeitet. In drei Studien konnten wir dessen Anwendbarkeit demonstrieren und erreichten vergleichbare Ergebnisse zu anderen Metaproteomstudien, beispielsweise bezüglich der Proteinidentifikation. Für die Sammlung von Speichelproben stellte sich der Paraffinkaugummi für Metaproteomstudien als die Methode der Wahl heraus. Für das Zungen-Mikrobiom veröffentlichten wir die ersten Metaproteomdaten. Darüber hinaus publizierten wir die erste Metaproteomstudie, welche die beiden Mikrobiome von Speichel und Zunge miteinander vergleicht. Hinsichtlich des Plaque-Mikrobioms handelte es sich ebenfalls um die erste Metaproteomstudie, die ein
anerkanntes und etabliertes zahnklinisches Modell mit den Vorzügen der Metaproteomiks verbindet. Die Ergebnisse liefern erste Daten, um (auf längere Sicht gesehen) ein Produkt zur täglichen Mundhygiene entwickeln zu können, welches die bakterielle Zusammensetzung des Plaque-Biofilms positiv beeinflusst.
Im Rahmen dieser Dissertation wurden die antimikrobiellen Effekte der Phytopharmaka
BNO 101 und Myrtol stand. auf Staphylococcus aureus direkt miteinander verglichen. Für
BNO 101 umfassten die Untersuchungen Wachstumsexperimente mit Messungen der
Optischen Dichte und Experimente zur CFU-Bestimmung. In keinem dieser Experimente
konnten antimikrobielle Effekte auf S. aureus unter Behandlung gezeigt werden. Für Myrtol
stand. wurden Wachstumsexperimente analog durchgeführt. Hierbei konnte ein deutlicher
bakteriostatischer Effekt auf S. aureus und verglichen mit BNO 101 eine höhere Wirksamkeit
nachgewiesen werden.
Unter der Gesamtkonzentration von 0,25% Myrtol stand. liegen die Überlebensraten der
Bakterien 4 h bis 24 h nach Behandlung bei unter 40% im Vergleich zu der Kontrolle. Um
Ursachen für die antibakteriellen Effekte zu finden, wurden die Zellen mittels
Rasterelektronenmikroskopie morphologisch zu verschiedenen Zeitpunkten nach Behandlung
untersucht und eine Myrtol stand.-spezifische Volumenzunahme von bis zu 69% ermittelt.
Zusätzlich wurden Proteinproben der Zellen mittels 2D-DIGE aufgetrennt. Hierbei wurden
separat intrazellulär 1223 sowie extrazellulär 610 Proteinspots detektiert und miteinander
verglichen. Durch Behandlung mit 0,25% Myrtol stand. wurde das S. aureus Proteom über den
gesamten Messzeitraum von 24 h nach Behandlung massiv verändert. Mittels
anschließendem tryptischen Verdau und Massenspektrometrie (LC-MS) signifikant
veränderter Spots, konnte eine Vielzahl von Proteinen identifiziert und davon 54 verschiedene
Proteine einzelnen Stoffwechselwegen durch Datenbankabgleich und Literaturrecherche
zugeordnet werden. Bemerkenswert ist die deutliche Reduktion der Virulenzfaktoren des
Bakteriums durch Myrtol stand. Behandlung. Unter anderem konnten für Superantigen Enterotoxine, Leukotoxine, Hämolysine und Serine-Proteasen und den Genregulator Agr
deutlich verminderte Proteinmengen nach Behandlung gemessen werden. Die veränderten
Proteinmengen sind hierbei sowohl auf eine Umverteilung der Proteine zwischen den
Zellkompartimenten, als auch auf deutliche Regulation in der Proteinbiosynthese
zurückzuführen. Neben den Virulenzfaktoren ließen sich bspw. auch zahlreiche Enzyme der
Zellwand- und Zellmembransynthese sowie des Energiemetabolismus mit deutlich
veränderten Proteinmengen nachweisen, die für das Überleben der Bakterienzellen kritisch
sind. Mittels Direktverdau und nachfolgender LC-MS der Proteinproben wurden die
Ergebnisse bestätigt und weitere regulierte Proteine identifiziert.
Im Rahmen dieser Dissertation konnten antimikrobielle Effekte von Myrtol stand. auf
Staphylococcus aureus nachgewiesen und deren Ursachen aufgezeigt werden. Die
ausführlichen Proteinanalysen nach Behandlung mit Myrtol stand. lassen auf eine starke
verminderte Virulenz des Bakteriums schließen. Angesichts des Bedarfs an zielgerichteten
Therapieverfahren entsprechend der Phänotypen von CRS und ABRS, bietet die systemische
Gabe von Myrtol stand. hier eine kausale Therapieoption. Die zusätzliche Möglichkeit einer
topischen Anwendungsform kann angesichts der hier gezeigten Wirkungen eine
vielversprechende Behandlungsmaßnahme sein und sollte Ziel klinischer Untersuchungen
werden
Identifikation von Tumor-assoziierten Proteinen in Oropharynxkarzinomen mittels Proteomanalyse
(2021)
Plattenepithelkarzinome im Kopf-Hals-Bereich stellen weltweit die sechsthäufigste Tumorerkrankung dar. Symptome treten meist erst in fortgeschrittenen Tumorstadien auf und verhindern somit eine frühe Diagnosestellung. Die Inzidenz- und Mortalitätsraten stagnieren seit Jahrzehnten auf stabilem Niveau. Um potentielle Biomarker und mögliche neue therapeutische Ansätze zu identifizieren, wurden in dieser Arbeit verschiedene Gewebeproben von Tumorpatienten untereinander und mit Plattenepithelproben von Nichttumorpatienten hinsichtlich veränderter Proteinexpressionen verglichen. Mittels 2D-DIGE und MALDI-TOF-MS/MS konnten aus 930 Spots 1874 Proteine identifiziert werden, die einer reprimierten oder induzierten Expression unterlagen. Für die statistische Auswertung lagen nach Abzug der Duplikate 591 Proteine vor. Einige der bereits in der Literatur in Zusammenhang mit Oropharynxkarzinomen beschriebene Biomarker, konnten allerdings nur indirekt über die Ingenuity Pathway Analyse detektiert werden.
Neben bekannten Tumormarkern, wie SCCA, CEA und Hitzeschockproteinen sowie etablierten Therapieansätzen, wie zum Beispiel EGFR und PD-1, wurden andere potentielle Biomarker gefunden, die teilweise in der Literatur schon in Zusammenhang mit Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereichs beschrieben wurden und sich möglicherweise als diagnostisches Werkzeug eignen könnten.
Annexin A1 agiert vermutlich als Tumorsuppressor und seine Expression zeigte sich in Tumorgewebeproben signifikant reprimiert, im Vergleich zu gesunden Plattenepithelien. Vor diesem Hintergrund eignet sich Annexin A1 womöglich als früher diagnostischer Biomarker. Stathmin, ein Regulator des Zellzyklus, war in der vergleichenden Analyse der Tumorgewebe gegenüber der Nichttumorgewebe hochreguliert. Ein denkbarer Einsatzort für dieses Protein wäre das Monitoring des Therapieansprechens, da in der Literatur vor allem in fortgeschrittenen Karzinomen von hohen Expressionsleveln berichtet wurde. Neben dem Einsatz als diagnostisches Werkzeug müsste eine Eignung als Ansatz für eine individualisierte Therapie überprüft werden. Der Zellzyklus und seine Regulatoren sind essentielle Angriffspunkte in der Karzinogenese und stellen ein mögliches Ziel von neuen Therapien dar.
14-3-3 wurde als eine von drei Isoformen der 14-3-3 Proteinfamilie identifiziert und wies eine induzierte Expression auf, die spezifisch für die Tumorgewebe war. Bislang wurde 14-3-3 noch nicht im Zusammenhang mit Oropharynxkarzinomen beschrieben und könnte sich als möglicher Biomarker in der Diagnostik etablieren. Die Isoform 14-3-3 und dessen Expression scheint mit Chemotherapieresistenzen assoziiert zu sein und bietet die Möglichkeit, Patienten mit Chemotherapieversagen früh zu identifizieren. Ein Ansatzpunkt für die zielgerichtete Therapie dieser Patientengruppe müsste in weiterführenden Studien geprüft werden. HPV spielt eine wesentliche Rolle in der Karzinogenese von Oropharynxkarzinomen. Die molekularen Grundlagen, Therapieplanung und Outcome unterscheiden sich erheblich von HPV-negativen Oropharynxkarzinomen. In dieser Arbeit wurde kein HPV-Status erhoben. Für weiterführende Arbeiten wäre die HPV-Erhebung ein grundlegender Baustein.
Um Mortalität und Lebensqualität von Patienten mit Oropharynxkarzinomen zu verbessern, sind eine frühe Diagnosestellung und eine zielgerichtete Therapie notwendig. Wesentlich um dieses Ziel zu erreichen, sind weiterführende Studien, die potentielle Biomarker in der klinischen Erprobung voranbringen.
Das Prostatakarzinom ist die häufigste Krebserkrankung des Mannes und die Inzidenz nimmt seit fast drei Jahrzehnten stetig zu. Moderne Therapieverfahren führen zu einem längeren Überleben der Patienten, durchaus auch mit kompletter Remission. Dennoch können im Rahmen der Therapie, insbesondere unter der Hormonentzugstherapie, weitere Veränderungen des Tumors zu einer Progression der Erkrankung führen. Durch den Verlust der Androgenabhängigkeit des Tumors bezeichnet man dies als kastrationsresistentes Prostatakarzinom. Dieser Progress ist häufig mit einer Zunahme von neuroendokrinen Zellen assoziiert, die im Rahmen einer sog. Neuroendokrinen Transdifferenzierung (NETD) aus den Drüsenzellen des Adenokarzinoms entstehen.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine solche Differenzierung durch die Kultivierung der Prostatakarzinomzelllinie LNCaP in Gegenwart von IL-6 simuliert. Diese experimentell erzeugte NETD konnte sowohl durch die Überexpression typischer Markerproteine, als auch durch die charakteristische Veränderung der Zellmorphologie nachgewiesen werden.
Um die molekularbiologischen Mechanismen im Rahmen der NETD besser zu verstehen, wurde das Proteom der differenzierten Zellen mit dem von Kontrollzellen verglichen. Differentiell exprimierte Proteine wurden mittels Massenspektrometrie identifiziert.
Die Proteine Gelsolin, Septin 7 und PC1 wurden in weiterführenden Experimenten validiert. Im Kontext der NETD erwies sich Gelsolin aufgrund seiner bekannten Funktionen als besonders interessant. Daher wurde dessen Expression mittels RNA- Interferenz moduliert und die Auswirkungen auf Zellfunktion und Morphologie untersucht. Gelsolin ist ein multifunktionelles Protein, welches sowohl Zytoskelett- modulierend wirkt, als auch in die Regulation der Apoptose involviert ist. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass ein Gelsolin knockdown eine deutliche Expressionserhöhung der aktivierten Caspase 3 bewirkt, was mit einer erhöhten Apoptoserate korreliert. Naheliegend war es auch der Frage nachzugehen, ob Gelsolin an der Ausprägung der charakteristischen morphologischen Veränderungen im Zuge der NETD beteiligt ist. Der begleitend zur IL-6-Behandlung durchgeführte knockdown ergab jedoch keinen relevanten Einfluss auf die Ausbildung von Zellausläufern.
Eine auf immunzytochemischer Färbetechnik basierende Analyse zeigte eine Kolokalisation von Gelsolin mit den Proteinen VDAC1 und PC1. Beide sind als Stabilisatoren des mitochondrialen Membranpotenzials bekannt. Somit könnte Gelsolin als Adapterprotein im Rahmen der Apoptoseregulation fungieren.
Die vorliegende Arbeit hat differentiell exprimierte Proteine identifiziert, die im Kontext einer NETD erstmals beschrieben wurden und somit den Weg bereitet, den Erkenntnisgewinn zu molekularbiologischen Abläufen bei der Entwicklung eines kastrationsresistenten Prostatakarzinoms auszuweiten.
Die klassischen Schilddrüsenhormone (TH) Triiodthyronin (T3) und Thyroxin (T4) sind für die Regulation zahlreicher Stoffwechselprozesse von Bedeutung. Dabei beeinflussen sie unter anderem maßgeblich den hepatischen Energie- und Lipidstoffwechsel. In den letzten Jahren haben die beiden Schilddrüsenhormon-Metaboliten 3-Iodthyronamin (3-T1AM) und 3,5-Diiodthyronin (3,5-T2) an Aufmerksamkeit gewonnen, da sie in diversen Studien als endogene, biologisch aktive Substanzen beschrieben wurden.
Die durch 3-T1AM-vermittelten metabolischen Effekte sind dabei denen der klassischen TH teilweise entgegengesetzt. Zudem konnte eine Interferenz mit der Hypothalamus-Hypophysen-Schilddrüsen (HPT)-Achse demonstriert werden. In dieser Arbeit sollte die Hypothese einer direkten 3-T1AM-Wirkung auf die Schilddrüse überprüft werden. Dazu wurden in einem in vitro-Modell 3-T1AM-behandelte Thyreozyten der Zelllinie PCCL3 mittels Transkriptomanalysen untersucht.
Für den TH-Metaboliten 3,5-T2 konnten in früheren Arbeiten anti-steatotische, anti-lipidemische und kalorigene Effekte demonstriert werden. Aufgrund fehlender thyreotoxischer Nebenwirkungen, wie sie für die klassischen TH typisch sind, liegt ein therapeutisches Potenzial von 3,5-T2 zur Behandlung der mit steigender Inzidenz auftretenden Adipositas und der damit assoziierten Fettleber (Steatosis hepatis) nahe. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die 3,5-T2-vermittelten Effekte auf die hepatischen Transkriptions- und Proteinmuster von Mäusen unter Standard- (SD) und Hochfettdiät (HFD) in komplementären Analysen charakterisiert.
Die TH-Homöostase wird durch den negativen Rückkopplungsmechanismus der HPT-Achse reguliert. Im klinischen Alltag wird jedoch häufig eine Störung dieses Gleichgewichts in Form einer Hypo- oder Hyperthyreose beobachtet. Um die physiologischen Auswirkungen dieser Erkrankungen zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit Proteomanalysen der Lebern von Mäusen mit induzierter Hypo- und Hyperthyreose durchgeführt, um bereits vorliegende korrespondierende Transkriptomdaten zu ergänzen.
In den Transkriptomanalysen der 3-T1AM-behandelten Thyreozyten konnten keine Genexpressionsänderungen nachgewiesen werden. Um diese Diskrepanz zu den in anderen Studien demonstrierten metabolischen Effekten zu beheben, könnte eine Optimierung des experimentellen Designs sinnvoll sein. Alternativ könnte gefolgert werden, dass vor allem post-transkriptionelle Prozesse die Wirkungen von 3-T1AM vermitteln.
Die komplementären Transkriptom- und Proteomdaten der 3,5-T2-behandelten Mäuse deuteten auf eine Stimulation der hepatischen Cholesterol-, Gallensäure- und lokalen Sexualhormon-Biosynthese in Tieren unter HFD hin. Außerdem konnten in Mäusen unter HFD erhöhte hepatische Spiegel von Sexualhormonen nachgewiesen werden. Weiterhin zeigten zahlreiche Transkripte und Proteine, welche in den Lipidstoffwechsel und Citratzyklus involviert sind, signifikante Mengenveränderungen nach 3,5-T2-Behandlung unter SD und HFD. Die in dieser Arbeit unter beiden Diäten beobachteten 3,5-T2-vermittelten Effekte auf Xenobiotika-metabolisierende Proteine könnten dabei unter anderem auf unerwünschte thyreomimetische Nebeneffekte hindeuten. Daher sollte der therapeutische Einsatz von 3,5-T2 als ein potenzielles anti-steatotisches Agens, wie es diverse vorangegangene Studien propagiert haben, kritisch betrachtet werden.
Die ersten Ergebnisse der hepatischen Proteomanalysen hyperthyreoter Mäuse deuteten auf eine Reduktion von oxidativem Stress und eine Induktion der Proteinbiosynthese hin, während unter hypothyreoten Bedingungen entgegengesetzte Effekte beobachtet wurden.
Im Rahmen dieser Arbeit konnten umfangreiche globale und komplementäre Datensätze mit Hilfe der Omics-Technologien Transkriptomics und Proteomics, für die Microarray- und Massenspektrometrie-basierte Analysen zum Einsatz kamen, generiert werden. Diese ermöglichten die Gewinnung neuer Erkenntnisse über die physiologischen Effekte und Wirkungsweisen der TH-Metabolite 3-T1AM und 3,5-T2 sowie die Krankheitsbilder Hypo- und Hyperthyreose.
Vorhofflimmern ist die häufigste Herzrhythmusstörung des Menschen. Die Generierung neuen Wissens über Prozesse der Zellregulation und Zellkommunikation kann unser Verständnis über zugrundeliegende Pathomechanismen dieser Erkrankung erweitern und bei der Entwicklung neuer Therapiestrategien helfen. Diese Phosphoproteom-Analyse beschreibt Veränderungen des Phosphorylierungsstatus von Proteinen in HL-1 Kardiomyozyten in Abhängigkeit verschiedener Rapid Atrial Pacing (RAP) Stimulationsprotokolle. Um den Einfluss von Regenerationsphasen, wie es sie z. B. auch beim paroxysmalen Vorhofflimmern gibt, auf den Phosphorylierungsstatus von Proteinen zu untersuchen, wurden die Zellen nicht nur kontinuierlich, sondern auch in Intervallen RAP-stimuliert. Insgesamt konnten in dieser Arbeit 9626 Phosphorylierungen in 3463 Proteinen identifiziert werden, von denen 295 Phosphorylierungen in 261 Proteinen signifikant verändert waren. Stark veränderte Phosphorylierungen konnten z. B. in den Proteinen DOCK7 und MARK2 für kontinuierlich stimulierte HL-1 Zellen und OBSCN und JPH2 für Intervall-stimulierte HL-1 Zellen gefunden werden. Neben spezifisch regulierten Proteinphosphorylierungen konnten auch solche beschrieben werden, deren Regulation für kontinuierliches bzw. Intervall-RAP identisch waren (Overlap). Vertreter dieser Gruppe waren z. B. Phosphorylierungen der Proteine KCNH2 und ABLIM3. Eine Vielzahl beobachteter Unterschiede bezüglich der Richtung und Stärke der Regulation von Proteinphosphorylierungen zwischen kontinuierlich und Intervall- stimulierten HL-1 Zellen ist dabei ein deutliches Indiz für einen bestehenden Einfluss der Regenerationsphasen auf die Modulation zellulärer Signalwege. Bei der Zuordnung veränderter Protein-Phosphorylierungen zu definierten Signalwegen zeigte sich das Netrin-Signaling als signifikantes Beispiel für Signalwege, die sowohl bei kontinuierlich als auch bei Intervall-stimulierten HL-1 Zellen einer Modulation unterliegen. Veränderungen in der Regulation der Proteinphosphorylierung bzw. der Proteinexpression konnten dabei vor allem in einem bestimmten Teil des Signalweges identifiziert werden, an dem die Proteine Netrin, DCC-Rezeptor, NCK, RAC und ABLIM beteiligt sind.
Die Afrikanische Schweinepest (ASP) ist eine Viruserkrankung, die Mitglieder der Suidae-Familie wie Buschschweine, Warzenschweine, Hausschweine und Wildschweine befällt. Das Virus wird durch direkten Kontakt zwischen infizierten und naiven Tieren, durch Zecken der Gattung Ornithodoros oder durch Kontakt mit kontaminiertem Material übertragen. Während die Krankheit bei Warzenschweinen und Buschschweinen im Allgemeinen asymptomatisch verläuft, verursacht die ASP eine hohe Mortalität bei Hausschweinen und Wildschweinen. Daher ist die jüngste Ausbreitung von ASP in Europa eine ernste Bedrohung für die Schweinehaltung in der EU. Bis heute ist keine wirksame Behandlung oder Impfung verfügbar. Und es liegen nur wenige Informationen über Virus-Wirt-Wechselwirkungen vor, die als Grundlage für die Etablierung antiviraler Strategien verwendet werden könnten.
Das Virus der afrikanischen Schweinepest (African swine fever virus, ASFV) ist der einzige bekannte Vertreter der Familie der Asfarviridae. Das DNA-Genom des ASFV kodiert für über 150 Gene. Über die Expressionsprodukte ist wenig bekannt, nur wenige virale Proteine sind bisher funktionell charakterisiert. Die Morphogenese von ASFV ist sehr komplex. So entstehen neben den zweifach umhüllten reifen extrazellulären Virionen auch einfach umhüllte intrazelluläre Partikel, die die die Präparation reiner extrazellulären Virionen erschweren.
In früheren in vitro Studien wurde die Zusammensetzung der extrazellulären Viruspartikel mittels 2D-Gelelektrophorese analysiert. Die Reinigung erfolgte über ein im Jahre 1985 veröffentlichtes Reinigungsprotokoll, welches auf einer Percolldichtegradientenzentrifugation und einer Gelchromatographie basierte. Das Protokoll wurde für die Reinigung des auf Vero-zellen adaptierten Virusstamm Ba-71V etabliert. In einer frühen MS Studie wurden 54 Proteine in ASFV Partikeln detektiert, 15 davon Wirtsproteine. Der Einbau von Aktin, α-Tubulin und β-Tubulin ins Virion konnte ebenfalls bestätigt werden. Systematische massenspektrometrische Untersuchungen zur Charakterisierung des Proteoms der ASF Virionen lagen zu Beginn der vorliegenden Dissertation nicht vor, erst während der Anfertigung des Manuskripts wurde eine solche Studie durch Alejo et al. veröffentlicht.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein auf einer Dichtegradientenzentrifugation ohne nachfolgende Gelchromatographie beruhendes Reinigungsprotokoll entwickelt und die Zusammensetzung reifer ASF Viruspartikel mittels MALDI-TOF/TOF Massenspektrometrie analysiert. Zur Anzucht einer GFP-positiven ASFV OUR T88/3 Mutante wurde die vom Wildschwein abstammende Zelllinie WSL-HP verwendet. Wesentliche Schritte der Reinigung waren eine niedertourige Zentrifugation zur Entfernung zellulärer Verunreinigungen, gefolgt von einer Sedimentation des Virus durch ein Saccharosekissen und einem Proteaseverdau. Final wurde die Präparation über einen selbstgenerierenden Optiprep™ Dichtegradienten gereinigt. Die Titerausbeute lag zwischen 30 und 70 %, die spezifische Infektiosität bei 2,4 x 109 TCID50/mg. Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass die Präparation zwar Virionen enthielt, aber auch, dass die Fixierung mit Glutaraldehyd die Stabilität der Virionen beeinträchtigt.
In der massenspektrometrischen Analyse wurden 29 der 33 bekannten ASFV Strukturproteine bestätigt. Von den neu identifizierten Strukturproteinen konnten vier (pK145R, pC129R, pE146L und pI73R) in allen drei Replikaten und sechs in zwei von drei Replikaten (p5, CP123L, CP312R, E184L, M1249L und M2248R) bestätigt werden. Ein weiteres bis dato nicht charakterisiertes Protein, p285L, konnte als mögliches neues Strukturprotein identifiziert werden. 152 Wirtsproteine wurden im Virion detektiert, darunter hauptsächlich Membranproteine oder Proteine des Zytoskeletts. Daneben wurde eine Reihe an phospholipidbindenden Proteine gefunden. Unter den identifizierten Proteinen waren fünf aus dem glatten ER und einige Vertreter der Hitzeschockproteine.
Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte das intrazelluläre Proteom des ASFV identifiziert werden.
Für diese Untersuchungen wurden drei empfänglichen Zelllinien verwendet, die vom Wildschwein abstammenden Linie WSL-HP, Vero Zellen, die in der Vergangenheit für viele Studien herangezogen wurde und die menschliche Linie HEK-293, die aus einem weiteren nicht empfänglichen Wirt stammt.
Der in dieser Studie verwendete Virusstamm ASFV OUR T88/3 besitzt 157 ORFs. In früheren Studien konnte die Existenz eines Proteins für 44 ORFs bestätigt werden. Für weitere 69 ORFs wurden Transkripte, nicht aber die korrespondierenden Proteine, beschrieben, sodass für 44 ORFs kein Nachweis der Expression vorlag.
In der massenspektrometrischen Analyse wurden je Wirtszelle rund 1000 Proteine identifiziert. Insgesamt belief sich die Zahl der identifizierten ASFV Proteine auf 94, davon 88 in WSL-HP, 83 in Vero und 57 in HEK-293 Zellen. 54 ASFV Proteine wurden in allen drei Zelllinien detektiert. Für 34 der identifizierten ASFV Proteine war bisher nur die Existenz des Transkripts beschrieben, für 23 weitere weder die Existenz eines Proteins noch eines Transkripts. Für 44 der 94 identifizierten Proteine wurde das N-terminales Peptid detektiert. Bei fünf der MGF-110 Proteinen (1L, 2L, 4L, 5L und 14L) und den Proteinen pI329L und pCP123L wurde die Abspaltung der vorhergesagten Signalsequenz experimentell bestätigt.
Die MS Analysen wurden unter Verwendung des emPAI auch quantitativ ausgewertet.
Die geringe Zahl detektierter ASFV Proteine in HEK-293 Zellen korrelierte mit dem geringeren Anteil an ASFV Proteinen im Gesamtproteingehalt der Zelle (6,3 Mol%). Allerdings wurden einige Proteine in HEK-293 Zellen ähnlich stark oder sogar stärker exprimiert als in Vero bzw. WSL-HP Zellen. Die Abundanz einzelner ASFV Proteine variierte in den verschiedenen Zelllinien. Einige wurden jedoch durchgehend stark exprimiert wie z.B. das Strukturprotein p11.5. Einige bisher nicht charakterisierte Proteine, wie z.B. pK145R, pI73R und pC129R, wurden überraschenderweise ebenfalls in allen Zellen stark exprimiert und sind somit möglicherweise Träger wichtiger viraler Funktionen, die weiter untersucht werden sollten.
The highly oncogenic alphaherpesvirus Marek’s disease virus (MDV) causes immense economic losses in the poultry industry. The main targets of in vivo MDV infection are primary B and T lymphocytes. The cytolytic infection of B cells leads to depletion of lymphoid cells results in severe immunosuppression. Infected B cells recruit and activate T cells. The close interaction between B cells and T cells enables efficient intercellular transfer of MDV. During infection of T cells, the virus enters a latent state. Infection of T cells can lead to transformation of these cells and formation of lymphoma, which manifest in various visceral organs. This study aimed at the characterization of the proteomes of MDV-infected lymphocytes during the lytic and latent phases of infection.
Previous in vitro studies concerning the MDV pathogenesis and host-virus interactions have been mainly conducted with primary fibroblasts or kidney cells, due to the short lifespan of primary lymphocytes in cell culture. Recently, a cultivation system has been established that extents the lifespan of primary lymphocytes through the addition of cytokines to the growth medium. This allowed the infection of B cells in vitro and to conduct quantitative proteomic analysis of primary lymphocytes. Infection with GFP labelled virus recombinants allowed the isolation of infected cells by FACS for the proteome analysis of MDV infected B lymphocytes. An efficient quantitative proteomic workflow was developed, which consisted of a filter-aided (FASP) digest of the extracted proteins, followed by differential dimethyl chemical labeling of the peptides for quantitative evaluation prior to LC-MALDI TOF/TOF mass spectrometry. Only few alterations of the protein and transcript expression profiles were observed after infection of primary B cells with the very virulent RB-1B and the live-attenuated vaccine strain CVI988/Rispens. Relevant changes in relative protein levels were found for only twelve and six interesting host proteins after RB1B and CVI988 infection, respectively. However, the regulations were confirmed by inspection of the spectra from all experiments. The identified candidates play a role in immune response, translation and inflammatory response.
To confirm the potential infection markers, RNA-seq analysis of three biological replicates of each RB-1B -, CVI988- and mock-infected B cells was performed. Eighty expressed MDV transcripts could be identified, which were associated with lytic infection. The same MDV proteins were identified after infection with RB-1B or CVI988. However, transcriptome and proteome analysis of MDV-infected primary B cells showed only poor correlation. This indicates that the changes in protein expression profiles are mostly due to posttranscriptional events. Infection marker candidates were identified by the RNA-seq analysis, for which the gene expression was altered by MDV infection. Although almost 12,000 transcripts were identified, only few transcript levels changed markedly after MDV infection. The biological processes immune response, apoptotic process, signal transduction, cell migration and response to virus were enriched after MDV infection. The RNA-seq results confirm the observation that alterations of protein levels early after MDV infection are rare.
Most notably, MDV induces transformation of lymphocytes leading to malignant T-cell lymphomas in visceral organs with mortalities of up to 100 %. While several factors involved in MDV tumorigenesis have been identified, the transformation process is not fully understood. Therefore, we set out to fill this knowledge gap using proteome analysis of transformed T-cells ex vivo. In addition, the role of the viral telomerase RNA during transformation was assessed by comparison of tumors that had formed after infection with WT-virus or a telomerase RNA negative mutant. A major obstacle for tumor proteome analyses is the preparation of sufficient amounts of homogenous tumor tissue, as tumors appear with a dispersed morphology in the affected organs. The quantitation of cell types within the tumors indicated varying portions of hepatocytes, connective tissue, and CD3+ lymphocytes even with the same virus strain in different animals. However, the ∆vTR-induced tumors contained lower levels of hepatocytes and higher levels of CD3+ lymphocytes compared to WT tumors in all tested tumor samples. Thus, ∆vTR tumors were chosen for determination of differences in protein expression profiles of tumors and naïve T cells for their lower content of liver cells. We developed a workflow for the proteome analysis of T cell tumors from livers of MDV-infected chickens. Samples included laser capture micro-dissected tissue cuts from tumors and surrounding healthy liver tissue as well as naïve T-cells prepared from thymus. To enable quantitative proteome analysis, samples were digested using the FASP protocol and peptides were isotope-coded by differential dimethyl labeling. To improve proteome analysis peptides were fractionated by preparative isoelectric focusing prior to nano-HPLC MALDI/TOF-TOF mass- spectrometric analysis.
Proteomic analyses of LCM dissected ΔvTR tumor compared to naïve T cells, the main targets of transformation, identified nineteen potential transformation markers but again only minor changes in relative levels were observed. Several of the identified markers could also be verified by RT-qPCR on transcript level. The identified transformation candidates were associated with nucleosome assembly, regulation of transcription, inflammatory response, immune response and oxidation-reduction process.
However, further functional analyses are necessary to fully elucidate the role of the identified markers during MDV infection and transformation.
Die vorliegende Arbeit adressiert die Nutzbarkeit des humanen Speichelproteoms als diagnostisches Instrument im Kontext einer oralen Mukositis bei Kopf- und Halskarzinoms. Als häufigste Nebenwirkung einer Radio(chemo)therapie kann die Mukositis therapielimitierend sein und hat für betroffene Patienten meist eine Einschränkung ihrer Lebensqualität zur Folge. Trotz der guten Verfügbarkeit von Speichel existieren wenige Studien, welche zeigen, dass das Speichelproteom für die Diagnostik einer Krankheit oder zur Therapieentscheidung nutzbar ist. Das hat unter anderem seinen Grund in der Komplexität der massenspektrometrischen Methode. Die erste Veröffentlichung (Golatowski et al. 2013) erarbeitete deshalb einen Standard in der Probengewinnung von Speichel. Als Ergebnis steht die Empfehlung zur Nutzung eines Paraffin-Kaugummis, aufgrund des hohen Speichelvolumens und der guten Vergleichbarkeit mit der nichtstimulierten Salivation beim identifizierten Proteom. In einer zweiten Veröffentlichung (Jehmlich & Golatowski et al. 2014) wurden C18 Mikrosäulen verschiedener Hersteller bezüglich ihres Einflusses auf die Proteinidentifizierung verglichen. Die Säulen sind notwendig für die Entsalzung und Aufreinigung eines Peptidgemisches. Mit allen verwendeten Säulen konnten ähnliche Ergebnisse erzielt werden, wobei die ZipTip® µC18 sowie C18 Systeme der OASIS® HLB μElution 96er Well Platte und TopTip® C18 Pipettenspitzen leicht überlegen sind. In der letzten Arbeit (Jehmlich et al. 2015) wurden die gewonnenen Erkenntnisse genutzt, um die Speichelproben von Patienten mit Kopf- und Halskarzinom zu untersuchen. Insgesamt zeigten wir die Möglichkeit, alterierte Proteine zwischen zwei Patientengruppen massenspektrometrisch zu detektieren. Mit den gefundenen Daten konnte demonstrieren werden, dass massenspektrometrische Techniken geeignet sind, um schon vor Behandlungsbeginn Patienten zu identifizieren, die für die Entwicklung einer oralen Mukositis prädisponiert sind. Es ist hierbei die Proteinklasse der Metalloproteinasen hervorzuheben, da diese für einen therapeutischen Ansatz gegen Mukositis interessant sind. In Zukunft werden jedoch größere und voraussichtlich multizentrische Studien erforderlich sein, um ausreichend große Patientenkohorten zusammenzustellen und die Klassifikation speziell für Patienten ohne Mukositisrisiko sensitiver zu gestalten.
Humanity is plagued by many diseases. Beside environmental influences, many --- if not all --- diseases are also subject to genetic predisposition and then display molecular alterations such as proteomic or metabolic aberrations. The elucidation of the molecular principles underlying human diseases is one of the prime goals of biomedical research. To this end, there has been an advent of large-scale omics profiling studies. While the field of molecular biology has experienced tremendous development, data analysis remains a bottleneck. In the context of this thesis, we developed a number of analysis strategies for different types of omics data resulting from different experimental settings. These include approaches for associations studies for plasma miRNAs and time-resolved plasma omics data. Furthermore, we devised analyses of different RNA-Seq transcriptome profiling studies coping with problems such as lack of replicates or multifactorial experimental design. We also designed machine learning frameworks for the identification of discriminatory biomolecular signatures analysing case-control or time-to-event data. All of the strategies mentioned above were developed and applied in the contexts of multi-disciplinary endeavours. They aided in the identification of plasma miRNAs associated with age, sex, and BMI as well as plasma miRNAs bearing potential as diagnostic biomarkers for non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). This thesis significantly contributed to a study demonstrating the utility of plasma miRNAs as prognostic biomarkers for major cardiovascular events such as ST-elevation myocardial infarction. Our approaches for analysing RNA-Seq data aided in the characterisation of murine models for Alzheimers disease and the transcriptional response of human gingiva fibroblasts to ionizing radiation exposure. Furthermore, the developed approaches were applied for studying a human model for thyrotoxicosis and for the successful identification of a multi-omics plasma biomarker signature of thyroid status. We are only beginning to understand the molecular principles underlying human diseases. The approaches and results presented in this thesis will contribute to improved understanding of biomolecular processes involved in common diseases such as Alzheimers disease, NAFLD, and cardiovascular diseases.
Thrombozytenkonzentrate (TKs) sind wichtige Blutprodukte für die Therapie von Blutungen unter Thrombozytopenie oder bei Thrombozytenfunktionsstörungen. Trotz moderner Sicherheitsmaßnahmen können Infektionsübertragungen und immunologische Nebenwirkungen durch die Transfusion von Thrombozyten nicht gänzlich ausgeschlossen werden. Pathogeninaktivierungsverfahren (PIV) wurden entwickelt, um Bakterien und Viren in TKs zu inaktivieren und die Sicherheit von TKs weiter zu erhöhen. Zu diesen Verfahren zählen u.a. das Intercept-Verfahren (Amotosalen und UVA-Bestrahlung) und das Theraflex-Verfahren (ausschließlich UVC-Bestrahlung). In dieser Arbeit wurde der Einfluss der PIV durch Amotosalen/UVA und durch UVC auf das Thrombozytenproteom untersucht, welches mit Massenspektrometrie (LC-ESI MS/MS) untersucht wurde.
Hintergrund: Die Phototherapie hat sich bereits in den Leitlinien zur Therapie entzündlicher und immunvermittelter dermatologischer Erkrankungen wie Psoriasis oder dem atopischen Ekzem etabliert. Eine neuere Anwendung ist die intranasale Phototherapie mit mUV/VIS (70 % sichtbares Licht, 25 % UVA, 5 % UVB) zur Behandlung der allergischen Rhinitis. Verschiedene Arbeiten zeigen eine Reduktion der Symptome der allergischen Rhinitis durch mUV/VIS. In der vorliegenden Arbeit wurden die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen und Veränderungen auf Proteomebene in humanen respiratorische S9-Epithelzellen untersucht. Methoden: Respiratorische S9-Epithelzellen wurden mit mUV/VIS für 4 min bestrahlt und nach 0, 30 und 60 min (Kurzzeitbereich) sowie nach 24, 48 und 72 h (Langzeitbereich) geerntet. Zum Vergleich unterschiedlicher Dosen wurden zusätzlich Zellen für 2 und 6 min bestrahlt und nach 24, 48 und 72 h geerntet. Die Proteine der Proben wurden extrahiert und mittels 2D-DIGE aufgetrennt. Die resultierenden Gel-Bilder wurden mittels Delta2D-Software analysiert, die detektierten Spots ausgestanzt und mit Trypsin proteolytisch verdaut. Anschließend konnten sie mittels Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) und dem Datenbankvergleich mit virtuell verdauten Proteinen identifiziert werden. Ergebnisse: Von 1665 detektierten Spots wurden 897 identifiziert und weiter statistisch analysiert. Für die weiteren Analysen wurden nur die im Vergleich zur Kontrolle signifikant veränderten Proteine berücksichtigt (p ≤ 0,05 und Fold Change ≥ 1,5). Die Ergebnisse zeigen eine deutliche Induktion von oxidativem Stress nach mUV/VIS. Dies konnte dosisabhängig mit der Induktion des Nrf2-Pathways, der Hitzeschockproteine und der Induktion der Thioredoxinreduktase 1 nachgewiesen werden. Proteinschäden und Proteinreparatur konnten anhand der Induktion von Hitzeschockproteinen und der Induktion von Proteinen, die mit der Ubiquitin-vermittelten proteasomalen Degradation fehlgefalteter Proteine assoziiert sind, gezeigt werden. Dosisabhängig werden direkt und indirekt durch oxidativen Stress DNA-Schäden induziert. Dies bestätigte sich anhand der dosisabhängigen Induktion von DNA-Reparaturmechanismen (NER). Die Induktion der Apoptose bei massiven Schäden wurde mittels Ingenuity Pathway Analyse (IPA) nachgewiesen. Die Induktion der Tumorgenese ist anhand der dosisabhängig induzierten Anzahl der Tumor-assoziierten Proteine und der induzierten Protoonkogene wie CRK oder des Tumorantigens p53 nachweisbar. In IPA zeigt sich eine dosisabhängige Beeinflussung immunologischer/inflammatorischer Prozesse wie der Psoriasis oder des atopischen Ekzems. Im Zeitverlauf kommt es zum Anstieg der Proteine, die mit solchen Erkrankungen assoziiert sind. Es zeigte sich auch eine dosisabhängige Induktion von Proteinen, die mit Mechanismen der Virusfreisetzung aus der Wirtszelle assoziiert sind. Dies könnte einige klinische Berichte über eine Herpes simplex Virusreaktivierung nach einer mUV/VIS-Bestrahlung erklären. Fazit: Eine Beeinflussung immunologisch/inflammatorischer Prozesse konnte bestätigt werden. Somit ist mUV/VIS zur Therapie der allergischen Rhinitis einsetzbar. Nach aktueller Literatur scheint die Rhinophototherapie nicht für die Karzinogenese zu prädisponieren. Aber es fehlen bisher Langzeit-Studien, die dies bestätigen. Aufgrund der genannten Veränderungen sollte eine mUV/VIS-Behandlung nur nach sorgfältiger Nutzen- und Risikoanalyse erfolgen.
Microbial infections can be either caused by a single species or complex multi-species consortia. One of the most prominent opportunistic human pathogens leading to mono- or mixed-species infections is the Gram-negative bacterium Pseudomonas aeruginosa. Understanding the molecular basis of its adaptation to infection-related stresses is an essential prerequisite for the prevention and treatment of P. aeruginosa infections. We therefore employed state-of-the-art proteomics approaches to elucidate the molecular adaptation mechanisms of P. aeruginosa to infection-related conditions. Moreover, structure, function and interaction of complex microbial consortia containing P. aeruginosa and causing catheter-associated urinary tract infections were investigated by metaproteomics analyses. Our investigations revealed that the adaptation of P. aeruginosa during infection is either based on gene expression changes caused by environmental signal integration or by gene mutations leading to a selective advantage in a particular host environment. In study I, investigating the proteome response of P. aeruginosa biofilms to the clinical relevant antibiotic ciprofloxacin, global changes in the protein profile were observed. Ciprofloxacin induced the expression of proteins involved in the Lex-induced SOS-response, drug efflux pumps and gene products of the ciprofloxacin-responsive prophage cluster and repressed the expression of porins and DNA-binding proteins. In study II the transcriptome and proteome of two clonal P. aeruginosa lineages during long-term colonization of cystic fibrosis (CF) patient’s lungs were analyzed. Point mutations in global regulator genes, i.e. retS, gacS, and gacA, were identified by genomic sequencing. Inactivation of RetS, found two years after the initial colonization, induced the expression of genes involved in chronic infections and coding for the type 6-secretion system (T6SS). Additional mutations in the GacS/GacA two-component regulatory system (TCS) were found to repress the expression of T6SS proteins and to induce the expression of proteins belonging to the type 3-secretion system (T3SS). In study III we elucidated the niche-specific adaptation of P. aeruginosa isolates from different infection sites by investigating their protein expression patterns and glucose metabolic fluxes. We could show that isolates from the urinary tract express a higher amount of proteins involved in the acquisition of micronutrients (i.e. iron) and carbohydrates compared to isolates from the CF lung. In study IV 16S rDNA sequencing and metaproteomics were employed to demonstrate that the investigated CAUTI-related biofilms consisted of two to five different species with one or two species dominating the mixed community. Following this line of research, we investigated in study V structure and function of a biofilm of a long-term catheterized patient, which was predominantly composed of P. aeruginosa and Morganella morganii, but also contained a minor proportion of the obligate anaerobe Bacteroides sp.. The comparison of in vivo and in vitro protein expression profiles of P. aeruginosa and M. morganii indicated that iron and carbohydrates are the major growth-limiting factors in the bladder. These results indicate different nutritional strategies of the two pathogens in the bladder environment. A comparison of urinary protein profiles of healthy persons and catheterized patients suggested that the human innate immune system is induced by CAUTIs. Moreover, numerous proteins involved in nutritional immunity, e.g. iron-, calcium- and magnesium-binding proteins, were found to be more abundant in the urine of catheterized patients. A follow-up (meta)proteomics study (study VI) aiming at the elucidation of interspecies interactions during multi-species infections indicated that the urease-positive uropathogen Proteus mirabilis induces the precipitation of metal ions by urine alkalization and thereby limits the availability of these important micronutrients for other co-infecting bacteria. This limitation seems to be sensed by the P. aeruginosa PhoP-PhoQ two-component system (TCS) leading to an increased resistance to antimicrobial peptides and biofilm-forming capacity of the pathogen. Also during co-cultivation of P. aeruginosa with Staphylococcus aureus a slight increase in the expression of the PhoP-PhoQ TCS and the alkaline protease could be observed (study VII). In study VIII a combined metagenomics and metaproteomics approach was employed to investigate structure and function of the lichen Lobaria pulmonaria, a complex consortium consisting of a fungus, an algal partner, cyanobacteria, and a highly diverse bacterial microbiome. The results presented in this work contribute to a better understanding of the manifold and complex bacterial adaptation mechanisms to infection-related and environmental stress and thereby foster the development of novel treatment and prevention strategies.
Ziel der Dissertation war die Untersuchung der physiologischen Adaptation von Staphylococcus aureus an Vancomycin und Linezolid mit Hilfe der Proteom-Analytik und die Entwicklung neuer Methoden für Proteom-Untersuchungen. Für die Untersuchung der Vancomycinstress-Antwort im ersten Teil der Doktorarbeit wurden alle vier Subproteome mit insgesamt sechs verschiedenen Methoden untersucht. Es konnte mehr als die Hälfte des theoretischen Proteoms quantifiziert werden, die Arbeit ist damit eine der umfassendsten Proteom-Studien, die bisher in S. aureus durchgeführt wurden. Es wurden verschiedene Enzyme der Biosynthese von Aminosäuren, die im Peptidoglykan-Vorläufer-Pentapeptid vorkommen, nach Vancomycin-Stress in signifikant erhöhter Menge nachgewiesen. Das ist ein Hinweis auf eine erhöhte Peptidoglykan-Synthese, wie sie auch in S. aureus Stämmen mit verminderter Vancomycin-Sensitivität beobachtet werden kann. Die Abundanz SaeRS-kontrollierter Virulenzfaktoren war nach Vancomycin-Stress vermindert. In der Vancomycin-Studie wurden extrazelluläre Proteine mit einer Trichloressigsäure (TCE)-Fällung gefällt, diese Methode ist in der Proteom-Analytik weit verbreitet. Die TCE-Fällung hat verschiedene Nachteile. Nach der Fällung muss das entstandene Pellet mehrfach gewaschen werden, hierbei kommt es zu Verlusten und die Reproduzierbarkeit sinkt. Aufgrund dieser Nachteile wurde im zweiten Teil der Dissertation ein neues Protokoll zur Anreicherung verdünnter Proteine entwickelt. Grundlage war das kommerziell erhältliche Festphasenextraktions-System StrataClean, das ursprünglich zur Entfernung von Proteinen aus PCR-Ansätzen entwickelt wurde. Im Rahmen der Doktorarbeit wurde die StrataClean-Extraktion für die gel-freie Proteom-Analytik optimiert. Der wichtigste Schritt war eine Präinkubation der StrataClean-Partikel in Salzsäure, um Kontaminationen an den Partikeln quantitativ abzubauen. Mit dem optimierten Protokoll konnten Proteine auch aus sehr stark verdünnten Lösungen (20 µg Protein in 200 ml Flüssigkeit) mit hoher Effizienz reproduzierbar angereichert werden. Diese hoch-effiziente Anreicherung ist mit keinem anderen etablierten Protokoll möglich. Zudem konnte gezeigt werden, dass die StrataClean Fällung Proteine unabhängig von ihren biophysikalischen Eigenschaften anreichert. Daher ist die StrataClean-Aufreinigung auch für absolute Quantifizierungsansätze interessant. Als weitere Anwendung können StrataClean-gebundene Proteine für mehr als 10 Tage bei Raumtemperatur gelagert werden. Das ermöglicht den Versand von Proteinproben auf dem normalen Postweg ohne aufwendige Kühlsysteme. Im dritten Teil der Doktorarbeit wurde die Linezolid-Adaptation von S. aureus USA300 analysiert. In Wachstumsversuchen konnte gezeigt werden, dass nach Linezolid-Zugabe zu exponentiell wachsenden Zellen bei OD 0.5 die Wachstumsrate sofort abnahm. Bei OD 1.6 – 2 trat ein temporärer Wachstumsarrest auf, dessen Dauer von der zugegebenen Linezolid-Konzentration abhing. Nach diesem Wachstumsarrest, der bis zu 15 Stunden anhielt, fingen die Zellen wieder an sich zu teilen. Es konnte gezeigt werden, dass die Linezolid-Konzentration im Medium während des kompletten Versuches konstant blieb. Die Hauptanpassung an Linezolid war eine verstärkte Expression der Gene ribosomaler Proteine und eine daraus folgende erhöhte Akkumulation der ribosomalen Proteine. Zudem konnte eine generelle Abnahme der Menge integraler Membranproteine und sekretierter Proteine festgestellt werden, auch wenn die Expression der codierenden Gene zunahm. Mittels elektronenmikroskopischer Analysen konnte gezeigt werden, dass die Zellen nach Linezolid-Zugabe deutlich größer wurden. Als weitere morphologische Auswirkung von Linezolid-Stress war die Dicke der Zellwand um den Faktor vier erhöht und es wurden Defekte in der Zellteilung beobachtet. Insbesondere nach Wiederaufnahme des Wachstums gab es zahlreiche zelluläre Strukturen, die mehrere, zum Teil falsch positionierte, Septen hatten. Mit Fluoreszenz-Mikroskopie wurde bewiesen, dass sich das Chromosom, das im normalen Wachstum das Cytosol ausfüllt, nach Linezolid-Zugabe komprimierte und den Kontakt zur Membran verlor. Eine Verbindung zwischen Chromosom und Membran wird durch Transertions-Komplexe gebildet. Transertion bezeichnet die simultane Transkription, Translation und Translokation integraler Membranproteine, dabei werden Komplexe aus Chromosom, mRNA, Ribosom, dem entstehendem Protein und den membranständigen SEC-Proteintransportern gebildet. Aus der Kombination der Ergebnisse wurde geschlossen, dass durch die Linezolid ausgelöste Translations-Hemmung die Transertionskomplexe aufgelöst werden und dadurch die Protein-Translokation vermindert wird. Auch die Defekte in der Zellteilung können so erklärt werden, da so das Chromosom eine Struktur-gebende Funktion für die Zellteilung verliert. Bisher war nicht vollständig bekannt, wie die strukturelle Ordnung in der Zellteilung von Staphylokokken entsteht.
Die chronische Herzinsuffizienz (HI) bezeichnet das Unvermögen des Herzens, die vom Körper benötigte Blutmenge bedarfsgerecht zu befördern und stellt in der Allgemeinbevölkerung das Endstadium vieler Herzerkrankungen dar. Trotz großer Fortschritte in der medikamentösen Therapie ist die Prognose der HI auch heute noch schlecht. Der progrediente Verlauf erstreckt sich von einer kompensierten Herzhypertrophie mit aufrechterhaltener Pumpfunktion bis hin zu einer massiven Ventrikeldilatation mit stark eingeschränkter Herzfunktion und weist dementsprechend eine schlechte Prognose auf. Die zellulären Veränderungen auf Protein- und Genexpressionsebene während der Progression einer HI sind sehr komplex und trotz ausgiebiger wissenschaftlicher Arbeiten nicht ausreichend geklärt. Dabei ist es von entscheidender Bedeutung, in welcher Phase der Erkrankung spezifische Änderungen in der Genregulation entstehen und inwiefern sich diese auf den Phänotyp auswirken. Auf Grund dessen beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit den zeitabhängigen Veränderungen auf mRNA-und Proteinebene während der Progression der HI. Um alle Stadien beginnend von einer subklinischen Organschädigung bis hin zur Ausbildung einer HI experimentell untersuchen zu können, wurde zunächst ein Mausmodell etabliert, welches durch eine chronische Nachlasterhöhung mittels Einengung des Aortenlumens eine Myokardschädigung durch eine arterielle Hypertonie simuliert (transverse aortic constriction, TAC). Die Herzfunktion der Mäuse wurde an den postoperativen Tagen 4, 14, 21, 28, 42, und 56 durch Messungen im Kleintier-MRT (Magnetresonanztomografie) evaluiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich die linksventrikuläre Ejektionsfraktion (LVEF) TAC-operierter Mäuse vom postoperativen Tag 4 zu 14 verschlechtert, bis Tag 42 auf einem konstanten Niveau hält und bis Tag 56 nochmals stark absinkt. Im Gegensatz dazu zeigten Sham-operierte Mäuse über den gesamten Zeitraum eine stabile LVEF. Ein vergleichbarer stufenartiger Verlauf konnte bei den Parametern der linksventrikulären Masse und den endsystolischen bzw. enddiastolischen Volumina beobachtet werden. Zusätzlich konnte durch histologische Untersuchungen zu den verschiedenen postoperativen Zeitpunkten eine verstärkte Fibrosierung des Herzgewebes nach der TAC-OP aufgezeigt werden. Für die longitudinalen Transkriptom- und Proteomuntersuchungen wurden die Herzen (jeweils linke und rechte Ventrikel) nach den MRT-Messungen entnommen, gruppen- und zeitpunktspezifisch gepoolt und einer Microarray- bzw. massenspektrometrischen Analyse unterzogen. Auf Transkriptomebene zeigten sich vor allem an den Tagen 4 und 56 starke TAC-induzierte Veränderungen im Expressionsmuster, wohingegen der Zeitraum zwischen 14 und 42 Tagen weniger differenziell exprimierte Gene aufwies. Der Verlauf der Erkrankung konnte anhand bereits bekannter Hypertrophie- und HI-marker sehr gut charakterisiert werden. So zeigten Nppa (ANP) und Nppb (BNP) im linken Ventrikel bereits kurz nach Aortenstenose stark erhöhte Expressionslevel, die über die gesamte Versuchsdauer erhalten blieben. Weiterhin wurde die Expression von Genen reguliert, die an kardialen Remodelingprozessen maßgeblich beteiligt sind, wie beispielsweise Acta1 (a-Aktin), Myh7 (b-Myosin Heavy Chain) und Postn (Periostin). Im Vergleich beider Ventrikel zeigte der rechte Ventrikel bezüglich der Anzahl der regulierten Gene als auch bei der Expression HI-assoziierter Gene eine verzögerte und weniger stark ausgeprägte Reaktion. In den linken Ventrikeln wurden vor allem die Gene reguliert, deren Genprodukte der extrazelluären Matrix angehören. Eine Validierung der Microarray-Ergebnisse mittels realtime-PCR konnte die Richtigkeit der Analysemethode sehr präzise bestätigen. Da diese anhand ausgewählter Gene auf Einzeltierebene durchgeführt wurde, konnte zusätzlich auf Korrelation zwischen mRNA-Expression und den kardialen Funktionsparametern getestet werden. Wie erwartet spiegelten die Epressionslevel der HI-assozierten Markergene Nppa (ANP), Nppb (BNP) und Myh7 (b-Myosin Heavy Chain) die progressive Verschlechterung der Herzfunktion wider. Zusätzlich konnten durch die Validierung und Korrelationsanalysen weitere interessante Kandidatengene, wie beispielsweise Sfrp2 (Secreted frizzled-related protein 2) und Wisp2 (WNT1-inducible signaling pathway protein 2) für weiterführende Studien identifiziert werden. Auch auf Proteomebene konnten vergleichbare Ergebnisse erzielt werden. Auch hier zeigte der linke Ventrikel eine deutlich ausgeprägtere Reaktion auf die Drucküberlastung, der rechte Ventrikel antwortete deutlich schwächer und verzögert. Änderungen im Proteinmuster nach TAC waren in den linken Ventrikeln vor allem an den Tagen 14, 21 und 28 stark ausgeprägt. Ingenuity Pathway Analysen der veränderten Proteine weisen auf Veränderungen im Kalzium-, Rho A- und PKA-Signaling vor allem zu den frühen Zeitpunkten hin, wohingegen zu späteren Zeitpunkten hauptsächlich metabolische Prozesse betroffen waren.
This thesis will discuss the different fields of application of the two soft ionization techniques ESI and MALDI in microbial proteomics and their importance for a better understanding of bacteria physiology. The general development in the past 25 years coming from 2D-gel analysis and protein identification by peptide mass fingerprint analysis via MALDI-TOF to genome wide quantitative LC-ESI-MS experiments with fast and sensitive ESI instruments is exemplary shown for the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis in article I. Even though 2D-PAGE in conjunction with MALDI-MS is still an important tool in proteomic research, the more recently established global quantitative LC-ESI-MS workflows gain more and more relevance as they overcome 2D-PAGE based protein restrictions and enable the acquisition of higher accurate protein quantities. In article II such a workflow was used to analyze the physiological adaptation of Staphylococcus aureus to vancomycin treatment on a global-scale. Also post-translational modifications of proteins, that are important for regulation of their activity and allow rapid adaption to changed environmental conditions, could be analyzed by LC-ESI-MS workflows using special enrichment strategies (article III and IV). Despite the mentioned discrimination and less accurate quantification of proteins, 2D-PAGE analyses are still advantageous when analyzing large-scale time series experiments. To gain highly time resolved data but also very accurate relative quantities on a global-scale, 2D-PAGE-MALDI-MS and LC-ESI-MS techniques have been combined to investigate dynamic proteome adaptations of B. subtilis during nutrition shift as part of a global systems biology approach (article V). Also absolute quantities of proteins are of high interest for systems biology, but are still challenging to obtain on large-scale as well as with sufficient accuracy. In article VI a method that again combined 2D-PAGE-MALDI-MS and LC-ESI-MS was introduced to gain absolute protein quantities on global-scale. Utilizing the complementarity of 2D-PAGE and LC-ESI-MS this new workflow enabled fast and cost efficient data acquisition on absolute scale. In article VII we described for the first time a global quantitative LC-MALDI-MS workflow. Cross validation with an LTQ Orbitrap proofed that LC-MALDI-MS is able to process complex samples and obtain highly reliable quantities. The comparative analysis of data gained with both instrument types revealed biases for certain biochemical properties of MALDI as well as ESI instruments, resulting in a general complementarity of both ionization techniques. Article I Becher, D., Büttner, K., Moche, M., Hessling, B., Hecker, M., 2011. From the genome sequence to the protein inventory of Bacillus subtilis. Proteomics 11, 2971–2980. Article II Hessling,B., Bonn,F., Herbst,F.-A., Rappen,G.-M., Bernhardt,J., Hecker,M. and Becher,D. Global proteome analysis of vancomycin stress in Staphylococcus aureus. Submitted to Mol. Cell Proteomics. Article III Elsholz, A.K.W., Turgay, K., Michalik, S., Hessling, B., Gronau, K., Oertel, D., Mäder, U., Bernhardt, J., Becher, D., Hecker, M., Gerth, U., 2012. Global impact of protein arginine phosphorylation on the physiology of Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7451–7456. Article IV Chi, B.K., Gronau, K., Mäder, U., Hessling, B., Becher, D., Antelmann, H., 2011. S-bacillithiolation protects against hypochlorite stress in Bacillus subtilis as revealed by transcriptomics and redox proteomics. Mol. Cell Proteomics 10, M111.009506. Article V Buescher,J.M., Liebermeister,W., Jules,M., Uhr,M., Muntel,J., Botella,E., Hessling,B., Kleijn,R.J., Le Chat,L., Lecointe,F., et al. (2012) Global network reorganization during dynamic adaptations of Bacillus subtilis metabolism. Science, 335, 1099–1103. Article VI Maass, S., Sievers, S., Zühlke, D., Kuzinski, J., Sappa, P.K., Muntel, J., Hessling, B., Bernhardt, J., Sietmann, R., Völker, U., Hecker, M., Becher, D., 2011. Efficient, global-scale quantification of absolute protein amounts by integration of targeted mass spectrometry and two-dimensional gel-based proteomics. Anal. Chem. 83, 2677–2684. Article VII Hessling,B., Büttner,K., Hecker,M. and Becher,D. Global relative quantification with LC-MALDI – cross-validation with LTQ-Orbitrap proves reliability and reveals complementary ionization preferences. Submitted to Mol. Cell Proteomics.
Staphylococcus aureus is a pathogenic bacterium infecting the human host. It’s multifaced adaptation to various environmental conditions is mediated by a tight regulation of the virulence factors influencing the host’s immune system. In this thesis two regulators of gene expression were analysed: (i) the global influence of the two-component system SaePQRS and (ii) the regulation of superantigen gene expression by the alternative sigma factor σB. At the outset of this thesis, single target genes induced by SaeRS were known (hla, hlb, cap5, fnbA, coa). In order to get a general idea of the Sae-regulon, the influence of SaePQRS on gene-expression was analysed in two strain backgrounds by proteomics and transcriptomics aproaches. Recapitulatory, expression of at least 18 secreted and two covalently cell-wall bound proteins was decreased following inactivation of the Sae-system. Sae-dependently expressed were, amongst others, well decribed virulence factors like the y-hemolysins HlgA, HlgB, HlgC, LukM and LukF, the innate immune system modulating proteins Efb, CHIPS and SCIN-B as well as the enterotoxin SEB. SaeR acts as an activator of its target genes. Some proteins were detected in increased amounts in the extracellular proteome of the Sae-deficient strain. However, these changes did not occur at the transcriptional level. The expression of virulence factors is determined by other global regulators. No influence of SaePQRS on the transcription of five substancial regulators, namely the Agr-system and its effector molecule RNAIII, the alternative sigma factor σB, the two-component system ArlRS and the DNA-binding protein SarA, could be shown. In the second part of this thesis the issue was broached to the regulation of gene-expression of a subgroup of virulence factors, the superantigens (SAgs) of S. aureus by SaePQRS and σB. In contrast to their well described molecule structure and function, the regulation of their gene expression was largely unknown. Six different S. aureus strains (two laboratory strains and four clinical isolates) encoding one to seven SAg-genes each, were used for analysis of a total of twelve SAgs regarding their transcription and mitogenic activity. The transcriptional units were characterized using Northern-Blotting. The expression of SAgs could be correlated to the respective growth phase. While egc-SAgs were expressed mainly at low optical densities, seb was induced during late growth phase. In contrast, the transcription of sea, seh, sek, tst and sep remained constant and growth-phase independent. The transcriptional dataset was verified using T-cell proliferation assays. The expression of seh, tst and the egc-operon was dependent on σB. A potential σB-dependent promotor could be identified preceeding seo, the first gene of the egc-operon. In contrast, the expression of seb was increased in sigB-deficient background. This might be due to indirect effects. Expression of seb required SaePQRS. Transcriptional datasets were verified by Immuno-Blotting and T-cell-proliferation assays. In conclusion, the same mutation in sigB but in different strain backgrounds could result in opposite phenotypes with respect to their mitogenic activity. Besides well characterized virulence factors, some secreted proteins with so far unknown function belong to the Sae-regulon. Given that the influence of SaePQRS was restricted to virulence factors and induced especially modulators of the innate immune system, it can be assumed, that these proteins potentially play a role in virulence of S. aureus. In the third part of this thesis, one of these potential new virulence factors, namely SACOL0908, was analysed in detail. In cooperation with the group of Prof. Stehle, Tübingen, the crystal structure was solved. The protein folding of SACOL0908 is new with only minor similarities to described protein structures. Recombinantly expressed SACOL0908 binds to granulocytes. These cells belong to the innate immune system, incorporate bacteria by phagocytosis and kill them. The receptor for SACOL0908 on the surface of granulocytes could not be identified using immunoprecipitation, antibody-blocking assays and functional assays in cooperation with the group of Prof. Peschel, Tübingen. The gene encoding SACOL0908 was deleted in two S. aureus strain backgrounds (COL and Newman). These mutants are currently in use to characterize their phenotype in mouse-infection studies.
Non-thermal atmospheric pressure plasma has recently been shown to have broad application potential for medical as well as industrial purposes. Improved wound healing and tissue decontamination have been described as consequences of non- thermal plasma treatment. However, thus far the underlying molecular mechanisms in human tissues have only been partially characterized. In this work a two-dimensional difference in-gel electrophoresis (2D-DIGE) approach was used and an analysis-workflow to study the response of human cells to atmospheric pressure non-thermal plasma was established. Human S9 bronchial epithelial cells were used as a model for airway epithelial cells. They were treated with atmospheric pressure plasma jet (APPJ) for different periods of time. Subsequently, time-resolved comparative proteome analysis was used to study the complex cellular adaptation reactions after a 120 sec plasma treatment, which accelerated wound healing in a clinically relevant model. The results indicate, that intracellular oxidative stress due to the non-thermal plasma treatment either leads to cell death or to proliferation. The oxidative stress response, mediated by Nrf2, appears to play a pivotal role in molecular signalling and might be a key pathway determining the fate of stressed cells. This thesis demonstrates changes in Nrf2-expression after non-thermal plasma treatment. Furthermore, potential protein biomarker candidates for evaluation of oxidative stress after non-thermal plasma treatment were identified. Finally, it is shown, that the cytosolic concentrations of IL-1beta and IL-33 were decreased following non-thermal plasma treatment. Thus, modulation of innate immune response by non-thermal plasma treatment of epithelial cells (ENTplas treatment) is concluded.
Dilated Cardiomyopathy is a chronic myocardial disease characterized by progressive depression of contractile function and ventricular dilatation. It is the leading cause of heart failure and the most common reason for heart transplantation. Besides genetic causes, viral infection and autoimmune response are considered to play a major role in the etiology of the disease. Among different viruses that cause the disease, Coxsackievirus B3 (CVB3) is predominantly associated with the development and progression of the disease. Moreover, Coxsackievirus induced myocarditis in the mouse mimics human myocarditis and dilated cardiomyopathy. In the murine model, the disease progresses over a period of 90 days from acute myocarditis to chronic myocarditis and further develops into dilated cardiomyopathy and congestive heart failure. Though much is known about the progression of the disease, the molecular events occurring after infection with CVB3 are not completely understood. In the current study, comparative proteomic analysis of A.BY/SnJ mouse hearts 84 days post infection (84 d p.i.) with CVB3 and age-matched non-infected mouse hearts was performed. 2D-DIGE and gel-free LC-MS/MS were used to characterize the changes occurring at the molecular level and Western Blot analysis as well as immunohistochemical staining was carried out for validation of results. A total of 101 distinct proteins were identified as displaying dilated cardiomyopathy-associated changes in A.BY/SnJ mouse hearts 84 d p.i. compared to age matched controls. Comprehensive analysis by both DIGE and gel-free proteomics revealed proteins related to lipid metabolism (18%), carbohydrate metabolism (14%), cell morphogenesis (14%) and respiratory electron transport chain (9%) to display significantly altered levels in diseased mouse hearts. The significant increase in extracellular matrix proteins observed in mouse hearts 84 d p.i. indicated extensive fibrosis. On the other hand, proteins related to energy metabolism were identified at lower levels in infected mouse hearts than in controls. These proteomics data and the decrease in activities measured for complexes I-IV of the respiratory electron transport chain in A.BY/SnJ mouse hearts 84 d p.i compared to age matched controls, indicate a diminished energy supply in the dilated hearts of CVB3 infected mice. Furthermore, proteins associated with muscle contraction were identified at lower levels in mouse hearts 84 d p.i. compared to age matched controls indicating compromised myocardial contractility due to virus induced dilated cardiomyopathy. While extracellular matrix proteins and contractile proteins were identified in the DIGE analysis, proteins of lipid metabolism which are mostly mitochondrial in origin and have a pI > 7 were identified by gel-free proteomics indicating the advantages of both methods. Gel based analysis also aided in the identification of protein isoforms/ species which allows conclusions on post translational modifications and protein processing. Thus, the current study also identified infection related changes in the phosphorylation of selected proteins. Phosphospecific staining of the gels demonstrated increased phosphorylation of myosin regulatory light chain - ventricular isoform, actin - aortic smooth muscle isoform, heat shock protein 90B, and heat shock protein beta-1 in infected mouse hearts. Extensive degradation of proteins was not observed in the dilated heart. As described earlier, virus induced dilated cardiomyopathy develops over a period of 90 days in the murine model during which the mice also grow and undergo aging. Since aging is one of the factors influencing the susceptibility of animals to disease, age dependent changes in the proteome of mouse hearts were also studied by comparing 4 months old (84d) A.BY/SnJ mice with 1 month old mice as controls. Complementary analyses by 2D-DIGE and gel-free LC-MS/MS analysis revealed 96 distinct proteins displaying age associated differences in intensity. These proteins are related to lipid metabolism (19%), protein transport (17%) and electron transport chain (12%). Mitochondrial proteins such as carnitine-o-palmitoyltranferase 1, carnitine-o-palmitoyltranferase 2, and carnitine-O-acetyltransferase involved in lipid metabolism and transport were identified at significantly higher levels indicating higher energy demand in 4 months old mice compared to controls. This conclusion is complemented by observation of decreases in the levels of respiratory electron transport chain proteins especially of subunits of ATP synthase as a member of complex V. Furthermore, an increase in intracellular transport proteins was also observed in 4 months old mouse hearts compared to one month old controls. An increase in the level of vesicular transport proteins likely constitutes a secondary effect leading to endoplasmic reticulum associated protein degradation. In the two studies described above, altered mitochondrial functioning and thereby decreased energy/ATP production was very prominent indicating the role of mitochondria in health and disease. The exchange of ADP/ATP across the mitochondrial membrane is carried out by the carrier protein adenine nucleotide translocase1 (ANT1). To improve understanding of the influence of ANT1 in the heart, comparative proteomic analysis using gel-free LC-MS/MS was performed with hearts of 3 months old rats over-expressing ANT1 using hearts from age-matched wild type animals as controls. A total of four hundred and thirty three proteins were identified with at least two peptides, of which eighty seven proteins displayed small but significant (p<0.05) changes in intensity. Proteins related to integrin linked kinase signalling and myocardial contraction displayed increased levels whereas proteins of the mitochondrial respiratory electron transport chain displayed decreased levels in ANT1 overexpressing hearts compared to wild type animals. Oxyblot analysis performed to study changes in the protein oxidation did not reveal any significant difference in the oxidative state of the proteins between the wild type and transgenic animals. To understand the influence of ANT1 overexpression in virus induced dilated cardiomyopathy, comparative proteomic analyses was performed for the mitochondrial fractions from the hearts of 8 months old rats of the wild type and ANT1 transgenic animals infected with CVB3. Of a total of 370 identified proteins, 83 proteins displayed altered levels in ANT1 overexpressing animals compared to controls. Proteins related to mitochondrial electron transport chain, fatty acid metabolism, contractility and cell structure displayed decreased levels in the infected transgenic animals compared to controls indicating decreased energy metabolism and myocardial contractility besides compromised cell structure. Besides viral causes of dilated cardiomyopathy, autoimmunity also plays a major role in the development of myocarditis and dilated cardiomyopathy. Therefore proteomic analyses of experimental models of autoimmune myocarditis generated by active immunization of rats with peptides of FcγIIa receptor -CEPPWIQVLKEDTVTL (peptide 1) designated as FcR animals and CRCRMEETGISEPI (peptide 2) designated as FcR2 animals- was performed. Of the 303 proteins identified with at least two peptides by gel-free LC-MS/MS analysis. 43 proteins displayed intensities greater than 1.2 fold in FcR rat hearts and 49 proteins displayed intensities greater than 1.2 fold in FcR2 rat hearts compared to animals injected with KLH adjuvant treated as controls. The majority of the alterations (>70%) were observed in both autoimmune models. Thus, immunization leading to an induction of the acute phase response signalling was observed in both experimental setups. Furthermore, the increased amount of proteins such as lumican or procollagen alpha 1, type 1 indicated the presence of fibrosis after immunization independent of the peptide used. In summary, using proteomics the current thesis addresses the changes in protein profiles of two models of dilated cardiomyopathy, namely, virus induced dilated cardiomyopathy and autoimmunity induced dilated cardiomyopathy in mouse and rat models of disease. 2D-DIGE and gel-free LC-MS/MS analysis are complementary techniques which provided a comprehensive view of the changes in the protein profile of hearts of the different animal models. Altered mitochondrial function resulting in decreased energy metabolism and compromised myocardial contractility were prominent in viral models of cardiomyopathy whereas intense acute phase response signalling was observed as a characteristic feature of autoimmune dilated cardiomyopathy. Altered mitochondrial function was also prominent in age associated changes in the heart of A.BY/SnJ mice indicating the role and influence of mitochondria in health and in disease.
Zusammenfassung Das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) ist das wichtigste nicht-lysosomale proteolytische System für den Abbau intrazellulärer Proteine. Die Inhibition des UPS kann dosisabhängig den apoptotischen Zelltod oder die Induktion einer protektiven Stressantwort auslösen. In der therapeutischen Anwendung der Proteasominhibition sind neben der Wirksamkeit auch exakte Kenntnisse der Wirkungsweise essentiell, um die primären Effekte durch die Proteasominhibition besser zu erfassen und die initialen Effekte der Vermittlung dieser zellulären Reaktion besser zu verstehen. In dieser Arbeit wurden Methoden der Proteom- und Transkriptomebene kombiniert, um komplexe zelluläre Veränderungen von Endothelzellen nach Proteasomhemmung zu charakterisieren. Weiterhin wurde mittels Immunpräzipitation Ubiquitin-bindender Proteine untersucht, welche Substrate des Proteasoms nach Proteasomhemmung in Endothelzellen stabilisiert werden. Primäre humane Endothelzellen (Huvec) wurden als Modell gewählt und mit niedrigen bzw. hohen Dosierungen des Proteasominhibitors MG132 behandelt. Das Expressionsprofil wurde in einer Zeitkinetik innerhalb der ersten 6h mittels Affymetrix Chipanalysen bestimmt. Die differentielle Proteinexpression nach zwei Stunden Proteasomhemmung wurde im Gesamtzelllysat durch 2D Gelelektrophorese und anschließende Silberfärbung visualisiert. Dabei konnten mehr als 20 regulierte Proteine identifiziert werden, welche zuvor nicht direkt im Zusammenhang mit der Vermittlung einer protektiven Stressantwort nach niedrig dosierter Proteasomhemmung bekannt waren. Durch Korrelation mit den parallel durchgeführten Expressionsarrays konnte die Regulation dieser Proteine als unabhängig von der Transkription erfasst werden. Die funktionelle Annotation der Daten zeigte dabei eine Anreicherung von Proteinen der zellulären Stressantwort, der intrazellulären Signaltransduktion und des oxidativen Stresses. Diese waren differentiell reguliert nach niedrig bzw. hoch dosierter Proteasominhibition. Während die niedrig dosierte Proteasominhibition ein protektives Genmuster zeigte, induzierten hohe Dosen den apoptotischen Zelltod. Auch konnte, in Abhängigkeit vom Grad der Proteasominhibition, ein deutlicher Anstieg der freien Radikale innerhalb der Zellen nachgewiesen werden, was auf die Vermittlung der Apoptose durch freie Radikale hinweist. Mit DJ-1, Peroxiredoxin-1 und -6 wurden mehrere Sensorproteine für oxidativen Stress identifiziert. Um, neben der Proteom- und Transkriptomanalyse, auch gezielt Substrate der Proteasominhibition zu identifizieren und als mögliche Mediatoren der protektiven Stressantwort zu identifizieren, wurden Gesamtzelllysate mittels Ubiquitin-Immunpräzipitation getrennt und Ubiquitin-bindende Proteine per Massenspektrometrie identifiziert. Dabei konnte ein Set von 22 Proteinen identifiziert werden, welche spezifisch nach 2h an der Ubiquitin-spezifischen Matrix gebunden wurden. In diesem Set finden sich vor allem RNA bindende Proteine, Bestandteile des UPS und ribosomale Proteine. Um gezielt transkriptionelle Mediatoren der protektiven Stressantwort nach partieller Proteasominhibition zu identifizieren, wurde eine Subproteom-Analyse mit nukleären Extrakten von Huvec durchgeführt. Nach Visualisierung mittels DIGE-Labeling und quantitativer Auswertung konnten 361 regulierte Spots nach 2 stündiger Proteasominhibition erfasst werden. Von diesen Spots konnten 319 per MALDI-MS identifiziert werden und 152 verschiedenen Proteinen zugeordnet werden. Die funktionelle Auswertung ergab eine deutliche Überrepräsentation von RNA-bindenden und Splicing-relevanten Proteinen. Auch konnte für HnRNP A1, einem RNA-bindenden Protein, eine funktionelle Methylierung sowie eine Veränderung der subzellulären Lokalisierung nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse deuten auf die Regulation des zellulären Splicings hin. In parallel dazu angefertigten Exon-sensitiven Affymetrix Arrays wurden über 600 Gene mit differentiell regulierten Exons identifiziert, welche vor allem Gene mit Rezeptor- und Transportproteinen kodieren. Auch eine erhöhte Anzahl von Genen mit Methyltransferase-/Kinaseaktivität wurde identifiziert. Insbesondere die Methyltransferasen, welche auch bei der posttranslationalen Modifikation von HnRNP A1 eine Rolle spielen, zeigten dabei eine signifikante Regulation unter niedrig dosierter Proteasominhibition. Zusammengefasst tragen die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse dazu bei, einen detaillierten Überblick über die initialen Prozesse niedrig dosierter Proteasominhibition in Endothelzellen zu geben. Die Daten deuten dabei auf eine schnelle Adaptation der Zellen nach partieller Proteasomhemmung mittels Aktivierung einer anti-oxidativen Stressantwort sowie durch Regulation von Splicingvorgängen hin, die letztendlich in einem veränderten Expressionsprofil der Endothelzellen münden. Mit diesem systematischen Ansatz und der Kombination von Proteom- und Transkriptomanalyse konnten dabei einzelne Targets für die Mediation einer protektiven zellulären Stressantwort nach partieller Proteasomhemmung identifiziert werden.
Massenspektrometrie hat sich zur Methode der Wahl für die globale relative und absolute Proteinquantifizierung entwickelt. Da das vorhandene Methodenspektrum in der Anzahl der zu analysierenden Proben limitiert ist und bei der Vermeidung von Vorfraktionierungstechniken keine globale Analyse erlaubt, war es das Ziel dieser Dissertation das Methodenspektrum anhand von anschaulichen Beispielen zur physiologischen Proteomanalyse Gram positiver Bakterien zu erweitern. Dazu erstreckt sich diese Arbeit von der Erweiterung der Anwendungsmöglichkeiten der Isotopen markierten relativen Quantifizierungsmethode, über die Entwicklung eines globalen markierungsfreien relativen Quantifizierungsansatzes bis zur globalen absoluten Quantifizierung und weiter im speziellen der Stöchiometrie-Aufklärung eines Proteinkomplexes. Die Kombination aus 14N/15N metabolischer Markierung mit der GeLC-MS Technik erlaubt eine robuste relative Quantifizierung auf globaler Ebene. Durch die Verwendung eines internen 15N-markierten Referenzextraktes wurde eine bisher nicht erreichte zeitliche Auflösung von zehn Zeitpunkten bei der Untersuchung eines Nährstoffwechsels zwischen den bevorzugten Kohlenstoffquellen, Glukose und Malat, des Gram positiven Modellorganismus Bacillus subtilis erreicht. Dieses Experiment zeigte klar, dass die Anpassung an Malat als zweite Kohlenstoffquelle sehr schnell passiert. Im Gegensatz dazu findet die Anpassung an Glukose als zusätzliche Kohlenstoffquelle mit einer zeitlichen Verschiebung von ca. 45 Min. statt. Diese Ergebnisse legen den Schluss nahe, dass die Anpassung an Malat hauptsächlich auf post-transkriptioneller Ebene geschieht und die Anpassung an Glukose auf transkriptioneller Ebene stattfindet. Die geringe Reproduzierbarkeit von Vorfraktionierungstechniken beschränkt ihre Anwendung während einer markierungsfreien Quantifizierung. Die eingeschränkte Kombinationsmöglichkeit mit Vorfraktionierungstechniken führt zu einer geringeren Anzahl an identifizierten und quantifizierten Proteinen, was durch den Einsatz von Ausschlusslisten mit optimierten Messparametern in wiederholten Messungen mit einer eindimensionalen Chromatographie ausgeglichen wurde. Im Vergleich zu einer einfachen Wiederholung der Messung konnte die Anzahl an identifizierten Peptiden um 32 % gesteigert werden. Der Ausschlusslistenansatz konnte anschließend erfolgreich für eine markierungsfreie globale Proteinquantifizierung der Stickstoffmonoxid (NO) Stressantwort des humanpathogenen Stapylococcus aureus eingesetzt werden. Die Ergebnisse wurden mittels paralleler Quantifizierung mit 14N/15N metabolischen Markierung verifiziert. Mit dem Ansatz wurden fast 50 % des gesamten Proteoms identifiziert und 70 % davon konnten mit einem zu dem Markierungsexperiment vergleichbaren Ergebnis quantifiziert werden. Die Proteomsignatur der NO-Stressantwort zeigte eine hohe Ähnlichkeit zu der von Antibiotika, die wie NO zu DNA-Strangbrüchen führen. Auch bei der absoluten Proteinquantifizierung kann nicht ohne Weiteres eine Vorfraktionierung eingesetzt werden. Durch die Verwendung einer „multiplexed LC-MS“ (LC-MSE) Methode wurde fast die Hälfte aller zytosolischen Proteine von B. subtilis mit einer hohen durchschnittlichen Sequenzabdeckung von 40 % identifiziert. Die Hi3-Methode ermögliche zusätzlich die absolute Quantifizierung fast aller identifizierten Proteine, die über fast vier Größenordnungen nachgewiesen werden konnten. Die Zuverlässigkeit des Ansatzes wurde für sechs Proteine mit der gut etablierten AQUA-Technik bestätigt. Mit der Hi3-Methode wurden zum einen absolute Proteomsignaturen für unterschiedliche Nährstoffsituationen erstellt, was auch Einblicke in die Regulation der Expression von Aminosäure-Biosynthese und –abbau-Enzyme ermöglichte. Zum anderen konnte gezeigt werden, dass die intrazelluläre Konzentration von ribosomalen und weiteren Wachstumsraten-abhängig benötigten Proteinen sich bei niedrigen Wachstumsraten nicht unterscheidet und erst ab einer Wachstumsrate von 0,8 Std.-1 linear ansteigt. Die vergleichsweise hohe Standardabweichung der Hi3-Methode (~30 %) erschwert ihre Anwendung bei der Bestimmung von nicht gradzahligen Protein-Komplex-Stöchiometrien. Deswegen wurde zur Analyse des RNA-Polymerase-Komplexes von B. subtilis der AQUA-Ansatz gewählt, der sich durch eine sehr geringe Standardabweichung auszeichnet (< 10 %). Dazu wurde ein Protokoll entwickelt, welches auf einer mTRAQ-Markierung der Referenzpeptide und des verdauten Komplexes beruhte. Es war so möglich die bekannte Stöchiometrie des Kernkomplexes RpoA:RpoB:RpoC 2:1:1 zu bestätigen und zusätzlich die zwei ω-Unterheiten und die σ-Faktoren σA und σB absolut zu bestimmen. Die Menge an σB im Komplex nahm nach Glukose-Hunger und Ethanol-Stress auf bis zu 5 % zu und es konnte gezeigt werden, dass sich die Menge einer ω-Unterheit (YloH) sich im gleichen Maße im Komplex ändert, wie die Menge an σA.
Untersuchungen zur Expression der Nicotinamid N-Methyltransferase im klarzelligen Nierenzellkarzinom
(2011)
Mit einer steigenden Anzahl der Neuerkrankungen in den letzten 20 Jahren ist das Nierenzellkarzinom in Deutschland die dritthäufigste bösartige Erkrankung des Urogenitaltrakts. 75 % dieser malignen epithelialen Tumoren sind klarzellige Nierenzellkarzinome. Trotz des technischen Fortschritts in der Medizin ist die Diagnose Nierenzellkarzinom noch häufig ein sonografischer Zufallsbefund, denn klinische Symptome sind initial meist unspezifisch. Nach einer Tumornephrektomie erleiden 30 bis 40 % der Patienten ein Rezidiv, wobei zirka 2/3 in den ersten zwei Jahren nach Primärtherapie beobachtet werden. Spätmetastasen können beim Nierenzellkarzinom charakteristischerweise auch nach mehr als 15 Jahren auftreten. Diese Fakten legen nahe, dass eine frühzeitige Diagnosestellung den Erfolg einer entsprechenden Behandlungsstrategie mitbestimmt. Dieser Arbeit vorausgegangene Proteomanalysen zeigten eine differentielle Expression der Nicotinamid N-Methyltransferase im klarzelligen Nierenzellkarzinom. Auf der Grundlage der gefundenen tumorassoziierten Enzymalteration wurden im Rahmen dieser Arbeit Gewebeproben von 20 Patienten mit klarzelligem NZK molekularbiologisch untersucht um den Expressionsunterschied des Enzyms Nicotinamid N-Methyltransferase zu verifizieren. Pro Patient wurde die Expression der Nicotinamid N-Methyltransferase im Tumorgewebe sowie im makroskopisch unauffälligen Nierenrandgewebe analysiert. Der Nachweis der NNMT erfolgte anhand folgender Methoden: semiquantitative RT-PCR, quantitative real-time-PCR (SYBR® Green I- sowie TaqMan®-Assays), Western Blot, Immunhistochemie. Alle Untersuchungsmethoden bestätigten eine erhöhte Expression der NNMT im klarzelligen NZK im Vergleich zum Kontrollgewebe, wobei ein statistisch signifikanter Unterschied in der Western Blot-Analyse am deutlichsten war. Ein Zusammenhang zwischen der NNMT-Expression und Tumorstadium beziehungsweise Grading wurde weder auf Protein- noch auf RNA-Ebene gefunden. Mögliche Forschungsansätze könnten unter anderem die Untersuchung genetischer Polymorphismen, Mutationsanalysen, die Korrelation von NNMT-Genexpression und HNF-1beta-Genexpression im Nierenzellkarzinom sowie die Interaktion der NNMT in Angiogeneseprozesse bieten.
Zur Aufklärung der molekularen Grundlagen einer Infektion mit dem Pseudorabiesvirus (PrV), dem Erreger der Aujeszky’schen Krankheit beim Schwein, wurde eine qualitative und quantitative Proteomstudie von PrV-infizierten bovinen Nierenzellen (MDBK) durchgeführt. Die Erstellung der Proteomkarten erfolgte durch hochauflösende zweidimensionale Gelelektrophorese, mit der neben zum größten Teil unmodifizierten Proteinen auch eine Reihe von Proteinen mit posttranslationalen Modifikationen nachgewiesen werden konnten. Die Identifizierung der Proteine erfolgte mit dem Peptidmassenfingerabdruck durch Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-of-Flight(MALDI-TOF)-Massenspektrometrie. Proteine wurden massenspektrometrisch durch die stable isotope labelling by amino acids in cell culture (SILAC)-Technik quantifiziert. Um die Komplexität des Gesamtzellextraktes zu reduzieren, wurde eine Affinitätsfestphasenchromatographie aus verschiedenen Matrices, bestehend aus einer Cibacron Blau F3G-A Matrix, die Nukleotid-bindende Proteine bindet, einer Heparin Matrix, die DNA-bindende Proteine bindet und einer Phosphoprotein spezifischen Metallchelatmatrix etabliert. Dabei zeigte sich, dass sich der Gesamtzellextrakt in gut definierte Teilproteome fraktionieren ließ. Die Fraktionierung zeichnete sich durch eine hohe Trennschärfe, eine hohe Effizienz und eine spezifische Anreicherung entsprechend der Affinitäten der verwendeten Matrices aus. Zur weiteren Erhöhung der zu analysierenden Proteine wurden die Fraktionen auf mehreren Fokussierungsstreifen mit unterschiedlichen pH-Wert Bereichen (3-6, 4-7, 6-9 und 3-10) analysiert, wobei sich lediglich der pH-Bereich zwischen 3-6, als relativ proteinarm erwies. Die Streuung bezüglich der relativen Quantifizierung wurde in einem Kontrollversuch bestimmt. Sie war sehr gering, was auch die Erfassung sehr kleiner Unterschiede in den Expressionsniveaus erlaubt. Das bovine Wirtszellproteom erwies sich vier Stunden nach Infektion mit dem PrV in qualitativer und quantitativer Hinsicht, trotz des beschriebenen shutoff, der zu einem Abbau der zellulären mRNA führt, als überraschend stabil. Quantitative Unterschiede wurden bei 109 Wirtszellproteinen gefunden. Vorwiegend handelte es sich dabei um Proteine der Kernlamina, Bestandteile des Translationsapparates, Proteine des Membran- und intrazellulären-Transports, sowie Proteine der Stressantwort. Bei den Proteinen Lamin A/C und B2, 60S Saures Ribosomale Protein P0, Hitzeschock-27 Protein 1, Heterogenes Nukleäres Ribonukleoprotein K, Sorting Nexin-9 und dem Eukaryotischen Translations-Initiations Faktor 4B wurden Mengenverschiebungen zwischen den Isoformen hin zu den stärker negativ geladenen Varianten beobachtet, die möglicherweise auf Phosphorylierungen zurückzuführen sind. Um den Mechanismus der Regulation der Wirtszellproteinexpression genauer zu untersuchen, wurde aufbauend auf den Ergebnissen der Proteomstudie eine Transkriptanalyse durchgeführt. Transkriptom- und Proteom-Analysen nach einer PrV-Wildtyp-Infektion zeigten eine nur geringe Korrelation, sodass die beobachteten Veränderungen der Proteinmengen die Folge von posttranslationalen Vorgängen sein dürften. Neben der Quantifizierung von Wirtszellproteinen wurde die SILAC-Methode zur Quantifizierung der Expression von viralen Proteinen in Deletionsmutanten getestet. Dazu wurde der Analysengang verändert und MDBK-Zellen mit einer PrV-US3-Deletionsmutante (PrV-ΔUS3) und dem PrV-Wildtyp infiziert. Die Extrakte aus PrV-Wildtyp-infizierten Zellen wurden als globaler interner Standard verwendet. Die Verwendung der SILAC-Methode erlaubte hier die Anwendung der sonst sehr Artefakt-anfälligen Zellfraktionierung in Zytosol- und Kernextrakte zur Reduktion der Probenkomplexität. Ein Vergleich zur Affinitätsfestphasenextraktion zeigte, dass ein Großteil der identifizierten Proteine auch mit letzterer erfasst wird. Einige wichtige Kernproteine wie Spleißfaktoren konnten aber nur in der Kernfraktion identifiziert werden. Vergleiche von Zellextrakten nach Infektion mit PrV-Wildtyp oder einer US3-negativen Mutante zeigten Veränderungen in den Expressionsniveaus der viralen Proteine pUL29, pUL39 und pUL42. Dabei besaßen pUL29 und pUL39 eine erhöhte und pUL42 eine verminderte relative Abundanz in Abwesenheit des pUS3. Die Proteine pUL29 und pUL42 traten in mehreren Ladungsvarianten auf, wobei das pUL42 zusätzlich eine Größenvariante aufwies. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde ein SILAC-gestütztes Verfahren zur Quantifizierung der Expression von Fremdgenen in viralen Vektoren etabliert.
Teil 1: Pathogeninaktivierung: Es wurde ein neues Verfahren zur Pathogeninaktivierung mittels Proteomanalysen untersucht. Bei diesem wurden Proben von Kaninchenthrombozyten mit Riboflavin bzw. Psoralen inkubiert und mit UV-A Licht bestrahlt. Dadurch werden die in Pathogenen enthaltenen Nukleinsäuren unbrauchbar gemacht, wohingegen gezeigt werden konnte, dass die Plättchen kaum in ihrem Proteom und damit vermutlich in ihrer Funktionalität beeinflusst wurden. Teil 2: Thrombozytenalterung: Durch Apherese wurde an drei auf einander folgenden Tagen die in einem humanen Spender zirkulierenden Plättchen auf 80000/µl depletiert und anschließend Plättchen aus dem Vollblut mittels differentieller Zentrifugation gewonnen. Während der einsetzenden Nachbildung von Thrombozyten wurde das Proteom der Zellen mit den Ausgangswerten verglichen und so versucht, Alterungsmarker im Thrombozytenproteom zu finden.
Das aus antarktischem Meereis stammende und auch bei geringen Temperaturen schnell wachsende γ Proteobakterium Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125 (PhTAC125) ist ein Modellorganismus für kälteangepasste Bakterien und Enzyme. Zusätzlich ist es ein alternativer Expressionswirt für die lösliche Überproduktion von heterologen Proteinen, die in etablierten Expressionswirten zur Bildung von inclusion bodies neigen. Bisher sind bei PhTAC125 im Rahmen der Erforschung von Kälteanpassungsmechanismen bzw. der Optimierung des kälteangepassten Expressionssystems nur Teilaspekte der Physiologie, des Stoffwechsels und der Bioprozessoptimierung untersucht worden. Bis zum Beginn dieser Dissertation gab es kaum Experimente, die sich mit der dynamischen und nahezu ganzheitlichen Betrachtung der Veränderung zellulärer Zustände und des Stoffwechsels von PhTAC125 beschäftigt haben. Darüber hinaus sind trotz der Fortschritte bei der Etablierung von PhTAC125 als alternativer Expressionswirt die bisher erzielten Biomassekonzentrationen gering. Aus diesem Grund wurden in dieser Dissertation zur Untersuchung des Stoffwechsels die exponentielle Wachstumsphase sowie vergleichende Untersuchungen verschiedener Wachstumsphasen und zellulärer Kompartimente auf Basis der Proteomanalytik durchgeführt. Zusätzlich konnte mit Hilfe der Fed-Batch-Kultivierungstechnik die Biomassekonzentration im Vergleich zu den herkömmlichen Methoden deutlich gesteigert werden. Zur Untersuchung der Physiologie und des Stoffwechsels von PhTAC125 während des exponentiellen Wachstums wurde das Proteom analysiert. Neben den typischen stark exprimierten Kategorien der exponentiellen Wachstumsphase wie Protein- u. Nukleotidbiosynthese, Aminosäure- u. Kohlenstoffmetabolismus, stellten sich vor allem die Proteine des TonB abhängigen Transportsystems (TBDT), sowie der Kategorien Entgiftung und Coenzyme für PhTAC125 als wichtig heraus. Das TBDT ist wegen seiner hohen Abundanz im Proteom und seiner potentiellen Beteiligung am Transport von Proteinabbauprodukten für PhTAC125 ähnlich bedeutend wie die anderen Kategorien mit einer hohen Anzahl stark exprimierter Proteine. Auch die Proteine zum Schutz vor ROS (reactive oxygen species) und die der Biosynthesewege der Coenzyme sind besondere und bedeutende Merkmale von PhTAC125. Der ROS Schutz ist bei kälteangepassten Bakterien während des Wachstums bei geringen Temperaturen (≤ 20°C) mit erhöhter Sauerstofflöslichkeit und der damit verbundenen verstärkten ROS-Bildung essentiell. Die Verfügbarkeit der meisten Biosynthesewege der Coenzyme im Proteom von PhTAC125 ist ein besonderes Charakteristikum gegenüber vielen anderen Wasser- und Bodenmikroorganismen und kennzeichnet einen potentiellen Wachstumsvorteil. Zur vergleichenden Untersuchung der unterschiedlichen zellulären Kompartimente von PhTAC125 wurden 2D-Gelbilder des Cyto- und Periplasmas erstellt und gegenübergestellt. Das periplasmatische Kompartiment war wesentlich durch Signalpeptid-haltige Proteine des TBDT, Porine und periplasmatische Peptidasen und Chaperone charakterisiert. Die Untersuchung der Proteomsignaturen unter Nährstofflimitationsbedingungen basierte auf dem Vergleich der späten exponentiellen und stationären Wachstumsphase mit der exponentiellen Wachstumsphase. Beide Wachstumsphasen waren durch Kategorien mit hoher Anzahl an gering exprimierten Proteinen dominiert. Dabei handelte es sich vor allem um die Kategorien der Nukleotid-, Protein- und RNS-Biosynthese. Diese potentiell reprimierten Kategorien der späten exponentiellen und stationären Wachstumsphase waren in Verbindung mit der Limitation der meisten Aminosäuren ein deutlicher Hinweis auf die stringent response. In diesem Zusammenhang schienen die stärker exprimierten Proteine (TBDT, Porine, Peptidasen/Protease und PilQ) positiv durch die stringent response eguliert zu sein, um das Überleben unter Nährstofflimitationbedingungen zu garantieren. Bei der Bioprozessoptimierung zur Steigerung der Biomassekonzentration von PhTAC125 wurden zwei verschiedene FB-Strategien durchgeführt. Bei der ersten Strategie wurde eine komplexe Aminosäurequelle (Casamino Acids) als Substrat eingesetzt und über konstante oder exponentielle Substratzufütterungsprofile eine optische Dichte (OD) von 30 erreicht. Im Vergleich zu den bisherigen in der Literatur beschriebenen Bioprozessen von PhTAC125 wurde die finale Biomassekonzentration 3 fach erhöht. Bei der zweiten FB-Strategie wurde ein „definierteres“ Substrat bestehend aus Glycerol und Glutamat für die Fütterungslösung eingesetzt. Mit einer anfänglichen exponentiellen gefolgt von einer konstanten Fütterungsrate konnte die Biomassekonzentration (OD = 86) gegenüber den veröffentlichen Ergebnissen 8 fach gesteigert werden. Zusammenfassend konnten erste proteombasierte Aussagen zur Physiologie und zum Stoffwechsel von PhTAC125 getroffen und erste Bioprozessstrategien zur gezielten Biomassesteigerung entwickelt werden.
Staphylococcus aureus ist einer der bedeutendsten Erreger von Infektionen der Milchdrüse (Mastitis). In dieser Arbeit wurden 16 S. aureus-Isolate aus bovinen Mastitisinfektionen unterschiedlicher geografischer Herkunft umfassend charakterisiert, um tiefere Einblicke in die Wirtsspezifität von S. aureus zu erlangen. Das bovine Mastitisisolat S. aureus RF122, dessen Genomsequenz seit kurzem verfügbar ist, wurde zum Vergleich in die Studien einbezogen. Mittels Multilocus Sequence Typing wurde die klonale Verwandtschaft der Stämme analysiert und ihre Zugehörigkeit zu bestimmten Sequenztypen bzw. klonalen Komplexen ermittelt, von denen einige unter bovinen S. aureus-Isolaten weltweit sehr verbreitet sind.Zum Nachweis von virulenz- und resistenzassoziierten Genen, sowie regulatorischen und speziesspezifischen Markergenen wurde ein diagnostischer DNA-Microarray eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass das individuelle Profil der Isolate sehr stark variierte und sich selbst Stämme mit dem gleichen Sequenztyp in ihrem variablen Genom teilweise erheblich unterschieden. Nur 43 Gene, die u.a. für Hämolysine, Proteasen, Leukocidine kodieren, waren in allen Stämmen konserviert. Es wurde auch die Existenz einiger als bovin-spezifisch angesehener Gene, bzw. die Abwesenheit humanspezifischer Gene nachgewiesen. Zusätzlich wurde die Expression von Virulenzfaktoren mittels 2D-Gelelektrophorese und massenspektrometrischer Identifizierung analysiert. Wie erwartet unterschieden sich die extrazellulären Proteommuster der einzelnen Stämme stark. Nur zwölf sekretierte Proteine wurden (in unterschiedlicher Menge) von mindestens 80 % der bovinen Isolate gebildet, und bilden das sogenannte „Core-Exoproteom“. Auch Isolate mit nahezu identischer genetischer Zusammensetzung unterschieden sich z.T. erheblich in ihrem Exoproteom, was sehr gut mit der Transkription des Virulenzgenregulators RNAIII korrelierte. Weiterhin wurde die mitogene Wirkung der Kulturüberstände auf humane und bovine PBMC (mononukleäre Zellen aus peripherem Blut) untersucht. Dabei fiel auf, dass zwei Isolate, welche Gene der bovinen Pathogenitätsinsel SaPIbov trugen, bovine T-Zellen stärker als humane stimulierten, was auf wirtsspezifische Unterschiede in der Aktivität dieser Superantigene hindeutet. Schließlich konnten durch den Vergleich mit S. aureus-Isolaten aus humanen Infektionen bestimmte Proteine ermittelt werden, die häufiger mit einem bestimmten Wirt assoziiert sind. Die Variabilität in der Expressionshäufigkeit dieser Proteine könnte mit der Wirtsspezifität von S. aureus im Zusammenhang stehen. Als pathogener Mikroorganismus ist S. aureus hohen Konzentrationen an reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffspezies (ROS und RNS) ausgesetzt, die im Rahmen der unspezifischen Wirts-Immunantwort gebildet werden. Um das Verständnis über seine Anpassungsstrategien zu erweitern, wurden vier Substanzen, die oxidativen bzw. nitrosativen Stress verursachen, eingesetzt: Wasserstoffperoxid (H2O2), eine Vorstufe des stark toxischen Hydroxylradikals; Diamid, ein spezifisches Thiol-Oxidationsmittel, die Superoxidanion-generierende Substanz Paraquat, sowie der NO-Donor MAHMA NONOate. Für jeden Stressor wurden Proteomsignaturen durch Auftrennung der cytoplasmatischen Proteine mittels 2D-Proteingelelektrophorese und anschließender massenspektrometrischer Identifizierung erstellt. Die zu verschiedenen Zeitpunkten nach Stressauslösung neu synthetisierten Proteine wurden mittels L-[35S]-Methionin radioaktiv markiert und quantifiziert. Mindestens zweifach induzierte Proteine wurden als Markerproteine für einen bestimmten Stressor definiert. Durch Zugabe von 10 mM H2O2 wurden verstärkt Proteine synthetisiert, die an Synthese, Reparatur oder Schutz von Nukleinsäuren oder DNA beteiligt sind, was bestätigt, dass die DNA ein Hauptziel H2O2-induzierter Schädigung ist. Unter Einfluss von 10 nM Paraquat wurden Proteine mit sehr unterschiedlichen biologischen Funktionen, wie z.B. Aminosäuresyntheseenzyme und Cofaktoren, induziert. Der durch 1 mM Diamid induzierte Thiolstress führte wie erwartet zur verstärkten Neusynthese CtsR und HrcA-kontrollierter Chaperone und Proteasen, was auf die Akkumulation fehlgefalteter Proteine hindeutet, die höchstwahrscheinlich durch nichtnative Disulfidbrücken an den Thiolgruppen der Cysteinreste entstanden sind. Die Induktion von Peroxiredoxinen und einer Thioredoxinreduktase lassen auf ein gestörtes Redoxgleichgewicht in der Zelle schließen. Die Effekte von NO ähnelten denen, die auch unter Sauerstofflimitation beobachteten wurden. Viele Markerproteine sind in Glykolyse und Fermentation involviert und durch Nachweis der entsprechenden Fermentationsprodukte konnte eine höhere Aktivität fermentativer Stoffwechselwege bestätigt werden. Die Fähigkeit, unter Einfluss von NO auf anaeroben Metabolismus umzuschalten, könnte ein entscheidender Vorteil von S. aureus und essentiell für seine höhere Resistenz gegenüber NO sein.
Staphylococcus aureus ist ein ubiquitär verbreitetes Bakterium. Häufig als Kommensale des Menschen vorkommend, zählt das Bakterium jedoch zu einem der wichtigsten Infektionserreger des 21. Jahrhunderts. Neben lokalen Infektionen (z. B. Furunkel) kann der Erreger nach einer Besiedlung auch systemische Erkrankungen in seinem Wirt (z. B. Sepsis, Endokarditis, Pneumonie) hervorrufen. Die pathogene Wirkung von S. aureus ist auf die Produktion und Sekretion von Pathogenitäts- bzw. Virulenzfaktoren, unter anderem Superantigene, hämolytische Toxine, Gewebe-zerstörende Enzyme und Oberflächenproteine, welche ihrerseits mit dem Immunsystem des Wirtes interferieren, zurückzuführen. Ziel dieser Arbeit war unter anderem die Analyse des extrazellulären Proteoms von S. aureus RN1HG in pMEM, ein an das bakterielle Wachstum adaptierte Zellkulturmedium. Bei den extrazellulären Proteomanalysen von S. aureus RN1HG konnten 39 Proteine identifiziert werden, welche dem Bakterium eine Interaktion mit dem Wirt (Clumping-Faktoren) ermöglichen, die Phagozytose (Protein A) verhindern oder die Ausbreitung im Gewebe (alpha-Hämolysin, gamma-Hämolysin, Lipase) erleichtern. Da die Zusammensetzung des extrazellulären Proteoms durch diverse Regulons (z. B. agr-System, sarA, sigB) bestimmt wird, stellte sich die Frage, inwiefern diese einen Einfluss auf die Virulenz des Stammes RN1HG-Stamm haben. Ein vielfach in der Literatur diskutierter Regulator ist SigB. Die vergleichende gelfreie LC-MS/MS-Analyse des extrazellulären Proteoms von S. aureus RN1HG mit einer sigB Deletion (RN1HG delta sigB) zeigte, dass sich im Vergleich zum Wildtyp die Zusammensetzung des extrazellulären Proteoms nicht grundsätzlich ändert. Jedoch konnte durch eine „labelfreie“ Quantifizierung eine verstärkte Akkumulation zahlreicher Virulenzfaktoren (z. B. Aureolysin, 1-Phosphatidylinositol- Phosphodiesterase, alpha-Hämolysin, gamma-Hämolysin, Lipase, Thermonuklease) in der delta sigB Mutante nachgewiesen werden. Die Serin-Proteasen A, C und E konnten nur für die delta sigB Mutante identifiziert werden. Adhäsine, darunter Clumping-Faktoren oder Elastin-Bindeprotein, wurden lediglich während der exponentiellen Wachstumsphase für die delta sigB Mutante nachgewiesen. Dies konnte für clf auch durch Transkriptomanalysen belegt werden. Die gelfreien Analysen wurden durch gelbasierte Verfahren (2D-Gelelektrophorese) ergänzt. Neben der Erstellung einer Referenzkarte des extrazellulären Proteoms von S. aureus RN1HG (Wildtyp und delta sigB Mutante) wurden quantitative gelbasierte Daten erhoben, die einerseits die Ergebnisse der gelfreien Analysen bestätigten, andererseits aber auch zeigten, dass SigB nur wenig Einfluss auf die Prozessierung und posttranslationale Modifikation extrazellulärer Proteine in S. aureus RN1HG hat. Die Zusammensetzung des extrazellulären Proteoms ist vor allem bei pathogenen Bakterien bedeutsam, da z. B. durch extrazelluläre Enzyme die Erschließung von Nährstoffquellen in extremen Habitaten begünstigt und durch Virulenzfaktoren sowohl die Kolonisierung als auch die Überlebensfähigkeit im Wirtsorganismus gesichert wird. Um die Erreger-Wirt Interaktion näher zu charakterisieren, wurde die Reaktion von humanen bronchialen Epithelzellen (S9-Zellen) auf eine Infektion mit S. aureus RN1GH pMV158 untersucht. Die Durchführung der Infektionsstudien mit einem GFP-markierten RN1HG-Stamm ermöglichte die Sortierung der infizierten S9-Zellen durch die Durchflusszytometrie. Da im Epithelverband nicht jede Zelle mit S. aureus infiziert ist, lag der Vorteil der Sortierung darin, dass Proteomanalysen spezifisch für die S9-Zellen mit internalisierten Staphylokokken durchgeführt werden konnten. Infolge einer Internalisierung von S. aureus durch die S9-Epithelzellen kam es zunächst zu einer Integrin-vermittelten Adhäsion. Eine zunehmende Inkubation mit S. aureus führte zu inflammatorischen Prozessen. Die Invasion pathogener Bakterien in Wirtzellen führt somit zum Remodelling biologischer Prozesse, die dem Wirt die Auseinandersetzung mit dem Pathogen ermöglichen.
Infektionen durch Staphyloccocus aureus können aufgrund zunehmender Therapieresistenz (ca-MRSA, ha-MRSA, la-MRSA etc.) gravierende Verläufe nehmen und stellen nicht nur eine wachsende medizinische, sondern auch eine gesundheitsökonomische Herausforderung im Patientenmanagement dar. Für die Entwicklung innovativer Behandlungsstrategien ist die genaue Analyse der keimspezifischen Infektionsmechanismen eine wichtige Voraussetzung. S. aureus verwendet sogenannte Virulenzfaktoren um einen zunächst lokalen Infektionsherd zu etablieren. Wachstumsphasenabhängig werden z.B. Adhäsine, Kapselantigene oder Toxine exprimiert, um dann gezielt im Infektionsgeschehen eingesetzt zu werden. In den vergangenen Jahren konnten wichtige Fortschritte zur Ermittlung infektionsrelevanter stammspezifischer Regulationsmechanismen bei S. aureus gemacht werden. Ziel dieser Arbeit war zunächst eine Datengrundlage zur Untersuchung der Wirt-Erreger-Interaktion durch Proteomreferenzkarten von humanen S9-Epithelzellen zu schaffen. Zudem wurden die extrazellulären Expressionsmuster von S. aureus-Isolat NCTC8325-4 in verschiedenen Kulturmedien analysiert, um ein geeignetes Medium für die Kokultur der Wirts –wie auch der Erregerzellen entwickeln. Weiterhin sollte eine Proteomreferenzkarte der extrazellulären Proteinfraktion von S.aureus RN1HG erstellt werden, um eine anschließende Vergleichsanalyse der wachstumsphasenabhängigen Expressionsprofile zu ermöglichen. Zur Erstellung der Proteomreferenzkarten wurden die Proteingemische mit einer zweidimensionalen Gelelektrophorese (2D PAGE) aufgetrennt. Zuerst wurden die Proteine einer isoelektrischen Fokussierung unterworfen (IPG – Streifen 24cm für pI 4-7; 11cm u. 18cm für pI 6-11) und dann in der zweiten Dimension nach ihrer Größe mit 12,5% SDS Polyacrylamidgelelektrophorese separiert (Trennbereich 20 -120 kD). Die Proteinspots wurden mit verschiedenen Färbemethoden (Silbernitrat, kolloidales Coomassie Brillantblau oder Flamingo Fluoreszenzfärbung) dargestellt. Mit MALDI-TOF wurden die Proteine sequenziert und quantifiziert. Die gefundenen Sequenzen wurden durch Datenbanksuche (Mascot 2.0; SwissProt 55.1_human/all) identifiziert. Auf Wirtsseite sollten die humanen S9-Epithelzellen (CFTR repaired IB3-1) als Modell einer bakteriellen Atemwegskolonisation dienen, dabei wurden sie in MEM (mit 4% FCS, 1% NEAA (non essential amino acids) und 4 mM L-Glutamin) kultiviert. Auf der Erregerseite wurden die S. aureus - Isolate NCTC8325-4 (11-bp deletion in rsbU, cured of three prophages) und RN1HG (rsbU restored) (HG001; Herbert S. et al, 2010) verwendet . Proteomreferenzkarten für den pI Bereich pI 4-7 und pI 6-11 wurden für das Proteom der S9-Epithelzellen angefertigt. Es wurden 668 Einzelproteine (508 mit Proteinscore >55) identifiziert und funktionell via Datenbanksuche (www.pantherdb.org) charakterisiert. Somit können infektionsassoziierte Veränderungen im Proteinmuster der S9-Wirtszellen erkannt und valide ausgewertet werden. Um eine Kokultur für Internalisierungsversuche von S.aureus und den S9-Epithelzellen zu ermöglichen, wurde eine methodenoptimierende Kultivierungsreihe (MEM mit und ohne 5%FCS, RPMI 1640, TSB) mit dem Laborstamm NCTC8325-4 durchgeführt. Der Datenvergleich der extrazellulären Expressionsmuster trug zur Entwicklung eines geeigneten Kulturmediums (MEM mit 2mM AS supplementiert) bei. S. aureus RN1HG wurde in diesem Medium kultiviert und von der extrazellulären Proteinfraktion wurde eine Proteomreferenzkarte im Bereich pI 4-7 angefertigt. Es konnten 91 Einzelproteine (48 mit Proteinscore >55) identifiziert werden. Durch eine vergleichende Analyse konnten Veränderungen der Proteinmuster innerhalb verschiedener Wachstumsphasen (exponentiell, transient, stationär und spät stationär) detektiert und ein optimaler Erntezeitpunkt festgelegt werden. Während der exponentiellen Wachstumsphase waren typischerweise kolonisationsrelevante Proteine (LytM, SAOUHSC_02979, SceD), in der stationären Phase vorrangig invasionsrelevante (SsaA, IsaA, SspB) angereichert. Somit konnten charakteristische Expressionsmerkmale bei S. aureus RN1HG nachgewiesen werden, welche den weiteren Einsatz gemeinsam mit den S9-Epithelzellen ermöglichen (Schmidt F. et al., 2010).
Macrophages are cells of immune system and distributed throughout the body. They provide the first line of defense against microbial pathogen infections. Using bone marrow macrophages (BMMs) which derived from mice of strain BALB/c and strain C57BL/6, this study aimed to identify the changes in proteome of the macrophages due to IFN gamma stimulation and S. aureus infection. Two quantitative proteomic techniques, two-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) and liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) were applied in this study. The analysis results indicated that many proteins which play important roles in immunological functions of macrophages were changed due to IFN gamma stimulation and S. aureus infection. This study also identified the differences in proteome of macrophages derived from mice of strain BALB/c in comparing to macrophages of strain C57BL/6.
In the post genomic era, novel “Omics” technologies like genomics and proteomics can be used in powerful screening approaches to provide unbiased lists of candidate genes and proteins and thus facilitate a comprehensive analysis of complex diseases such as cancer, which would not have been possible applying traditional genetic and biochemical approaches alone. During my PhD tenure I applied functional genomics screening technologies including proteomics in combination with traditional biochemical and cell biology approaches in two disease oriented projects: 1. Characterization of the role of BCL11b in Human T cell lymphomas (and) 2. Elucidation of the mechanism of pathophysiology of Johanson Blizzard Syndrome using UBR1 knockout mice and JBS patients’ lymphoblasts cell lines.
1.Characterization of the role of BCL11b in Human T cell lymphomas
: The Bcl11b protein belongs to the C2H2-family of Krueppel-like zinc finger proteins and thus is a member of the largest family of transcription factors in eukaryotes. It was shown to be important for a variety of functions such as T cell differentiation, normal development of central nervous system and DNA damage response. Malignant T cells undergo apoptotic cell death upon BCL11B down-regulation. However, the detailed mechanism of this cell death is not fully understood. Two dimensional difference in-gel electrophoresis (2D-DIGE), mass spectrometry and cell biological experiments were employed to investigate the functional impact of knock down of BCL11B in malignant T cell lines such as Jurkat and huT78. To further confirm the findings of these experiments, changes in protein patterns were also recorded after down-regulation of BCL11B expression in Jurkat cells over expressing BcL-xL and in Jurkat cells over expressing BCL11B. These experiments provide evidence for the involvement of the mitochondrial apoptotic pathway and increased levels of cleavage fragments of known caspase targets such as myosin, spectrin and vimentin were observed after BCL11B knockdown. The findings suggest an involvement of ERM proteins, which were up-regulated and phosphorylated upon BCL11B down-regulation. Besides ERM proteins, PDCD5, a key regulator of apoptosis, was also found at increased levels upon down regulation of BCL11B. Moreover, the levels of several proteins implicated in cell cycle entry, including DUT-N, UCK2, MAT1, CDK6, MCM4 and MCM6 were elevated, which might lead to uncontrolled cell cycle progression, uracil misincorporation and cell death. Interestingly, an inverse regulation pattern, i.e. decreased levels of ERM proteins, DUT-N, UCK2 and PDCD5 was seen upon over expression of BCL11B in Jurkat cells. In summary, proteome analyses revealed several previously unidentified mechanisms which could significantly contribute to the cell death following BCL11B knockdown.
2.Elucidation of the mechanism of pathophysiology of Johanson Blizzard Syndrome using UBR1 knockout mice and JBS patients’ lymphoblasts cell lines
: Johanson-Blizzard syndrome (JBS; OMIM 243,800), which was first described in 1971, is a rare autosomal recessively inherited genetic disorder with a unique combination of congenital abnormalities. The most constant clinical feature of JBS is the loss of exocrine pancreatic function due to progressive destruction of pancreatic acini. Genome wide linkage analysis identified the disease associated locus in the 15q14-q21 chromosome region and high-throughput sequencing of this region revealed several truncated and some missense mutations in the UBR1 gene. UBR1 gene contains 47 exons and spans over 161 kilobases. The UBR1 protein belongs to the E3 ubiquitin ligase family and is an important component of the N-end rule pathway of ubiquitous protein degradation. It was hypothesized that stabilization of direct and unique substrates of UBR1 could be the main cause of the JBS pathophysiology. So far sequencing of the UBR1 gene is the only available diagnostic procedure. However, sequencing might not always allow precise prediction of residual UBR1 activity. Hence, this study was started to develop a protein based diagnostic assay for the detection of subclinical cases of JBS and to identify signalling pathways contributing to the pathophysiology of this complex disorder using a murine UBR1 knockout model. 2D-DIGE proteome analysis was carried out for a comparative evaluation of lymphoblast samples of 14 patients and 11 controls. Principal component Analysis (PCA) clearly discriminated JBS patients from controls. However, 4 JBS patients differed from the rest and resembled controls more closely. Western-blot analysis revealed residual UBR1 levels in these patients, which were linked to a milder phenotype. Hierarchical clustering of the three groups (controls, patients with residual UBR1 levels and patients without UBR1) showed group-specific characteristic differences in the abundance of differentially regulated proteins. Quantification of a panel of five selected protein spots encompassing Interferon-induced GTP binding protein, HLA class II histocompatibility antigen, Annexin A6, FK506-binding protein 4 and GRP78 permitted discrimination of controls and JBS patients with mild phenotypes. Of note, the molecular chaperones GRP78 (BiP) and FK506BP were consistently altered in level in JBS patients and probably constitute UBR1 dependent substrates. This suggested JBS as an ER-stress related disease also indicating a possible way of therapeutic intervention. Comparative proteome analysis of UBR1 knockout and wild type animals after caerulein treatment revealed a significant accumulation of pancreatic proteases such as chymotrypsin B, anionic trypsin and pancreatic elastase in animals lacking UBR1. Furthermore, an up-regulation of ER-stress proteins and inflammation related proteins was observed. Phenotypic characterisation revealed in UBR1 knockout animals significantly increased lipase levels, a significantly increased histological score and significantly increased elastase activity 8h after the onset of pancreatitis. In isolated pancreatic acini of UBR1 knockout animals we found a significant increase in intracellular elastase activation upon supramaximal CCK stimulation, which was associated with a significant rise in the rate of necrosis explaining the more severe phenotype in the UBR1 knock-out animals. A TUNEL assay showed that there was more apoptosis in wild type compared to UBR1 knockout mice. Another set of experiments was designed to identify physiologically important substrates of UBR1. Inhibition of such substrates might then in turn allow reversion or prevention of the severe form of pancreatitis in UBR1 knockout mice. However, using the trypsin specific and reversible inhibitor S-124 it was shown that impaired trypsin degradation and thereby prolonged activation of this protease did not critically influence the phenotype. Calcium analysis after physiological stimulation revealed an increase of pathological Ca2+ signalling events, i.e. significant decrease of spike number and significant increase of spike duration. Of the candidates potentially influencing Ca2+ signalling RGS4 turned out to be of particular importance. Pre-incubation of pancreatic acini of UBR1 knockout animals with a specific RGS4 inhibitor (CCG-4986, 10 µM) normalized Ca2+ patterns, did not affect trypsin activity itself but prevented Ca2+-triggered premature trypsin activation and thus acinar disintegration. In summary, using lymphoblasts samples of JBS patients we were able to deduce a protein panel which could be developed as a possible diagnostic tool for confirmation of JBS syndrome. Furthermore, using UBR1 knockout mice in an experimental model we were able to elucidate the vital function of UBR1 and its direct substrate RGS4 in the defense against pathologic pancreatic damage thereby manifesting JBS as an inflammatory disorder due to an inadequate UBR1 mediated defense.
In der vorliegenden Arbeit wurde das Proteom von Seminomen mit dem von nicht-neoplastischem Hodengewebe von 6 Patienten vergleichend analysiert. Ziel der Arbeit war die Ermittlung von Expressionsunterschieden zwischen Tumorgewebe und gesundem Gewebe auf Protein-Ebene. Zur Auftrennung der Proteine und Darstellung des Proteoms wurde die zweidimensionale Gelelektrophorese angewandt. Diese erlaubt eine Trennung der Proteine nach ihrem Molekulargewicht und ihrem isoelektrischen Punkt. Mit den hier verwendeten Gelen wurden Proteine im Molekulargewichtsbereich von ca. 10-200 kDa und einem isoelektrischen Punkt zwischen 4 und 7 erfasst. Die Darstellung der Proteine erfolgte durch Silber- und Fluoreszenzfärbung. Die Bearbeitung und Auswertung der Proteinmuster erfolgte mit der Software Delta 2D (Decodon). Bei 5 von 6 Patienten fand sich ein Protein, welches im Seminomgewebe geringer exprimiert war als im gesunden Hodengewebe. Das Protein wurde massenspektroskopisch mittels MALDI-MS analysiert und als GSTM3, Glutathion-S-Transferase der Mu-Klasse, identifiziert. Glutathion-S-Transferasen sind multifunktionelle Enzyme des Phase-Il-Stoffwechsels und spielen eine wichtige Rolle bei der Eliminierung von Karzinogenen und Xenobiotika. Eine verminderte Expression von GST-Isoformen der Mu-Klasse in Seminomen wurde in der Literatur bereits beschrieben, jedoch ohne Angabe der GST-Isoformen. Diese Arbeit berichtet erstmalig von einer verminderten Expression der GSTM3-Isoform in Seminomgeweben. Auch die Menge an GSTM3-mRNA korrelierte mit den Proteindaten. Durch semiquantitative RT- PCR konnte das Ergebnis somit auf Transkriptionsebene bestätigt werden.