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Chemistry and biology of Phenolics isolated from Myricaria germanica (L.) Desv. (Tamaricaceae)
(2014)
In accordance with the recent worldwide interest in plant phenolics, which emerges from their broad range of biological activities, particular emphasis has been focused, in the present thesis, on the constitutive phenolics of the extract of Myricaria germanica (L.) Desv. (Tamaricaceae). During the current thesis twenty phenolics (1 – 20) were isolated and identified from the aqueous/ethanol extract of the whole Myricaria germanica plant. The isolates include four hitherto unknown natural phenolics (2, 10, 12 and 20). Also, the cytotoxic activities of M. germanica extract, column fractions, and one new natural isolate against three different solid tumor cell lines, namely, breast cancer (MCF-7), prostate (PC-3), and liver (Huh-7) cancer cell using SRB viability assay have been investigated and first insights into mode of action have been obtained.
Durch die vorliegende Arbeit wurde die Relevanz moderner Ansätze in der fragmentbasierten Leitstrukturentwicklung für den Erfolg und die Sicherheit in der Arzneistoffentwicklung aufgezeigt. Neben den theoretischen Grundlagen konnte die praktische Anwendung molekularer Vielfalt mit Hilfe komplementärer Substanzbibliotheken vielfach direkt den resultierenden Nutzen aufzeigen. Dabei galt das Interesse speziell antiproliferativen Zielstrukturen, mit besonderem Schwerpunkt auf der Hemmung der Glutathionperoxidase. Des Weiteren unterstützten in silico-Methoden eine zielgerichtete Arbeitsweise. Durch die Optimierung des GPx 1-Testsystems konnte eine zuverlässige in vitro-Analytik etabliert werden. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass mit Hilfe der angestellten Untersuchungen die erfolgreiche Entwicklung, Optimierung und Evaluierung mehrerer Leitstrukturen für diverse Zielproteine der Tumortherapie aufgezeigt werden konnte. Es wurden zunächst die Fortschritte auf dem Gebiet der fragmentbasierten Leitstrukturentwicklung über multifunktionale Screeningbibliotheken zusammengefasst und bewertet (Publikation 1). Die vorgestellten Ansätze, wie Halogenbindungen und sp3-Reichtum, fanden in den folgenden Publikationen zu einem Großteil praktische Anwendung. Die Synthese einer umfangreichen Acylhydrazonbibliothek führte zum Ausbau der inhibitorischen Aktiviät gegenüber der bovinen GPx 1 (Publikation 2). Der kombinatorische Syntheseansatz erbrachte eine Vielzahl eng verwandter Analoga, die entgegen der Erwartungen leider kaum Erkenntnisse über SAR erbrachten. Zudem erwiesen sich die angewandten Docking-Studien als irreführend, da keinerlei Korrelation zu den in vitro-Ergebnissen erkennbar war. Dennoch konnte mit den angestellten Untersuchungen ein stabiler Enzymassay etabliert werden, der eine zuverlässige Analyse zukünftiger Produkte unterstützt. Langfristig wäre für Aussagen über quantitative SAR die gezielte Optimierung anhand einer Kristallstrukturanalyse erforderlich. Alternativ wurden bereits erste NMR-Versuche mit Sättigungstransfer-Differenz (STD)-Spektroskopie angestellt, die sich jedoch aufgrund der schlechten Löslichkeit der Acylhydrazone als schwierig erwiesen. Weiterhin wurde Misonidazol als Inhibitor der GPx 1 einer Neubewertung unterzogen (Publikation 3). Während racemisches Misonidazol nach früheren Berichten die Aktivität muriner GPx 1 bei 500 µM signifikant reduzierte, zeigte die in vitro-Testung der reinen Enantiomere gleicher Konzentration an boviner GPx 1 keine inhibitorische Wirkung. Von wissenschaftlichem Nutzen war zudem die Erkenntnis über einen schwachen, aber nachweisbar signifikanten Synergismuseffekt des Racemats verglichen mit den isolierten Enantiomeren. Die ergänzende Beschreibung dieser noch wenig untersuchten Wirkungspotenzierung liefert einen Beitrag zum gesamtheitlichen Verständnis dieses Phänomens. Alle synthetisierten Endstufen sowie ausgewählte Zwischenstufen wurden in einer öffentlich zugänglichen Screeningplattform, dem FMP in Berlin, hinterlegt (Publikation 4). Sie haben als Gemeinsamkeit eine ausgeprägte Reaktionsbereitschaft, wodurch in zukünftigen biologischen Screenings eine gezielte oder auch zufällige Entdeckung neuartiger Interaktionen nicht abwegig ist. Die nukleophilen Verbindungen 1, 2, 4 und 5 könnten mit basischen Aminosäuren, wie dem Histidin der Serinproteasen, oder mit Metalloenzymen wechselwirken, während durch die gezielte Elektrophilie von 3 kovalente reversible Bindungen mit Cysteinresten und deren Selen-Analoga zu erwarten sind. Der Beitrag fragmentbasierter Substanzbibliotheken zur Leitstrukturentwicklung konnte am Beispiel der 4-Amidocyclopentan-1,3-diole gezeigt werden (Publikation 5). Ausgehend von acht trisubstituierten Cyclopentan-Templaten konnte die Synthese von achtzig Produkten mit zum Teil potenter Wirkung gegen mehrere Tumor-Zelllinien beschrieben werden. Die Substanzbibliothek dieser Studie demonstriert den Einsatz moderner Methoden zur Bereitstellung von Werkzeug für offene Fragen der Molekularbiologie aus einem bisher zu wenig bearbeiteten Bereich des chemischen Strukturraums. Mit Hilfe von in silico-Untersuchungen gelang eine gezielte Synthese neuartiger Inhibitoren NAD+-abhängiger Histondeacetylasen (Publikation 6). Die resultierende Klasse N1-substituierter Benzimidazolthione zeichnete sich durch erhöhte physiologische Stabilität gegenüber der Leitstruktur Splitomicin aus. Obgleich eine vollständig selektive Inhibition zwischen den Sirtuinen 1–3 nicht erreicht wurde, gelang durch die Anwendung computergestützter Methoden die Synthese eines potenten Inhibitors mit selektiver Wirkung gegen Sirtuin 1 und 2, dessen Grundgerüst als Leitstruktur weiterer Untersuchungen dienen kann.
In der modernen Augenheilkunde werden Injektionen und Implantate in periokulare Regionen oder direkt in den Glaskörper injiziert. Bei der Entwicklung neuer ophthalmologischer Implantate und Injektionen ist die In vitro-Testung der Wirkstofffreigabe und -verteilung von großer Bedeutung. Dabei stellen viele Testmethoden die In vivo-Situation nicht ausreichend dar. Einerseits bilden die Gewebe des Auges wie beispielsweise die Konjunktiva oder die Sklera Barrieren für den Transport des Arzneistoffes zum Wirkort. Andererseits ist der Einfluss der Gefäßsysteme von Konjunktiva und Choroidea auf die Verteilung und Elimination des Arzneistoffes zu berücksichtigen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Gewebe des Auges hinsichtlich ihrer Permeabilitätseigenschaften untersucht. Als Ergebnis wurden die Permeabilitätskoeffizienten von Ciprofloxacin, Lidocain, Timolol und Dexamethason für die Sklera, Konjunktiva, Kornea, den Retina-Choroidea-Komplex sowie für Kombinationen der aufgezählten Gewebe des Schweineauges erhalten. Als weitere Tiermodelle finden Gewebe von Rinder- und vor allem Kaninchenaugen in der ophthalmologischen Forschung Anwendung. Aus diesem Grund wurden die Permeabilitätsstudien um die Membranen dieser zwei Spezies erweitert. Der Interspezies-Vergleich zeigte sehr große Unterschiede in den Permeabilitäten der Wirkstoffe durch die Gewebe auf, sodass die direkte Übertragbarkeit von Ergebnissen zwischen den Tieren und auf den Menschen nicht gewährleistet ist. Um die Barriere-Eigenschaften der Augengewebe in ein In vitro-Modell zu integrieren wurden synthetische Membranen, die mit den Permeabilitätseigenschaften der Gewebe des Schweineauges übereinstimmen, identifiziert. Diese Membranen wurden zur Simulation der natürlichen Gewebe des Auges in den Mittelteil der neu entwickelten Zwei-Kanal-Durchflusszelle eingespannt. Die Zwei-Kanal-Durchflusszelle besteht aus drei Teilen, wobei die zwei äußeren Akzeptor-Kompartimente je einen Flusskanal, der mit Ringer-Puffer perfundiert wird, enthalten. Durch Etablierung physiologischer Flussraten entlang der korrespondierenden Membranen wurde der konjunktivale und choroidale Blutfluss und somit die Permeabilitäten der Gewebe als auch der Einfluss der Blutgefäße zusammen in einem In vitro-Modell berücksichtigt. Um den Einfluss der Strömungsgeschwindigkeit in den Flusskanälen und des osmotischen Verhältnis zwischen Probe und Perfusionsmedium auf die Wirkstoffverteilung im System zu untersuchen, wurde eines der zwei Akzeptor-Kompartimente durch eine für Puffer und Wirkstoff undurchlässige Scheibe dicht verschlossen, sodass der Stofftransport nur in eine Richtung sattfinden konnte. Die Ergebnisse zeigten einen bedeutenden Einfluss dieser beiden Parameter auf die Wirkstoffverteilung. Bei Zuschaltung des zweiten perfundierten Akzeptor-Kompartiments der Zwei-Kanal-Durchflusszelle treten zwischen den Kompartimenten vermutlich Kräfte wie zum Beispiel Querströmungen und hydrostatische Druckgefälle auf. Basierend auf den erhaltenen Verteilungskurven der Wirkstoffe in der Zwei-Kanal-Durchflusszelle kann reine konzentrationsgesteuerte Diffusion durch die Membranen als alleiniger Transportmechanismus ausgeschlossen werden. Die beschriebenen Effekte müssen vor der Etablierung der Zwei-Kanal-Durchflusszelle als biorelevante In vitro-Methode für die Charakterisierung von periokularen Injektionen und Implantaten in weiteren Arbeiten durch Änderungen des Modelldesigns behoben werden. Neben den peripheren Geweben des Auges dient der Glaskörper als Applikationsort für Injektionen makromolekularer Arzneistoffe und Implantate, die den inkorporierten Arzneistoff über einen längeren Zeitraum freigeben. Die intravitreale Freisetzung und Verteilung des Wirkstoffes ist für den therapeutischen Effekt von entscheidender Bedeutung. Um diese Prozesse in vitro zu charakterisieren wurde das Glaskörper-Modell entwickelt. Die Form und das Volumen des kugelförmigen Glaskorpus sind an die Geometrie des menschlichen Glaskörpers angepasst. Als Substitut für den natürlichen Glaskörper wurde ein Polyacrylamid-Gel modifiziert, sodass dieses in ausgewählten physiko-chemischen Eigenschaften dem natürlichen Glaskörper entspricht. Nach der Applikation des Wirkstoffes direkt in den Glaskörper muss dieser durch passive oder aktive Transportprozesse an den Wirkort im hinteren Augenabschnitt gelangen. Dabei wird die Wirkstoffverteilung im Glaskörper durch die Augenbewegung maßgeblich beeinflusst. Die Simulation verschiedener Augenbewegungen wurde mit der Entwicklung des Eye Movement Systems in ein In vitro-Modell umgesetzt. Das System ist in der Lage Geschwindigkeiten und Amplituden von langsamen bis schnellen Folgebewegungen, Sakkaden und Mikrosakkaden des Auges nachzuahmen. In die zentrale Halterung des Eye Movement Systems kann das Glaskörper-Modell integriert werden. Die Kombination aus Eye Movement System und Glaskörper-Modell bietet die Möglichkeit den Einfluss der verschiedenen Augenbewegungen auf das Freisetzungs- und Verteilungsverhalten von intravitrealen Injektionen und Implantaten zu untersuchen. Nach erfolgreicher Inbetriebnahme der beiden Systeme wurden Verteilungsstudien mit Modellarzneistoffen verschiedener Molekularmassen durchgeführt. Die Ergebnisse der Studien zeigten, dass das Molekulargewicht im vollständig mit Gel gefüllten Glaskörper-Modell Einfluss auf die Geschwindigkeit der vermuteten Umverteilungsprozesse im Glaskörper-Substitut hat. Mit zunehmendem Anteil der flüssigen Phase im Glaskörper-Modell unterschieden sich die erhaltenen Verteilungen zwischen den Versuchen mit und ohne Bewegung deutlich. Bei der Simulation der hinteren Glaskörperablösung besitzt die Bewegung des Modells einen essentiellen Effekt auf die Konvektions- und Umverteilungsprozesse im Glaskörper-Modell. Durch das Ersetzen prozentualer Anteile des Gels durch Ringer-Puffer konnten Bedingungen der hinteren Glaskörperablösung simuliert werden. Die Simulation des Alterungsprozesses bewirkte eine Zunahme der Konvektion im Glaskörper-Modell. Als Folge resultierte eine deutlich schnellere Umverteilung der injizierten Modellarzneistoffe. Die hintere Glaskörperablösung besitzt demzufolge einen großen Einfluss auf die Verteilung und darf in In vivo- und In vitro-Studien nicht vernachlässigt werden. Mit der Zwei-Kanal-Durchflusszelle und der Kombination aus Eye Movement System und Glaskörper-Modell sind Konzepte für die Charakterisierung von periokularen und intravitrealen Arzneiformen entwickelt worden. In den Modellen wurde besonderer Wert auf die Anlehnung an die In vivo-Situation gelegt. Durch die Berücksichtigung der okularen Blutflüsse, die Simulation der Permeabilitätseigenschaften bestimmter Gewebe des Auges durch entsprechende synthetische Membranen, die Etablierung verschiedener Arten der Augenbewegung und der Simulation des Glaskörpers durch das Polyacrylamid-Gel wurden biorelevante Voraussetzungen geschaffen, die bisher in keinen anderen In vitro- Modellen zu finden sind. Vor der Etablierung der Zwei-Kammer-Durchflusszelle sind weitere Maßnahmen zur Unterbindung der physikalischen Störfaktoren nötig. Der theoretische Ansatz der Zwei-Kammer-Durchflusszelle konnte noch nicht in die Praxis umgesetzt werden. Unter Verwendung des Eye Movement Systems und des Glaskörper-Modells wird eine kostengünstige, einfache und schnelle Charakterisierung neuartiger intravitrealer Injektionen und Implantate unter In vitro- Bedingungen möglich. Die methodische Etablierung des Eye Movement Systems ist erfolgt. Durch weitere Modifikationen kann das System in Zukunft noch näher an die In vivo-Situation herangeführt werden.
Non-thermal atmospheric pressure plasma has drawn more and more attention to the field of wound healing research during the last two decades. It is characterized by a unique composition, which includes amongst others free radicals, ions and electrons. Furthermore, non-thermal plasma exhibits temperatures that are below those inducing thermal cell damage. Next to its well-established anti-bacterial properties, plasma can have lethal as well as stimulating effects on mammalian cells. Therefore, the medical application of non-thermal plasma on chronic wounds seems to be a promising tool to enable healing processes. However, less is known about the plasma-mediated induction of intracellular signaling pathways in human immune cells, which play a leading part in the process of wound recovery and removal of pathogens. Therefore, this thesis examined the cellular effects of a non-thermal atmospheric pressure plasma treatment on human immune cells using the argon plasma jet kinpen 09. Here, the CD4+ T helper cell line Jurkat, the monocyte cell line THP-1 as well as the corresponding primary cells were investigated. First, cell survival and apoptosis induction was assessed in response to non-thermal plasma treatment by growth curves and flow cytometric assays. On the one hand it could be shown that primary cells are more susceptible to plasma treatment than the respective cell lines. On the other hand, monocytes responded less sensitive to plasma exposure than lymphocytes. Furthermore, this thesis outlined the impact of non-thermal plasma treatment on the gene expression level of immune cells. Therefore, DNA microarray analysis was performed with the cell lines Jurkat and THP-1. It became obvious that plasma exposure modulated the expression of several genes in both cell types. Differential expression of distinct target genes was further validated by quantitative PCR in the immune cell lines. Here, elevated gene expression levels of JUN and FOS in Jurkat cells and increased transcription of JUND in THP-1 cells in response to plasma treatment were made visible. JUN, FOS and JUND are components of the transcription factor AP-1, which is involved amongst others in gene expression of IL-8 and HMOX-1. Consequently, transcriptional induction of the inflammatory cytokine IL-8 as well as the enzymes HMOX-1 and GSR was detected in plasma-treated THP-1 cells. In addition, alterations in the protein activation levels were analyzed in plasma-treated Jurkat, THP-1 cells and primary monocytes. Since some of the identified target genes are known to be associated with the MAPK pathways, the regulation of these cascades was further investigated by western blot analysis. In all investigated cell types the pro-proliferative signaling molecules ERK 1/2 and MEK 1/2 as well as the pro-apoptotic signaling proteins p38 MAPK and JNK 1/2 were activated in a plasma treatment time dependent manner. In contrast to Jurkat and primary monocytes, the anti-apoptotic HSP27 was only induced in THP-1 cells in response to plasma exposure. Moreover, modulation of cytokine production and secretion was examined in the different immune cell types and co-cultured THP-1 and HaCaT keratinocytes by ELISA or flow cytometry. While Jurkat cells showed no plasma-mediated regulation of cytokine expression, THP-1 cells revealed an increased IL-8 secretion after long plasma time duration (360 s). Additionally, the intracellular expression levels of IL-6 and IL-8 were modulated in primary monocytes by plasma exposure. While short plasma treatment caused no alteration of the number of cells expressing IL-8 an up-regulation of the intracellular IL-6 level occurred after 30 s of plasma treatment. Long plasma treatment times resulted in a significant decrease of the intracellular IL-8 and IL-6 production levels. Furthermore, co-cultured THP-1 and HaCaT cells as well as mono-cultured THP-1 and HaCaT cells were examined regarding their cytokine secretion profile. Here, cells treated with plasma (180 s) as well as LPS and plasma (180 s and LPS) were compared with untreated cells. IL-6, IL-8 and GM-CSF secretion was induced by both plasma and plasma combined with LPS treatment in mono-cultivated HaCaT cells and co-cultured cells. Though, the highest cytokine secretion levels were reached in the plasma and LPS exposed co-culture. In contrast, mono-cultivated THP-1 cells only showed an increased secretion of IL-6, IL-8 and TNFa after incubation with plasma together with LPS exposed medium. In conclusion, this study revealed for the first time the non-thermal plasma-modulated expression of numerous genes and cytokines and the activation state of various signaling cascades in human immune cells. Thus, it contributes to gain a better understanding of the immune-modulatory impacts of plasma that might promote the wound healing process.
In der vorliegenden Arbeit sollten zwei verschiedene Wirkstoffklassen auf ihre Fähigkeit Apoptose und Autophagozytose zu aktivieren analysiert werden. Dabei wurden 39 Sigma-Rezeptor-Liganden, die an der Universität Münster (Arbeitsgruppe von Prof. Bernhard Wünsch) synthetisiert wurden, zunächst auf ihre antiproliferativen Eigenschaften in acht humanen Krebszelllinien untersucht. Anhand der Struktur-Wirkungs-Beziehungen konnte gezeigt werden, dass sich große, raumfüllende Substituenten an beiden N-Atomen des Piperazin-Grundgerüstes positiv auf die Hemmung des Zellwachstums auswirken. Da die Multiple Myelom Zellinie RPMI 8226 eine hohe Dichte an Sigma-Rezeptoren exprimiert, wurde sie für weitere Versuche herangezogen. Als repräsentative Liganden wurde das Enantiomerenpaar (S)-11 und (R)-11 für weitere Versuche ausgewählt, da es neben einer guten Affinität zu beiden Rezeptor-Subtypen auch antiproliferierende Eigenschaften in der RPMI 8226-Zelllinie zeigte. Die Behandlung führte zur zeitabhängigen Induktion der Apoptose, die mit den typischen Charakteristika wie morphologische Membranausstülpungen, Annexin-V positive Zellen und der Chromatinkondensation einherging. Die Detektion von aktivierter Caspase-3, -8 und -9 im Durchflusszytometer deutete zunächst auf eine Beteiligung beider Signalwege der Apoptose hin. Da im Western Blot keine Caspase-9-Spaltprodukte detektiert werden konnten und auch die Vorinkubation mit den Caspase-Inhibitoren z-VAD-FMK und M50054 keinen Effekt auf die Apoptoserate bewirkte, scheinen die Caspasen im Sigma-Ligand-vermittelten Zelltod eine untergeordnete Rolle einzunehmen. Die frühe Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials verbunden mit der zunehmenden Konzentration des Apoptose-induzierenden Faktors (AIF) im Zytosol der RPMI 8226-Zellen deuten ebenfalls auf eine Caspase-unabhängige Form der Apoptose hin, die besonders für Sigma(2)-Agonisten bereits beschrieben ist. Und auch in diesem Projekt zeigen die Sigma-Liganden zytotoxische Aktivitäten, wenn sie eine Affinität zum Sigma(2)-Rezeptor aufweisen. Neben der Apoptose konnten (S)-11 und (R)-11 auch die Autophagozytose induzieren. Dieser Prozess scheint jedoch der Apoptose nachgeschaltet zu sein und weist darauf hin, dass es sich nicht um einen Schutzmechanismus der Zelle handelt, sondern eher in einer direkten Form des programmierten Zelltodes vom Typ II begründet ist. Dieser ist bisher noch nicht für Sigma-Rezeptor-Liganden beschrieben und könnte einen Vorteil gegenüber anderen Vertretern dieser Wirkstoffklasse darstellen. Eine Gemeinsamkeit von Sigma-Ligand-induzierter Apoptose und Autophagozytose liegt in ihrer Aktivierung durch die Lipidperoxidation. Es wurde ein sehr früher Anstieg von LPO-Produkten detektiert, der sich nur durch das lipophile Antioxidans alpha-Tocopherol beeinflussen ließ. Desweiteren konnte die antiproliferierende Wirkung von (S)- 11 und (R)-11 im MTT-Assay komplett blockiert werden, und auch die Apoptoseraten wurden durch den Radikalfänger signifikant erniedrigt. Die Hemmung der LC3-II-Expression im Western Blot durch alpha-Tocopherol verdeutlicht auch hier die Beteiligung der LPO an der Autophagozytose. Als Vertreter einer weiteren Wirkstoffklasse wurde der phtoaktivierbare Pt(IV)-Komplex FM 165, der in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Peter Sadler (Universität Warwick, UK) synthetisiert wurde, untersucht. Die antiproliferierenden Eigenschaften der photoaktivierbaren Pt(IV)-Verbindung können nicht mit der Apoptose als Zelltodmechanismus begründet werden. In diesem Fall ließen sich keine morphologischen Charakteristika nachweisen und auch die Annexin-V Anfärbung fiel negativ aus. Die weiteren Untersuchungen zeigten jedoch auch die Aktivierung der Autophagozytose durch Expression von LC3-II und p62 im Western Blot. Eine Hemmung lysosomaler Enzyme durch die Protease-Inhibitoren E64d und Pepstatin A führte zu erhöhten LC3-II-Konzentrationen sowie einer p62-Akkumulation. Im Gegensatz zu den Sigma-Rezeptor-Liganden deutet dies eher auf eine vollständige Verlaufsform hin. Da die Autophagozytose bereits nach 6 h-Behandlung mit FM 165 detektiert wurde, ist es nicht ausgeschlossen, dass es sich zunächst um eine zellschützende Funktion handeln könnte. Auch beim FM 165 scheinen oxidative Vorgänge eine wichtige Rolle hinsichtlich der Autophagozytose-Aktivierung zu übernehmen. Nach erfolgter Photoaktivierung der Zellen ließen sich ansteigende ROS Konzentrationen verzeichnen, die nach 2 h deutlich wurden und somit noch vor der Autophagozytose entstehen.
Ein Netzwerk aus Rezeptoren und Signalkaskaden reguliert Wachstum, Differenzierung und Überleben von Zellen. Wird dieses Netzwerk aus dem Gleichgewicht gebracht, können die Zellen zu Tumorzellen transformieren. Der epidermale Wachstumsfaktor Rezeptor (EGFR) stellt eine treibende Kraft in diesem Netzwerk dar und ist ein Ziel zahlreicher Tumortherapeutika. Aufgrund weitläufiger Resistenzbildung ist die Identifizierung verantwortlicher Strukturen von großer Bedeutung um die entarteten Signalkaskaden synergistisch einzudämmen. Nach Aktivierung des EGFR wird eine signalspezifische Antwort durch Rekrutierung von Adapterproteinen an die intrazelluläre Domäne initiiert. Die veränderte Zusammensetzung der Signalproteine könnte Angriffspunkte für neue Therapieansätze enthüllen. Um die zugrundeliegenden Mechanismen zu entschlüsseln, wurden mehrere Proteom-Untersuchungen auf Zelllysate angewendet. Ungeachtet der Sensitivität moderner Geräte stellt die Identifizierung niedrig-abundanter Proteine im Proteom einer Zelle jedoch eine Herausforderung dar. Die Identifizierung differentieller Proteinmuster des EGFR-Interaktom in Abhängigkeit von Resistenz und Rezeptor variante war das Ziel dieser Arbeit. Der EGFR samt seiner Interaktionspartner wurde aus Zelllysaten präzipitiert. Anschließend wurden die Proteine in einer SDS-PAGE aufgetrennt und nach in-Gel-Verdau mit LC-MS/MS analysiert. Aus Lysaten von A431-Zellen wurden 183 Proteine in vier Bioreplikaten detektiert. Darunter 15 direkte Interaktionspartner, wie GRB2, SHC1, SOS1/2, STAT1/3, AP2 sowie P85B. Die Berechnung des normalized spectral abundance factor (NSAF) anhand der Anzahl gemessener Spektren und der Molekularmasse eines Proteins ermöglichte eine relative Quantifizierung der Proteinmenge. Die Menge der copräzipitierten Proteine war nach EGFR-Aktivierung durch EGF für 14 Proteine mehr als zweifach erhöht. Davon waren Untereinheiten des AP2 Komplexes am stärksten an aktivierten EGFR assoziiert. Abschließend wurde die Interaktion mit AP2 und die neu aufgedeckte Interaktion mit CIP2A durch Immunfluoreszenz und Western Blot-Analyse bestätigt. Nachdem die Funktionalität der Methode gezeigt werden konnte, wurde die Anwendung um das Modell einer akuten Afatinib-Resistenz erweitert. Im A431-Zellmodell wurde durch die Inkubation in Fibroblasten-konditioniertem Medium eine Resistenz gegen Afatinib beobachtet. Im Rahmen dieser Arbeit sollte ermittelt werden, ob sich der Einfluss der temporären Resistenz am Interaktionsmuster des EGFR widerspiegelt. Die MS-Analyse identifizierte 145 Proteine deren Assoziation an EGFR durch Afatinib mindestens zweifach verringert wurde, darunter GRB2, SOS1, SHC1, STAT2/3 sowie PK3CB und P85B. Aus dieser Analyse wurde ein Pool aus 137 Proteinen ermittelt, die potentiell Teil des induzierten Resistenzmechanismus sein könnten. 32 Proteine, darunter TNAP2, AHNK, SPTCS und der Tumorsuppressor DIDO, weisen funktionelle Ähnlichkeit zu Lungenkrebs auf. Daraufhin wurde die Methode auf das Modell einer chronisch erworbenen Resistenz der Lungenkarzinom-Zelllinie HCC4006 gegen Erlotinib angewendet. Die Analyse sollte zunächst differentielle Proteinmuster des Grundzustandes in Abhängigkeit zur erworbenen Resistenz identifizieren. Die Morphologie der Erlotinib-resistenten HCC4006-Zellen weist Merkmale einer EMT auf, die als Resistenzmechanismus für verschiedene Tumore beschrieben ist. Im Einklang mit dieser Beobachtung wurden Hinweise auf rege Veränderungen des Zytoskeletts in der vorliegenden MS-Analyse der resistenten HCC4006-Zellen gefunden. In unbehandelten Zellen wurden abhängig vom Resistenz-Status der Zellen 178 Proteine mit mindestens zweifach veränderter Assoziation an EGFR detektiert. Darunter fanden sich die Proteine der Zytoskelettreorganisation Plectin, Spectrin und ZO1, welche in resistenten Zellen bis zu 70 fach erhöht waren. Das Angiogenese-Protein Nostrin ist hingegen nach Resistenzentwicklung stark vermindert. Nach Behandlung mit Erlotinib und EGF war die Assoziation von 148 Proteinen durch Erlotinib Resistenz verändert. Darunter befanden sich HEAT1, EF1A1, UBS3B und AP3B1 die in sensitiven Zellen durch Erlotinib stärker dissoziierten als in den resistenten Zellen. Abschließend wurde die differentielle Analyse auf zwei EGFR VarianteIII (vIII) transfizierte Glioblastomzelllinien übertragen. In den P3-Zellen sind 95 Proteine in Abhängigkeit der Rezeptorvariante zweifach verändert an EGFR assoziiert. Darunter waren JAK1, GRB2, PRKDC und SNX-3, 17 und 27 vermehrt an vIII assoziiert, wohingegen PHB2 bevorzugt an Wildtyp-EGFR assoziiert. In den NCH421k Glioblastomzellen ist die Affinität für vIII bei 245 Proteinen zweifach verändert. Darunter die Phosphokinasen P85A und P85B mit stark erhöhter vIII-Affinität. Für vIII ist eine bevorzugte Initiierung des PI3K/AKT Signalweges, sowie eine konstitutive Aktivität bereits beschrieben. Mit dem Abschluss dieser Arbeit liegt ein Protokoll zur differentiellen Analyse der EGFR Interaktionsmuster vor