Refine
Year of publication
Document Type
- Doctoral Thesis (88)
- Article (46)
Is part of the Bibliography
- no (134)
Keywords
- - (37)
- ABC-Transporter (11)
- Pharmakokinetik (11)
- P-Glykoprotein (8)
- OCT1 (7)
- MRP4 (6)
- SLC22A1 (6)
- Glioblastom (5)
- Talinolol (5)
- Transportproteine (5)
Institute
- Institut für Pharmakologie (134) (remove)
Publisher
- MDPI (27)
- Frontiers Media S.A. (9)
- S. Karger AG (2)
- Wiley (2)
- Dove Medical Press (1)
- Elsevier (1)
- Ferrata Storti Foundation (1)
- Nature Publishing Group (1)
- SAGE Publications (1)
- Springer Nature (1)
Abomasal emptying rate of diarrhoeic and healthy suckling calves fed with oral rehydration solutions
(2020)
Abstract
The aim of the study was to determine the abomasal emptying rate (AER) of calves suffering from naturally occurring diarrhoea compared with that of healthy calves. Furthermore, the effects of an oral rehydration solution (ORS) mixed into milk replacer on the AER were determined. Acetaminophen absorption test (APAT) was performed to estimate the AER. Sixty Holstein–Frisian calves (age < 14 days) were included in the study and divided into groups as follows: healthy calves (H; n = 16), healthy calves fed with ORS (HORS; n = 14), diarrhoeic calves (D; n = 15) and diarrhoeic calves fed with ORS (DORS; n = 15). For the APAT, the calves were fed 2 L of milk replacer containing 50 mg acetaminophen (AP)/kg body weight. Venous blood samples were collected before and after milk replacer and AP intake in 30–60 min intervals for 12 hr. During the APAT, no significant differences in median maximum acetaminophen concentration (Cmax) were observed among all groups. Time to reach maximum acetaminophen concentration (Tmax) in DORS (median 390 min, 25/75 quartiles: 300/480 min) was significantly higher compared with that in H (median: 270 min 25/75 quartiles: 210/315 min) and HORS (median: 300 min (25/75 quartiles: 240/360 min). Non‐linear regression revealed that the calculated abomasal half‐life (AP t1/2) tended to be delayed in DORS (median: 652 min, 25/75 quartiles: 445/795 min, p = .10). The area under the AP curve values (AUC) from 0 to 120 min and 0 to 240 min of the observation period were significantly higher in H than D and DORS. In conclusion, significant differences in the AER indices reflected delayed abomasal emptying in diarrhoeic calves. Furthermore, the hypertonic ORS tended to have an additive delaying impact on the AER, which needs attention for the feeding management of diarrhoeic calves.
Als Folge eines akuten Myokardinfarktes kommt es zu einem Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration assoziiert mit einer Aktivierung der kardialen Cysteinproteasen Calpain I und II. Diese scheinen in der Pathogenese von Gewebeschäden und Nekrose nach Myokardinfarkt eine wesentliche Rolle zu spielen. Darüber hinaus gibt es Hinweise auf eine Beteiligung von Calpain I bei kardialen Umbauprozessen nach Infarkt. Calpaininhibitoren könnten daher in der Therapie des Myokardinfarkts erfolgreich eingesetzt werden. Unter den Bedingungen einer kardialen Ischämie konnte bei einigen dieser Substanzen eine kardioprotektive Wirkung demonstriert werden. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde ein Aktivitätsprofil der beiden Calpainformen im infarzierten und nicht-infarzierten Myokard erstellt und die Auswirkungen des Calpaininhibitors CAL 9961 in vitro und in vivo untersucht. Hierzu wurde an Ratten durch permanente Ligation der linken Koronararterie ein akuter Myokardinfarkt induziert. Ein, 3, 7 und 14 Tage nach Infarkt wurden Calpain I und II aus Gewebehomogenaten von interventrikulärem Septum (IS) und linker, freier Ventrikelwand (LVFW) mittels Chromatographie auf DEAE-Sepharose getrennt. Die Aktivität wurde in scheinoperierten und Infarkt-induzierten Tieren mit chronischer Placebo- oder CAL 9961-Therapie mithilfe eines Enzymassays mit synthetischem Substrat gemessen. Die Therapie wurde 3 Tage vor Infarktinduktion begonnen. Calpain I-Aktivität erreichte 14 Tage nach Infarkt höchste Werte im nicht-infarzierten Myokard (IS), während die maximale Calpain II-Aktivität 3 Tage nach Infarktereignis im infarzierten Herzgewebe (LVFW) gemessen wurde. In Experimenten in vitro hemmte CAL 9961 beide Calpainformen vollständig. In vivo verhinderte eine chronische Therapie mit CAL 9961 bei Tieren mit Myokardinfarkt teilweise den Anstieg der Calpain I-Aktivität im nicht-infarzierten Gewebe (IS) und reduzierte die Calpain II-Aktivität im infarzierten Myokard (LVFW) auf das Level scheinoperierter Tiere. Die in dieser Dissertation erbrachten Ergebnisse zeigen, dass die kardialen Calpaine I und II nach einem akuten Myokardinfarkt aktiviert werden, sich ihre Aktivierung jedoch innerhalb des Myokards zeitlich und regional unterscheidet. Die chronische Inhibition dieser Enzyme könnte die Calpain-vermittelten Gewebeschäden limitieren und zur Erhaltung der strukturellen Integrität des Myokards nach Infarkt beitragen.
Organic cation transporter 1 (OCT1) is a membrane transporter that affects hepatic uptake of cationic and weakly basic drugs. OCT1 transports structurally highly diverse substrates. The mechanisms conferring this polyspecificity are unknown. Here, we analyzed differences in transport kinetics between human and mouse OCT1 orthologs to identify amino acids that contribute to the polyspecificity of OCT1. Following stable transfection of HEK293 cells, we observed more than twofold differences in the transport kinetics of 22 out of 28 tested substrates. We found that the β2-adrenergic drug fenoterol was transported with eightfold higher affinity but at ninefold lower capacity by human OCT1. In contrast, the anticholinergic drug trospium was transported with 11-fold higher affinity but at ninefold lower capacity by mouse Oct1. Using human–mouse chimeric constructs and site-directed mutagenesis, we identified nonconserved amino acids Cys36 and Phe32 as responsible for the species-specific differences in fenoterol and trospium uptake. Substitution of Cys36 (human) to Tyr36 (mouse) caused a reversal of the affinity and capacity of fenoterol but not trospium uptake. Substitution of Phe32 to Leu32 caused reversal of trospium but not fenoterol uptake kinetics. Comparison of the uptake of structurally similar β2-adrenergics and molecular docking analyses indicated the second phenol ring, 3.3 to 4.8 Å from the protonated amino group, as essential for the affinity for fenoterol conferred by Cys36. This is the first study to report single amino acids as determinants of OCT1 polyspecificity. Our findings suggest that structure–function data of OCT1 is not directly transferrable between substrates or species.
Die koronare Herzkrankheit ist die häufigste Todesursache in den Ländern der westlichen Welt. Dem Endothelin-System wird zunehmend eine Rolle in der Pathogenese der Atherosklerose und der koronaren Herzkrankheit (KHK) zugesprochen. Das Endothelin-Converting Enzyme (ECE) katalysiert im letzten Schritt des Endothelin-Systems die Bildung des aktiven Endothelins aus seinem inaktiven Vorläufer big-Endothelin. In dieser Arbeit wurde die Assoziation der beiden Polymorphismen G-377A und C-854T in der Promotorregion des ECE-1a, einer Isoform des ECE, zum Risiko der KHK in einem großen Kollektiv von 1000 Patienten mit einer angiografisch verifizierten KHK und 1000 Kontroll-Patienten untersucht. Die Untersuchung ergab für die Variante G-377A eine Häufigkeit des A-Allels von 10,44% in der KHK-Gruppe gegenüber 10,69% in der Kontrollgruppe. Für die Variante C-854T ergab sich eine Häufigkeit des T-Allels von 8,05% in der KHK-Gruppe gegenüber 7,24% in der Kontrollgruppe. Beim Vergleich der Genotypenverteilung mittels x2-Test ergab sich für beide Varianten kein signifikanter Unterschied (p=0.71 bzw. p=0.63). Für beide Varianten erfolgten Stratifizierungen nach allgemeinen Faktoren wie Alter und Geschlecht und nach den verschiedenen Risikofaktoren einer KHK, die insgesamt keine signifikanten Verteilungsunterschiede ergaben. Zusammenfassend konnte kein Beweis einer Assoziation der beiden Polymorphismen zum Risiko der koronaren Herzkrankheit erbracht werden
Kardiovaskuläre Erkrankungen sind zur häufigsten Todesursache in der BRD geworden. Wir untersuchten anhand eines funktionell bedeutsamen Polymorphismus der endothelialen NO-Synthase, inwiefern ein Zusammenhang zwischen einer genetischen Variante zu diesen Erkrankungen besteht. In einer großen populationsbasierten Querschnittsstudie in Nord- und Ostvorpommern stellten wir keine signifikante Assoziation des eNOS Glu298Asp-Polymorphismus zu kardiovasculären Erkrankungen wie arterielle Hypertonie oder Myokardinfarkt fest.
Azathioprin und 6-Mercaptopurin sind wichtige Arzneimittel in der Therapie onkologischer und inflammatorischer Erkrankungen. Die Wirksamkeit dieser Medikamente ist im Wesentlichen von der Bildung aktiver Metabolite, sog. Thioguaninnukleotide (TGN), abhängig. Diese sind die Summe von Thioguanosinmonophosphat (TGMP), Thioguanosindiphosphat (TGDP) und Thioguanosintriphosphat (TGTP). Im Jahr 2005 wurde erstmals berichtet, dass das Ansprechen der Thiopurintherapie bei Patienten mit chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen vom Verhältnis der Metabolite Thioguanosindiphosphat (TGDP) zu Thioguanosintriphosphat (TGTP) abhängt (Neurath et al. Clin Gastroenterol Hepatol. 2005 Oct;3(10):1007-14). Es wird angenommen, dass die Konversion von TGDP zu TGTP durch das ubiquitär exprimierte Enzym Nukleosid Diphosphat Kinase (NDPK) katalysiert wird. Die interindividuelle Variabilität der humanen NDPK-Expression bzw. -Funktion und deren Bedeutung für den Thiopurinmetabolismus sind bisher nicht systematisch untersucht worden. Daher war es Ziel der vorliegenden Arbeit, zuerst den Nachweis zu führen, dass die Konversion von TGDP zu TGTP durch die NDPK katalysiert wird. Im Anschluss daran erfolgte eine systematische Analyse der interindividuellen Variabilität der relevanten NDPK-Isoformen, NDPK A und NDPK B, in verschiedenen humanen Geweben (Leber und Blutzellen). Dabei sollte auch der Einfluss von genetischen, nicht genetischen sowie epigenetischen Faktoren auf die Variabilität der NDPK-Expression untersucht werden. Dafür wurden zunächst die NDPK-Isoformen NDPK A und NDPK B rekombinant exprimiert und ein high performance liquid chromatographie (HPLC)-Assay zur Bestimmung der NDPK-Aktivität etabliert. Die Quantifizierung der NDPK-Expression auf mRNA- und Proteinebene wurde mit Hilfe von quantitativer real-time PCR bzw. durch indirekte Immunodetektion der Isoformen mit spezifischen Antikörpern durchgeführt. Um den Einfluss von genetischen und epigenetischen Faktoren auf die NDPK A bzw. B Expression zu untersuchen, wurden die Genbereiche von NDPK A (NME1) und NDPK B (NME2) sequenziert bzw. mittels Matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) analysiert. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, die beiden NDPK-Isoformen NDPK A und NDPK B in E.coli rekombinant zu exprimieren. Mithilfe des validierten HPLC-Assays zur Bestimmung der NDPK-Aktivität konnte gezeigt werden, dass beide Isoformen die Konversion von TGDP zu TGTP katalysieren können. Durch Quantifizierung der mRNA- und Proteinexpression von NDPK A und NDPK B sowie der Bestimmung der NDPK-Aktivität wurde eine systematische Analyse zur Phänotyp- (Expression bzw. Funktion) Genotyp Korrelation dieser Enzyme in humaner Leber bzw. Blutzellen durchgeführt. Dabei zeigte sich eine ausgeprägte interindividuelle Variabilität für die NDPK A- und NDPK B-Expression auf RNA und Proteinebene für beide Gewebetypen. Bei der Sequenzierung der relevanten Genbereiche für die NDPK A (NME1) wurden zahlreiche genetische Varianten identifiziert, darunter zwei bisher noch nicht beschriebene Varianten im Promotorbereich. Für die NDPK B (NME2) konnte nur eine einzige genetische Variante detektiert werden. Mit Hilfe eines neu etablierten 16-plex MALDI-TOF MS Assays wurden genomische DNA-Proben der humanen Leberbank bzw. DNA aus Blutzellen auf diese gefundenen Varianten genotypisiert. Für zwei Promotorvarianten von NME1 konnte ein signifikanter Einfluss auf die NDPK A-Expression gezeigt werden, diese wurden mittels electromobility shift assays (EMSA) auf Verlust der DNA-Bindungskapazität von Kernproteinen untersucht. Darüber hinaus wurde bei der Analyse verschiedener nicht genetischer Faktoren (z. B. Alter, Geschlecht, Raucherstatus, Alkoholkonsum, Medikation und Diagnose), ein signifikanter Einfluss auf die NDPK A- bzw. NDPK B Expression in humanen Leberproben von Patienten mit cholestatischen Leberparametern beobachtet. Untersuchungen zur Methylierung der NME1-Promotorbereiche mit einer hohen Dichte an CpG-Dinukleotiden, den sog. CpG-Inseln, konnten keinen signifikanten Einfluss des Methylierungsstatus auf die NME1/NDPK A-Expression zeigen. Ergänzende Untersuchungen mit Centre dÉtude du Polymorphisme Humain (CEPH)-Zelllinien bestätigten eine ausgeprägte Variabilität der NDPK A- und NDPK B Expression, die durch genetische Varianten nicht erklärt werden konnte.
Auswirkungen der Körperposition auf die Magenentleerung und Pharmakokinetik von oralen Arzneiformen
(2023)
Kenntnisse über die Physiologie des humanen GITs und dessen Einfluss auf orale Arzneiformen sind essenziell für die Sicherheit der Pharmakotherapie. Das Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss unterschiedlicher Körperpositionen auf das Anfluten von Koffein als Modell für eine Substanz der BCS Klasse I bei der Einnahme als Tablette und Kapsel sowie die Magenentleerung des mitgetrunkenen Wassers zu untersuchen und untereinander zu vergleichen. Die Erhebung der Daten erfolgte durch Speichelproben von 12 gesunden Probanden nach Einnahme von jeweils 240 mL Wasser zusammen mit einer Koffein enthaltenden Eiskapsel als Markierung für das Wasser, sowie je einer ebenfalls Koffein enthaltenden Hartkapsel und einer Tablette in aufrechter Körperposition, Rückenlage, Rechts- und Linksseitenlage im Crossover-Design. Zur Unterscheidung wurde für die Eiskapsel 13C3-isotopenmarkiertes Koffein, für die Kapsel 13C1-isotopenmarkiertes Koffein und für die Tablette natürliches (12C) Koffein verwendet.
Die Magenentleerung von Wasser im nüchternen Zustand ist abhängig von dem hydrostatischen Druck, der auf den Pylorus drückenden Wassersäule. Abhängig von der Körperposition wird demnach unterschiedlich viel zusätzliche mechanische Arbeit des Magens benötigt, um das Wasser gegen die Schwerkraft zu transportieren. Da diese Arbeit in allen Positionen in Abhängigkeit des MMC ohnehin durch aktive Kontraktionen und Motilität aufgebracht wird, ist bei zusätzlich vorliegendem hydrostatischen Druck die Wasserentleerung schneller. Die Magenentleerung von Wasser ähnelt sich in aufrechter Körperposition und Rechtsseitenlage, da in diesen Körperpositionen keine zusätzliche mechanische Arbeit benötigt wird, um das Wasser gegen die Schwerkraft zu transportieren. Im Gegensatz dazu entleert der Magen in Rückenlage und in Linksseitenlage langsamer Wasser, da in diesen Körperpositionen das Wasser gegen die Schwerkraft aus dem Pylorus herausgedrückt werden muss. So war in Linksseitenlage statistisch signifikant die AUC0-61 um 25% und die Cmax um 18% kleiner als in aufrechter Körperposition. Auch in Rückenlage war die AUC0-61 und die Cmax im Trend kleiner als in aufrechter Körperposition. Das durchschnittliche tmax wurde in Rückenlage und Linksseitenlage im Trend erst später erreicht.
Die Ergebnisse der Tablette und Kapsel spiegelten größtenteils die Ergebnisse der Wasserentleerung wider, wodurch die enorme Bedeutung der Magenentleerung als geschwindigkeitsbestimmender Schritt der Pharmakokinetik verschiedener schnell zerfallender Darreichungsformen abermals belegt wurde. Die durchschnittliche AUC0-61 in Linksseitenlage war um 33% und statistisch signifikant kleiner als in aufrechter Körperposition. Auch die AUC0-61 in Rechtsseitenlage war signifikant größer als in Linksseitenlage. Im Trend wurde das durchschnittliche tmax nach Einnahme der Hartkapsel in Linksseitenlage erst später erreicht und das durchschnittliche Cmax war kleiner. Im Trend flutete die Hartkapsel in Rückenlage langsamer an als in aufrechter Körperposition und Rechtsseitenlage und schneller als in Linksseitenlage.
Die Tablette flutete, im Gegensatz zur Magenentleerung von Wasser, im Trend geringgradig schneller in Rechtsseitenlage an als in aufrechter Körperposition. Der Grund für diese besonders schnelle Wirkstoffanflutung in Rechtsseitenlage war vermutlich, dass die Tablette direkt ins Antrum fiel, aufgrund der Motilität dort schneller desintegrierte oder sogar in den Dünndarm entleert wurde, was wiederum zu noch steileren Profilen führte. Statistisch war die durchschnittliche AUC0-61 dementsprechend in Rechtsseitenlage signifikant größer als in Rücken- und Linksseitenlage. Auch die maximal erreichte Konzentration (Cmax) war statistisch signifikant höher in Rechtsseitenlage als in Linksseitenlage. Die AUC0-61 in Linksseitenlage war ebenfalls statistisch signifikant um durchschnittlich 41% kleiner als in aufrechter Körperposition. Das durchschnittliche tmax wurde in Rücken- und Linksseitenlage im Trend später erreicht als in aufrechter Körperposition und Rechtsseitenlage.
Die Daten der Studie zeigten, dass auch die Lag time von Darreichungsformen körperpositionsabhängig waren. Statistisch war die durchschnittliche Lag time nach Einnahme der Tablette in Rechtsseitenlage signifikant kürzer als in Linksseitenlage.
Die Daten zeigten außerdem, dass die Körperposition vor allem für Darreichungsformen mit langer Desintegrationszeit einen wichtigen Einflussfaktor auf das Anflutungsverhalten hatte, da zum Zeitpunkt des Starts der Desintegration bereits vermehrt Wasser aus dem Magen entleert wurde. Besonders bei schlechter löslichen Arzneistoffen könnte demnach der Einfluss der Körperposition noch deutlich gravierender ausfallen. Die Daten zeigten dennoch, dass auch gut lösliche Arzneistoffe teilweise über Stunden im Magen verweilen und zu Doppelpeaks führen können.
Für biopharmazeutische Modellierungen, wie beispielsweise PBPK Modelle, ist der Unterschied zwischen der Magenentleerung in aufrechten Körperposition und in Rückenlage besonders von Bedeutung, da die Modelle häufig auf MRT Daten basieren, welche in Rückenlage akquiriert werden. Die durchschnittliche AUC0-61 nach Einnahme der Hartkapsel war in aufrechter Körperposition um 24% größer als in Rückenlage. Die durchschnittliche AUC0-61 nach Einnahme der Tablette war in aufrechter Körperposition um 52% größer als in Rückenlage. Da die im Rahmen dieser Arbeit gemessenen Unterschiede den potenziell enormen Einfluss der Körperposition für Modellierungen bei der Arzneimittelentwicklung sowie für die klinische Praxis mit liegenden Patienten unterstreichen, ist eine weitere Abklärung des Einflusses der Körperposition unter anderem auch im postprandialen Zustand empfehlenswert.
Kardiovaskuläre Erkrankungen gehören zu den Haupttodesursachen in der westlichen Bevölkerung. Die Morbidität und Mortalität der Herzinsuffizienz und ischämischer Erkrankungen sind trotz vielfältiger Therapieansätze weiterhin sehr hoch. Bei Patienten mit einer dilatativen Kardiomyopathie (DCM) konnte hinsichtlich der Genexpression des Carnitin-Transporters OCTN2 eine deutliche Reduktion festgestellt werden. Diese korrelierte signifikant mit einer verminderten Ejektionsfraktion (EF) und stellt somit einen möglichen Risikofaktor für die Entwicklung bzw. Progression einer DCM dar. Physiologisch ist die OCTN2-vermittelte Carnitin-Aufnahme von besonderer Bedeutung für die Energiegewinnung der Zelle über die Betaoxidation. Zusätzlich zu dieser endogenen Verbindung können jedoch auch zahlreiche Arzneistoffe, wie Mildronat, von OCTN2 transportiert werden und die Carnitin-Aufnahme hemmen. Ein Ziel der vorliegenden Untersuchungen war es demzufolge, den Einfluss einer verminderten OCTN2-Funktion auf die Entwicklung einer DCM, anhand hämodynamischer Analysen (MRT und Konduktanz-Katheter-Technik) zu überprüfen. Dafür wurden Mäuse, die homo- oder heterozygot eine Mutation im Octn2-Gen (Slc22a5) aufwiesen (sogenannte juvenile viscerale Steatose-Mäuse) und entsprechende Kontrolltiere als Modell verwendet. Die heterozygot-defizienten Tiere unterschieden sich dabei sowohl hinsichtlich des Gehalts an freiem Carnitin im Serum und im Herzgewebe als auch hinsichtlich der hämodynamischen Parameter (wie z. B. EF, LVRI und dP/dtmin) nur wenig von den Kontrollen. Die Modulation des Carnitin-Spiegels durch pharmakologische Intervention mit Mildronat ging zwar mit einer Verminderung des Carnitin-Spiegels einher, resultierte jedoch nicht in einer pathophysiologisch veränderten Herzfunktion. Interessanterweise deuten einige kardiale und molekularbiologische Parameter (wie z. B. EF und NT-proBNP-Gehalt) unter Hemmung des OCTN2 tendenziell sogar auf eine leicht verbesserte Herzfunktion hin. Außerdem wurde in diesem Tiermodell auch der Einfluss der OCTN2-Funktion und damit der Carnitinversorgung für das Ausmaß der Gewebeschädigung beim akuten Myokardinfarkt untersucht. Diese Untersuchungen zeigten ebenfalls keine negativen Auswirkungen bei verminderter OCTN2-Funktion. Sie sprachen im Gegenteil für eine protektive Wirkung eines reduzierten Carnitin-Spiegels hinsichtlich Ischämie-bedingter kardialer Schädigungen. So zeigte sich ein deutlicher Gendosis-Effekt hinsichtlich Carnitin-Spiegel und Infarktareal, der durch Carnitin-Applikation teilweise wieder aufgehoben werden konnte. Insgesamt ist aus den Untersuchungen zur kardialen Bedeutung von OCTN2 hervorgegangen, dass eine moderate Beeinträchtigung der Transportfunktion und damit der Carnitin-Spiegel keinen negativen Einfluss auf die Herzfunktion besitzt.
Transportproteine und metabolisierende Enzyme sind wesentliche Bestandteile der intestinalen Absorptionsbarriere und entscheidend für die Aufnahme, Verteilung, Metabolisierung und Exkretion von Nährstoffen, Arzneimitteln oder Xenobiatika. Es gibt Hinweise darauf, dass sowohl deren Expression als auch Funktion im Zusammenhang mit entzündlichen Prozessen beeinträchtigt sind. Um die Auswirkung von Colitis Ulcerosa auf das lokale Expressionsmuster klinisch relevanter intestinaler Transporter und Enzyme abschätzen zu können, wurde in der vorliegenden Arbeit u.a. deren Genexpression, Proteingehalt sowie mögliche krankheitsbezogene Regulationsmechanismen untersucht. Mit Biopsien aus entzündetem und nicht entzündetem Gewebe von 10 Colitis Ulcerosa-Patienten als auch mit gesundem Kolongewebe ohne Entzündungszeichen wurden mittels real-time quantitative PCR mRNA- (9 Enzyme, 15 Transporter, 9 Zytokine) und microRNA- (N = 54) Expressionsanalysen durchgeführt. Der Proteingehalt wurde durch validierte HPLC-MS/MS targeted proteomics Verfahren ermittelt. Die Genexpression folgender Enzyme und Transporter zeigten sich während intestinaler Entzündung signifikant reduziert: CYP2B6, CYP2C9, UGT1A1, UGT1A3, UGT2B7, UGT2B15, ABCB1, ABCG2, SLC16A1 und SLC22A3. Ein signifikanter Anstieg der mRNA-Level im entzündeten Gewebe von Colitis Ulcerosa-Patenten konnte für ABCC1, ABCC4, ORCTL2 und OATP2B1 nachgewiesen werden. Bezogen auf den Proteingehalt ließen sich die auf mRNA Ebene beobachteten Expressionsunterschiede nur für MCT1 bestätigen. Korrelationsanalysen demonstrierten den möglichen Einfluss von Zytokinen und microRNAs auf die Regulation intestinaler Enzym- und Transporterexpression. Insbesondere scheinen TNFα, IL17 A sowie miR-142-3p/5p, miR-146a-5p und miR 223-3p starken Einfluss auf krankheitsbezogene Expressionsmuster zu besitzen. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Colitis Ulcerosa mit komplexen Veränderungen in der intestinalen Expression von metabolisierenden Enzymen, Transportern, Zytokinen und microRNAs einhergeht, welche sowohl Auswirkungen auf die medikamentöse Therapie als auch auf die Pathogenese der Erkrankung selbst haben können.
Die orale Einnahme stellt für Patienten die einfachste und unkomplizierteste Möglichkeit dar, ein Arzneimittel zu applizieren und ist das angestrebte Ziel der Arzneimittelentwicklung. Dem entgegen stehen jedoch die evolutionär entstandenen Möglichkeiten des Körpers, aufgenommene Fremdstoffe zu inaktivieren und zu eliminieren. Ein Zusammenspiel aus anatomischen Gegebenheiten und den Enzymen des Fremdstoffmetabolismus sorgt dafür, dass ein Teil der oral applizierten Dosis bereits verstoffwechselt wird, bevor er über das arterielle System an den Wirkort gelangen kann (first-pass-Effekt). Als Ort dieses Metabolismus wurde, neben der Leber, auch der Darm identifiziert. Um das Ausmaß des first- pass-Effektes abschätzen zu können, werden Daten über den Gehalt der arzneistoffmetabolisierenden Enzyme in diesen Organen benötigt. Als Methode der Wahl bietet sich dazu die LC-MS/MS an, da mit ihr verschiedene Enzyme in einem analytischen Lauf bestimmt werden können und sie sich durch eine hohe Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und Spezifität auszeichnet.
Mit der vorliegenden Arbeit wurde das analytische Spektrum der bisher publizierten Methoden zur Bestimmung von CYP- und UGT-Enzymen erweitert. Mit der neuen Methode können nun zwei Carboxylesterasen, 17 CYP-Enzyme und fünf UGT-Enzyme quantifiziert werden. Weiterhin wurde die Methode anhand von Richtlinien für bioanalytische Methoden umfassend validiert. Durch die Verwendung von rekombinant hergestellten arzneistoffmetabolisierenden Enzymen konnte der gesamte analytische Prozess, von der Probe bis zum Endergebnis, erstmalig umfassend charakterisiert werden. Dabei zeigte sich eine, für einen derart komplexen Prozess bemerkenswerte Präzision von maximal 15,5% Variation nach sechsmaliger Durchführung.
Die entwickelte Methode wurde dann auf gepaarte Proben aus Leber und Jejunum von elf gesunden Organspendern angewendet. Im Jejunum wurden CES1, CES2, CYP2C9, CYP2C18, CYP2C19, CYP2D6, CYP2J2, CYPA4, CYP3A5, CYP4F2, CYP4F12, UGT1A1, UGT1A3, UGT2B7 und UGT2B17 gefunden. In der Leber konnten alle untersuchten Enzyme (CES1, CES2, CYP1A1, CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C18, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP2J2, CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7, CYP4F2, CYPF12, UGT1A1, UGT1A3, UGT2B7, UGT2B15 und UGT2B17), bis auf CYP4A11 nachgewiesen werden. Für einige Enzyme (CES2, CYP2C18, CYP2C19, CYP2J2, CYP3A4, CYP4F2, CYP4F12) wurden im Jejunum Enzymgehalte gemessen, die mit denen in der Leber vergleichbar sind, was noch einmal unterstreicht, dass der Darm auch als klinisch relevanter Ort des Arzneistoffmetabolismus betrachtet werden muss. Auffällig war hier zudem die deutlich höhere Variabilität in den Darmproben, verglichen mit den Leberproben, die ihre Ursache in Umwelteinflüssen oder dem Mikrobiom des Darms haben könnten. Außerdem wurde die Expression der zugehörigen Gene mittels quantitativer real-time PCR untersucht. Hier bestand nur in einigen Fällen eine signifikante Korrelation zwischen Genexpression und Proteingehalt, was für zwischengeschaltete regulatorische Mechanismen spricht.
Weiterhin wurden mit dieser Methode Leberproben einer Kohorte von Patienten mit Krankheitsbildern, die mit einer Einschränkung der Leberfunktion einhergehen, untersucht. Dazu wurden die Patienten nach der verbleibenden Leberfunktion (Child-Pugh-Score) und nach der zugrundeliegenden Erkrankung eingeteilt. Es zeigt sich eine generelle Abnahme des Gehaltes an arzneistoffmetabolisierenden Enzymen mit fortschreitender Verschlechterung der Leberfunktion, wobei sich CYP2E1 als besonders anfällig erwiesen hat und bereits in Child- Pugh-Klasse A signifikant erniedrigt war. Bei den verschiedenen Erkrankungen zeigt sich ein uneinheitliches Bild, die prozentuale Verteilung der Enzyme ist jedoch bei allen Erkrankungen gegenüber den gesunden Kontrollproben verändert.
Über die Regulation der Expression von arzneistoffmetabolisierenden Enzymen ist bisher noch wenig bekannt. Es gibt aber Hinweise aus der Literatur, dass bestimmte nukleäre Rezeptoren an der Regulation der Enzyme beteiligt sein können. Deshalb wurde eine LC-MS/MS-basierte targeted-proteomics-Methode zur Quantifizierung von nukleären Rezeptoren in Darm- und Lebergewebe entwickelt und validiert. Im Gewebe konnten nur AhR und HNF4α nachgewiesen werden, da die Empfindlichkeit des verwendeten experimentellen Ansatzes vermutlich nicht ausreichend ist. Dabei war HNF4α in Darmgewebe deutlich höher exprimiert als AhR. Außerdem wurde die Expression der nukleären Rezeptoren auf Genebene durch quantitative real-time PCR untersucht. Dabei wurde eine höhere Expression von CAR in der Leber gefunden, während PXR in Darm stärker exprimiert wird. Dies entspricht den Erkenntnissen aus der Literatur, nach denen CAR einen regulatorischen Effekt auf arzneistoffmetabolisierende Enzyme in der Leber hat, während dies für PXR in Darm zutrifft. Diese Arbeit kann einen Beitrag zum weitergehenden Verständnis der Regulation von arzneistoffmetabolisierenden Enzymen durch nukleäre Rezeptoren beitragen.
Bei allen diesen Arbeiten gilt es zu beachten, dass das Vorhandensein eines Proteins nicht zwangsläufig mit seiner Aktivität gleichzusetzen ist. Jedoch zeigen zahlreiche Beispiele aus der Literatur, dass sich mit den Daten aus Proteomics-Studien PBPK-Modelle aufstellen lassen, die die in klinischen Studien erhobenen Daten mit beeindruckender Genauigkeit reproduzieren können.
Die Sicherheit und Wirksamkeit der Arzneimitteltherapie wird maßgeblich von Transportproteinen beeinflusst. Die zelluläre Lokalisation von Transportern hat hierbei wesentlichen Einfluss darauf, ob diese als funktionelle Aufnahme- oder Effluxtransporter fungieren. Für den menschlichen Darm ist die Lokalisation einiger Transporter noch unklar. Ein Beispiel hierfür ist der organic cation transporter (OCT1), welcher für die intestinale Aufnahme zahlreicher kationischer Arzneistoffe, wie beispielsweise Morphin verantwortlich gemacht wird. Bisher gibt es allerdings widersprüchliche Aussagen über die exakte Lokalisation dieses Transporters in der Zellmembran von Enterozyten. Folglich ist die tatsächliche Bedeutung dieses Proteins für die Absorption von Arzneistoffen bis heute ungeklärt.
Daher war das Ziel dieser Arbeit die Expression, Lokalisation und Funktion von OCT1 in Enterozyten anhand verschiedener labortechnischer Methoden näher zu charakterisieren.
Mittels Immunfluoreszenzfärbung wurde versucht die Lokalisation von OCT1 im Zellmodell zu bestimmen. Ebenfalls im Zellmodell erfolgte die Untersuchung des vektoriellen Transportes von Morphin mittels Transwellassay. Diese, sowie entsprechende Analysen vitalen intestinalen Gewebes in der Ussing-Kammer, wurden genutzt, um indirekt Rückschlüsse auf die Transporterlokalisation zu ziehen.
Trotz eindeutiger und der Hypothese entsprechender Expression und Funktion in MDCKII-OCT1/P-gp-Zellen, konnten im Rahmen dieser Arbeit keine eindeutigen Ergebnisse bezüglich der Lokalisation von OCT1 in Caco-2-Zellen generiert werden.
Caco-2-Zellen sollten als Zellmodell für Enterozyten, insbesondere hinsichtlich der Charakterisierung von OCT1, neu bewertet werden, da aktuellen Erkenntnissen entsprechend möglicherweise keine signifikante Expression von OCT1 in diesen Zellen vorliegt. Auch das genutzte OCT1-Modellsubstrat Morphin ist möglicherweise problematisch. Es ist darauf hinzuweisen, dass es sich bei den vorliegenden Daten aufgrund der geringen Versuchszahl nur um vorläufige Ergebnisse handeln kann, welche in zukünftigen Arbeiten verifiziert werden sollten.
Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass die vorliegende Arbeit zwar keine neuen Erkenntnisse bezüglich der Lokalisation von OCT1 in Enterozyten erbringen konnte, jedoch die Bedeutung eines kritischen Umgangs mit etablierten Methoden und deren Ergebnissen unterstreicht.
Der Transport von Substanzen innerhalb eines Organismus stellt eine wesentliche Vorausset-zung zur Aufrechterhaltung von Stoffwechselprozessen dar. Neben endogenen Stoffen unter-liegen auch die meisten exogenen Substanzen zahlreichen Transportvorgängen, darunter auch die meisten Arzneistoffe. Deren Pharmakokinetik wird oft entscheidend von ihrer Affini-tät zu bestimmten Transportproteinen beeinflusst. Von diesen präsentiert neben den ABC-Transportern die Familie der SLC-Transporter das größte Spektrum einzelner Vertreter. Auf-grund ihrer Beteiligung sowohl an physiologischen als auch pharmakokinetischen Prozessen erweisen sich darunter die OATPs als besonders interessant. Obwohl deren Bedeutung am Stofftransport durch umfassende Charakterisierung ihrer Expression und Funktion unbestrit-ten ist, erweist sich ihr zugrundeliegender Transportmechanismus noch immer als nicht voll-ständig verstanden. Jedoch bieten Untersuchungen an verwandten Transportern, wie der bak-teriellen Lactose-Permease, Erkenntnisse, die sich möglicherweise auch auf die OATPs über-tragen lassen. Für diese wurde ein Rocker-switch-Mechanismus vorausgesagt, bei dem die Bindung des Substrats zu einer Konformationsänderung führt. Hierdurch wird das Substrat entlang einer zentralen Pore durch das Transportprotein befördert. Eine Möglichkeit derartige Konformationsänderungen, die mit einer Verschiebung der Abstände innerhalb des Moleküls einhergehen, zu untersuchen, stellt der Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) dar. Dieser beschreibt die strahlungslose Energieübertragung zwischen zwei Chromophoren, deren Effizi-enz mit dem Abstand der Chromophore zu- bzw. abnimmt.
Erstes Ziel dieser Arbeit war es OATP2B1, als einen Vertreter der OATPs, so zu modifizieren, dass er für die Untersuchung mittels FRET zugänglich werden würde. Dies erfolgte durch die Herstellung von OATP2B1-Fusionsproteinen, bei denen der Transporter mit den FRET-geeig-neten Fluorophoren ECFP/EYFP bzw. ECFP/FlAsH ausgestattet wurde. Die Integration des ECFP erfolgte dabei jeweils am C-Terminus, während EYFP und FlAsH jeweils in die intrazellulären Schleifen des Proteins eingebracht wurden. Im Weiteren galt es, diese Fusionsproteine hin-sichtlich ihrer Funktion (Transport radioaktiv-markierter Substrate) und Lokalisation in der Zelle (Mikroskopie) zu charakterisieren. Hierbei wurde gezeigt, dass lediglich die Modifikation mit FlAsH in der dritten intrazellulären Schleife zu keiner Funktionsbeeinflussung führte und dieses Fusionsprotein auch als einziges eine membranäre Lokalisation aufwies. Der Schwerpunkt lag jedoch auf der Messung der FRET-Effizienzen der Fusionsproteine mithilfe konfoka-ler Laser-Scanning-Mikroskopie. Dabei konnte zunächst bei allen Fusionsproteinen ein FRET-Signal erfasst werden, das in Abhängigkeit der Position des FRET-Partners in der intrazellulä-ren Schleife eine unterschiedliche Effizienz aufwies. Die FRET-basierte Berechnung der Ab-stände innerhalb des Moleküls brachte Ergebnisse hervor, die vergleichbar mit denen waren, die anhand von Kristallstrukturanalysen verwandter Transporter erhoben wurden. Teilweise Übereinstimmungen ergaben sich daneben auch beim Vergleich der berechneten Abstände mit denen computergestützter Modelle. Die Ergebnisse zeigen damit das Potenzial dieser Me-thode, die Struktur des OATP2B1 aufzuklären. Außerdem stützen sie zum Teil die prognosti-zierte Strukturverwandtschaft der OATPs zu der strukturell besser charakterisierten Lactose-Permease. Letztes Ziel war es zu untersuchen, ob sich die gemessenen FRET-Effizienzen durch Zugabe des OATP2B1-Substrats E1S beeinflussen ließen. Es konnte für fast alle Fusionsproteine eine Beeinflussung festgestellt werden, wobei die FRET-Effizienzen in Abhängigkeit von der Position des FRET-Partners sowohl ab- als auch zunahmen. Daneben zeigte auch die Zugabe des OATP2B1-Inhibitors Rifampicin eine verschieden ausgeprägte Beeinflussung. Die Zugabe des Nicht-OATP2B1-Substrats 17β-Estradiol-3-glucuronid führte zu keiner Beeinflussung. Die Ergebnisse zeigen damit eine substanzspezifische Beeinflussung des Fusionsproteins. Die be-rechneten Änderungen des Abstandes waren vergleichbar mit den aus Kristallstrukturanaly-sen gewonnenen Abständen der Lactose-Permease. Es konnten hierdurch erste Hinweise ge-liefert werden, dass der dem OATP2B1 zugrundeliegende Transportmechanismus einem ähn-lichen Prinzip folgt, wie es für den Rocker-Switch beschrieben wurde. Die Bindung und der Transport des Substrats an das OATP2B1 führen zu einer Abstandsänderung innerhalb des Moleküls, die sich am ehesten über eine Konformationsänderung erklären ließe.
Diese Arbeit kann insgesamt erste Grundlagen zur weiteren Charakterisierung der Struktur und des Transportmechanismus der OATPs liefern. Sie zeigt, dass die Herstellung eines funk-tionsfähigen FRET-Fusionsproteins möglich ist und dass deren Untersuchung nachvollziehbare Ergebnisse liefern kann. Außerdem bietet sie einen Ansatz, FRET-basierte Screening-Verfah-ren für Transportersubstrate zu etablieren. Inwieweit diese praktisch umzusetzen sind, muss jedoch durch aufbauende Arbeiten geklärt werden.
OCT1 and OCT2 are polyspecific membrane transporters that are involved in hepatic and renal drug clearance in humans and mice. In this study, we cloned dog OCT1 and OCT2 and compared their function to the human and mouse orthologs. We used liver and kidney RNA to clone dog OCT1 and OCT2. The cloned and the publicly available RNA-Seq sequences differed from the annotated exon-intron structure of OCT1 in the dog genome CanFam3.1. An additional exon between exons 2 and 3 was identified and confirmed by sequencing in six additional dog breeds. Next, dog OCT1 and OCT2 were stably overexpressed in HEK293 cells and the transport kinetics of five drugs were analyzed. We observed strong differences in the transport kinetics between dog and human orthologs. Dog OCT1 transported fenoterol with 12.9-fold higher capacity but 14.3-fold lower affinity (higher KM) than human OCT1. Human OCT1 transported ipratropium with 5.2-fold higher capacity but 8.4-fold lower affinity than dog OCT1. Compared to human OCT2, dog OCT2 showed 10-fold lower transport of fenoterol and butylscopolamine. In conclusion, the functional characterization of dog OCT1 and OCT2 reported here may have implications when using dogs as pre-clinical models as well as for drug therapy in dogs.
Pentathiepins are polysulfur-containing compounds that exert antiproliferative and cytotoxic activity in cancer cells, induce oxidative stress and apoptosis, and inhibit glutathione peroxidase (GPx1). This renders them promising candidates for anticancer drug development. However, the biological effects and how they intertwine have not yet been systematically assessed in diverse cancer cell lines. In this study, six novel pentathiepins were synthesized to suit particular requirements such as fluorescent properties or improved water solubility. Structural elucidation by X-ray crystallography was successful for three derivatives. All six underwent extensive biological evaluation in 14 human cancer cell lines. These studies included investigating the inhibition of GPx1 and cell proliferation, cytotoxicity, and the induction of ROS and DNA strand breaks. Furthermore, selected hallmarks of apoptosis and the impact on cell cycle progression were studied. All six pentathiepins exerted high cytotoxic and antiproliferative activity, while five also strongly inhibited GPx1. There is a clear connection between the potential to provoke oxidative stress and damage to DNA in the form of single- and double-strand breaks. Additionally, these studies support apoptosis but not ferroptosis as the mechanism of cell death in some of the cell lines. As the various pentathiepins give rise to different biological responses, modulation of the biological effects depends on the distinct chemical structures fused to the sulfur ring. This may allow for an optimization of the anticancer activity of pentathiepins in the future.
Course of disease and risk factors for hospitalization in outpatients with a SARS-CoV-2 infection
(2022)
We analyzed symptoms and comorbidities as predictors of hospitalization in 710 outpatients in North-East Germany with PCR-confirmed SARS-CoV-2 infection. During the first 3 days of infection, commonly reported symptoms were fatigue (71.8%), arthralgia/myalgia (56.8%), headache (55.1%), and dry cough (51.8%). Loss of smell (anosmia), loss of taste (ageusia), dyspnea, and productive cough were reported with an onset of 4 days. Anosmia or ageusia were reported by only 18% of the participants at day one, but up to 49% between days 7 and 9. Not all participants who reported ageusia also reported anosmia. Individuals suffering from ageusia without anosmia were at highest risk of hospitalization (OR 6.8, 95% CI 2.5–18.1). They also experienced more commonly dyspnea and nausea (OR of 3.0, 2.9, respectively) suggesting pathophysiological connections between these symptoms. Other symptoms significantly associated with increased risk of hospitalization were dyspnea, vomiting, and fever. Among basic parameters and comorbidities, age > 60 years, COPD, prior stroke, diabetes, kidney and cardiac diseases were also associated with increased risk of hospitalization. In conclusion, due to the delayed onset, ageusia and anosmia may be of limited use in differential diagnosis of SARS-CoV-2. However, differentiation between ageusia and anosmia may be useful for evaluating risk for hospitalization.
Eine Thrombose ist eine Gefäßerkrankung, bei der eine lokalisierte, intravasale Blutgerinnung zur Bildung eines Thrombus in einem Gefäß führt. Die Aktivierung der
Blutgerinnungskaskade und damit der Gerinnungsfaktoren führt zu einer Bildung sowie Quervernetzung von Fibrin und so zur Entstehung eines Thrombus. Dieser wird
physiologisch über die Fibrinolyse abgebaut. Die Serinprotease PAI-1 inhibiert diese und wirkt somit prothrombotisch. Jüngste Studien haben gezeigt, dass S1P als Schlüsselmolekül des Immunsystems und des Metabolismus auch das Gerinnungssystem beeinflusst und in einer wechselseitigen Beziehung mit dem Gerinnungsfaktor Thrombin und seinen PARs steht. Die S1P-Konzentration im Körper korreliert dabei eng mit dem BMI. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Wirkung des Signallipids S1P auf die PAI-1-Expression von Fettzellen und damit die Stellung der Adipozyten bei S1P-vermittelten thrombotischen Ereignissen in vitro. Weiterhin wurde
erstmalig die Wechselwirkung von Thrombin und S1P bei der Produktion von PAI-1 in Fettzellen untersucht. Hierfür wurden 3T3-L1-Fibroblasten in Adipozyten differenziert
und mit S1P stimuliert. Es zeigte sich eine konzentrationsabhängige Steigerung der PAI-1-mRNA. Diese Ergebnisse wurden ebenfalls von anderen Arbeitsgruppen
bestätigt. Der S1P-Effekt ließ sich auch mittels Western Blot-Analyse auf Proteinebene darstellen. Dabei zeigte sich eine starke Steigerung der PAI-1-Expression und
Sekretion von 3T3-L1-Zellen. S1PR-2- und S1PR3-Inhibitoren senkten den S1Pvermittelten Anstieg, sodass S1P über eine S1PR-2- und, bisher in der Literatur noch
nicht beschrieben, auch über eine S1PR-3-Aktivierung einen prothrombotischen Einfluss ausübt. Weiterhin konnte nach Stimulation mit S1P erstmalig eine Expressionssteigerung von PAR-1 und damit eine Wechselwirkung zwischen dem Signalweg von Thrombin und S1P in Adipozyten beobachtet werden. Es wurde die
Hypothese aufgestellt, dass Thrombin über den PAR-1 die Aktivität der Enzyme des S1P-Metabolismus steigert und so über eine endogene S1P-Produktion zu einer zusätzlichen Steigerung von PAI-1 führt. Diese konnte bisher noch nicht bestätigt werden, da lediglich eine geringe, jedoch nicht signifikante Steigerung von PAI-1 nach Thrombin-Stimulation beobachtet werden konnte. Somit ist das Fettgewebe ein wichtiges Bindeglied zwischen dem inflammatorischen Lipid S1P sowie dem Enzym PAI-1 und damit als Gewebe ein bisher stark unterschätzter Einflussfaktor bei der Entstehung und Aufrechterhaltung thrombotischer Ereignisse.
Das Glioblastom ist ein WHO Grad 4-Tumor und einer der häufigsten und zugleich agressivsten Hirntumoren im Erwachsenenalter. Trotz multimodaler Therapie, die eine neurochirurgische Resektion sowie eine adjuvante Radiochemotherapie und als neuen Therapieansatz eine Kombination aus Temozolomid und tumor treating fields umfasst, ist die Prognose weiterhin schlecht, sodass der Suche nach neuen therapeutischen Zielstrukturen eine maßgebliche Bedeutung zukommt. Für verschiedene Tumorentitiäten konnte gezeigt werden, dass die Überexpression einzelner onkogener Kinasen die Tumorprogression vorantreibt, wobei bei Glioblastomen gezeigt werden konnte, dass die Serin-Threonin-Kinase Pim1 eine wichtige Rolle in der Pathogenese einnimmt.
In den Fokus rücken zunehmend auch stammzellähnliche Tumorzellen, die eine Subpopulation innerhalb von Glioblastomen darstellen und das aggressive biologische Verhalten sowie die Resistenz gegenüber der Standardtherapie und eine hohe Rezidivrate vermitteln können.
In dieser Arbeit sollte dementsprechend basierend auf den bisherigen Erkenntnissen zu Pim1 sowie zur Bedeutung von Tumorstammzellen im malignen Geschehen der Einfluss der Serin-Threonin-Kinase Pim1 auf das Stammzellverhalten von Glioblastomzellen näher untersucht werden.
Durch den Vergleich von adhärent wachsenden Tumorzellen der Glioblastomzelllinie LN-18 mit stammzellähnlichen LN-18 Neurosphären konnte eine erhöhte relative mRNA-Expression von Pim1 und EGFR sowie der potentiellen Stammzellmarker Nestin, CD44, CD133 und Musashi-1 nachgewiesen werden. Die relative Proteinexpression von Pim1 sowie der Stammzellmarker Nestin, CD44, CD133 und Sox2 war in den Neurosphären im Vergleich zu den adhärent wachsenden LN-18 Zellen ebenfalls gesteigert. Diese Daten konnten durch die Immunfluoreszenz-Färbungen bestätigt werden.
Ein effizienter siRNA-vermittelter knockdown von Pim1 auf Proteinebene konnte in dieser Arbeit nicht erzielt werden, sodass keine Aussagen zu einer Regulation von Stammzell- und Differenzierungsmarker nach zielgerichteter genetischer Abschaltung von Pim1 getroffen werden konnten. Hier sind weiterführend Optimierungen notwendig oder der Einsatz spezieller CRISPR-Cas9-Verfahren zur genetischen Ausschaltung sinnvoll.
Die pharmakologische Inhibition von Pim1 mit LY294002 und TCS Pim1-1 führte zu einer signifikanten Reduktion der Neurosphärenformation sowie der Zellviabilität bei LN-18 Zellen, wodurch die in Vorarbeiten an adhärenten Glioblastomzellen gewonnenen Daten um Untersuchungen an stammzellartigen Glioblastomzellen erweitert wurden.
Zusammenfassend legen die in dieser Arbeit erhobenen Daten nahe, dass Pim1 das Stammzellverhalten von Glioblastomzellen beeinflusst, indem Pim1 Einfluss auf die Expression von Stammzellmarkern nimmt und seine Inhibition die Aufrechterhaltung einer Glioblastomstammzellpopulation beeinträchtigt, indem die Neurosphärenformation und die Viabilität der Zellen stark reduziert werden. Somit stellt Pim1 eine geeignete Zielstruktur für eine zielgerichtete Therapieoption beim Glioblastom dar, beispielsweise in Kombination mit der klassischen Radiochemotherapie. Zukünftige Studien müssen zeigen, inwieweit eine selektive Pim1-Inhibition tatsächlich Einfluss auf die Prognose von Patienten mit Glioblastom nimmt.
In vielen wissenschaftlichen Studien konnte die Bedeutung des NO-cGMP-PKG-Signalweges für die Regulation der Spannung von glatten Muskelzellen gezeigt werden. Im Mittelpunkt standen dabei oftmals die Guanylatzyklase, die Proteinkinase G oder zelluläre Kalziumkanäle und deren Bedeutung für die Muskeltätigkeit. In der vorliegenden Arbeit sollte über Modulatoren der zelluläre cGMP-Spiegel in glatten Gefäßmuskelzellen von Ratten verändert und durch Messung der Kontraktionsstärken dessen Einfluss auf das Kontraktionsverhalten nachgewiesen werden. Dabei sollte sowohl die Auswirkung von cGMP-Veränderungen auf die Spannung bei maximaler Stimulation als auch auf die Sensitivität für Phenylephrin untersucht werden. Nach Inkubation der Aorten mit einem cGMP-Modulator und Stimulation mit Phenylephrin wurden die Kontraktionen von Aortenringen über Schreiber direkt aufgezeichnet. Als Modulatoren wurden das Urikosurikum Probenecid, der Phosphodiesterasehemmer Sildenafil und der Inhibitor der löslichen Guanylatzyklase ODQ eingesetzt. Ein besonderer Fokus sollte darauf gelegt werden, inwiefern die Hemmung der MRP-Transportproteine 4 und 5 durch Probenecid- und Sildenafilinkubation auf den cGMP-Spiegel und damit die Spannung der glatten Muskelzellen auswirkt. In den Aufzeichnungen der Kontraktionen zeigte sich unter ODQ-Einfluss eine deutlich gesteigerte Spannung in g pro g Aortengewebe (Mw=2761,44*; SEM=236,4; n=9) bei maximaler Stimulation mit Phenylephrin im Vergleich zur Kontrolle (1515,15; 186; n=9). Unter Vorinkubation mit Sildenafil konnten sowohl mit der geringeren Konzentration von 1 µM (689,15*; 163,3; n=5) als auch bei 50 µM (187,17*; 154,5; n=5) signifikant niedrigere Spannungen festgestellt werden. In höherer Konzentration kommt neben der Inhibition der PDE auch der hemmende Einfluss von Sildenafil auf die MRP-Transporter zum Tragen. Auch nach der Inkubation mit Probenecid konnte sowohl mit 10 µM (783,70; 150,7; n=5) als auch mit 100 µM (693,64*; 128,4; n=5) eine verminderte Kontraktion der Gefäße festgestellt werden. Die Untersuchung der Sensitivität der Aorten auf Phenylephrin über Vergleiche der EC50-Werte ergab, dass insgesamt durch den Einsatz von cGMP-Modulatoren keine Veränderungen der Sensitivität verursacht werden. Schlussfolgernd ergibt sich aus den Ergebnissen dieser Arbeit, dass glatte Gefäßmuskulatur über cGMP-Modulatoren hinsichtlich der Maximalspannungen beeinflussbar ist und dass der cGMP-Transport über MRP 4 und 5 für die Kontraktion von glatten Muskelzellen physiologisch bedeutsam zu sein scheint, was neue Möglichkeiten des medikamentösen Eingreifens in die Gefäßregulation eröffnen könnte.
Zusammenfassung In der basalen Populationsstudie SHIP-0 (Study of Health in Pomerania) zeigten sich Assoziationen zwischen dem Zustand parodontaler Gewebsschädigung und dem Magnesiumserumspiegel. Außerdem ließen sich in SHIP-0 bei Einnahme magnesiumhaltiger Medikamente auch positive Wirkungen auf den Zahnhalteapparat erkennen. Ziel dieser Arbeit sollte es daher sein, diese Tendenzen im Rahmen der 5-Jahres-Folgestudie SHIP-1 zu verifizieren. Zu diesem Zwecke wurden die an SHIP-1 teilnehmenden Probanden zur Beziehung ihres basalen Magnesium/Kalzium-Verhältnisses zur Progression ihres parodontalen Zustands untersucht. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: 1. Bei einem hohen Magnesiumserumspiegel findet eine Verlangsamung der parodontalen Gewebedestruktion statt. 2. Es bestehen deutliche Dosis-Wirkungsbeziehungen des Magnesium/Kalzium-Verhältnisses im Serum zum parodontalen Status. 3. Der Magnesium-Effekt tritt unabhängig von vorhandenen zusätzlichen Risikofaktoren auf. Dies betrifft vor allem Bildung, Diabetes, Rauchen und das Alter. 4. Die Kombination aus weiblichem Geschlecht und Diabetes ist die wichtigste Ursache für ein geringes Magnesium/Kalzium-Verhältnis. 5. Ein hohes Gesundheitsbewusstsein, gekennzeichnet durch eine hohe Bildung und Nichtrauchen, ist mit einem hohen Magnesium/Kalzium-Status assoziiert. 6. Es nahmen von 4290 Probanden der SHIP-0 nur noch 3300 an SHIP-1 teil, deren Risikofaktorenverteilung sich verändert hat. Das follow-up ist daher nicht mehr bevölkerungs-repräsentativ, da besonders risikobelastete Patienten fernblieben. Diese Arbeit gibt damit einen Ausblick auf die möglichen Wirkungen des Magnesium/Kalzium-Verhältnisses und dessen Einfluss auf den Zahnhalteapparat. Ob sich durch Magnesiumeinnahme ein positiver Effekt auf die parodontale Situation erreichen lässt, muss durch weitere Untersuchungen geklärt werden.
Die unterschiedlichen gesetzlichen Bestimmungen hinsichtlich der Durchführung von Obduktionen in den beiden gewählten Untersuchungsabschnitten wirkten sich erheblich sowohl auf die Obduktionshäufigkeit als auch auf die Zusammensetzung des Obduktionsmaterials aus. Das Verhältnis von natürlichen zu nichtnatürlichen Todesfallen hatte sich im zweiten gegenüber dem ersten Untersuchungsabschnitt eindeutig zugunsten der natürlichen Todesfälle verschoben. Die gleichfalls festgestellte prozentuale Zunahme der Fälle mit alkoholinduzierten Organbefunden von 10,5% im ersten auf' 26,4% im zweiten Zeitraum dürfte auf den vorher genannten Umständen nur zum Teil zurück -zuführen sein. Ansonsten dokumentiert sich dadurch eine tatsächliche Zunahme alkoholbedingter Organschäden. Als Indiz für einen zunehmenden Alkoholmissbrauch ist nicht allein nur die Zunahme der alkoholbedingten Organveränderungen im zweiten Untersuchungsabschnitt anzusehen, sondern auch die im gleichen Zeitraum registrierte höhere Anteile der alkoholassoziierten Todesfälle, der Anstieg der durchschnittlichen Blutalkoholkonzentration bei Todeseintritt sowie auch das geringere Durchschnittsalter der Obduzierten mit alkoholbedingten Organveränderungen.
Viele periphere Blutzellen exprimieren ABC-Transporter an ihrer Zelloberfläche. Insbesondere konnten ABCC4 (MRP4) und ABCC5 (MRP5), die in Plasmamembranen verschiedener peripherer Blutzellen identifiziert wurden, spezifische Funktionen für die entsprechenden Zellpopulationen, wie z.B. die Mediatorspeicherung in den dichten Granula der Thrombozyten zugewiesen werden. Alle reifen Blutzellen stammen von derselben Stammzelle ab, sodass man annehmen muss, dass sich die spezifische Funktionalität und die dazugehörige zelluläre Ausstattung erst im Verlauf der Differenzierung ausbilden. Inwiefern sich diese Prozesse während der Differenzierung auf die Expression und Lokalisation von MRP4 und MRP5 auswirken, wurde bisher nicht untersucht. So wurde im Rahmen dieser Arbeit ein Zellmodell zur Isolierung CD34-positiver hämatopoetischer Stammzellen aus Nabelschnurblut entwickelt. Dies beinhaltete zudem die Behandlung CD34-positiver Zellen mit bestimmten Wachstumsfaktoren zur Differenzierung in die thrombozytäre und die myelomonozytäre Richtung. Darüber hinaus wurden die Leukämiezelllinien K562 und HL60 mit PMA, DMSO und Butyrat ausdifferenziert. Erstere in Richtung Thrombozyten, letztere in Richtung Makrophagen, Granulozyten und Monozyten. Der Differenzierungsnachweis wurde mittels FACS-Analyse geführt und die Expression von MRP4 und MRP5 im Anschluss auf mRNA und Protein-Ebene, mittels Real-Time PCR, Immunhistochemie, Western Blot und Akkumulationsassay erforscht. In den thrombozytär differenzierten CD34-positiven Zellen fand sich ein signifikant positiv korreliertes Verhältnis von MRP4 zu CD41a (Glykoprotein IIb/IIIa), hingegen eine negative Korrelation von MRP5 zu CD41a. Außerdem konnte im Laufe der Differenzierung in der Immunfluoreszenz eine zunehmende intrazelluläre Expression von MRP4 und eine Kolokalisation mit LAMP-2, einem Lysosomen- und Dense-Granula-Marker, gezeigt werden. Die myelomonozytären Zellen wiesen eine signifikante Reduktion an MRP4 und ebenfalls eine Verminderung der MRP5-Expression auf. In der Differenzierung der leukämischen Zelllinien wurde eine generelle Zunahme von MRP4 und MRP5 mit der Entdifferenzierung der Zellen in allen Linien gefunden. Die komplexen Vorgänge im Verlauf der menschlichen Hämatopoese umfassen also auch Veränderungen an MRP4- und MRP5-Expression in Qualität und Quantität. Sowohl in der physiologischen als auch in der pathologischen Zellentwicklung findet sich eine Regulation dieser beiden Transporter. Die Ergebnisse der Arbeit stützen die Annahme, dass MRP4 eine wichtige Rolle im Metabolismus der Thrombozyten spielt, hier besonders in der Speicherung und Freisetzung von cGMP, ADP und Serotonin. Die Transporterexpression in den Leukämiezelllinien steigt mit der Entdifferenzierung der Zellen. Aus dieser Erkenntnis ergeben sich therapeutische Überlegungen, Differenzierungsagenzien zur Überwindung der Multi-Drug-Resistenz mit Chemotherapeutika zu kombinieren.
Das Multidrug Resistance Protein 4 (MRP4/ABCC4) ist als Mitglied der ABC-Transporterfamilie nicht nur an dem Transport zahlreicher Pharmaka, wie beispielsweise antiviraler und zytostatischer Substanzen, sondern auch an Signaltransduktionsprozessen, z.B. dem Transport von Eicosanoiden und zyklischen Nukleotiden beteiligt. MRP4 weist außerdem innerhalb der ABCC-Gruppe ein einmaliges Expression-, Lokalisations- und Substratspektrum auf. MRP4 wurde neben Prostata, Niere, Gehirn und Leber auch in Blutplättchen nachgewiesen und kann zelltypabhängig sowohl apikal oder basolateral als auch intrazellulär lokalisiert sein. Insbesondere das Vorkommen in den δ-Granula der Thrombozyten ist bemerkenswert, da die Speicherung und Freisetzung von Überträgersubstanzen wie ADP auf die Thrombozytenfunktion entscheidenden Einfluss haben. Änderungen der zelltypischen MRP4-Lokalisation, die beispielsweise bei Patienten mit δ-storage pool Defekt beobachtet wurden, können zu einem Verlust der spezifischen Transporterfunktion führen. Das Ziel dieser Arbeit war es, das Transportprotein Multidrug resistance protein 4 in Bezug auf Protein-Protein-Wechselwirkungen genauer zu untersuchen. Da die Lokalisation von Membranproteinen u.a. durch die Wechselwirkung mit Proteinen gesteuert wird, stand die Identifikation möglicher Interaktionspartner von MRP4 mit Hilfe von Bindungs- und Kolokalisationsstudien im Vordergrund dieser Arbeit. Es schien sehr wahrscheinlich, dass Adaptormoleküle über eine Wechselwirkung mit MRP4 an dessen trafficking innerhalb der Zellen beteiligt sind und damit Einfluss auf dessen Lokalisation und konsekutiv auch auf die Funktion nehmen. Als mögliche Motive zur Vermittlung solcher Proteinbindungen liegen im MRP4-Molekül ein PDZ-Motiv sowie eine mögliche Bindungsstelle für Adaptorprotein (AP)-Komplexe vor. Zur Ermittlung solcher potentiellen Partner wurde eine Affinitätschromatographie durchgeführt. Dafür erfolgte die Kopplung eines Peptids, welches der C-terminalen Sequenz von MRP4 mit dem PDZ-Bindemotiv entsprach, an eine Sepharosematrix und eine anschließende Inkubation mit Thrombozytenlysat. Mittels Western Blot-Verfahren und Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie konnten im gewonnenen Eluat das ERM-bindende Phosphoprotein 50 (EBP50/NHERF1), Moesin, sowie das Post synaptic density protein 95 (PSD95) und das Hitzeschockprotein Hsp90 als mögliche Bindungspartner identifiziert werden. Während eine Wechselwirkung von MRP4 mit EBP50 über seine PDZ-Domäne bereits postuliert worden war, konnten insbesondere PSD95 und Hsp90 erstmalig als mögliche Interaktionspartner von MRP4 ermittelt werden. Da PSD95 bisher vorwiegend in neuronalen Zellen beschrieben wurde, wurde das Vorkommen dieses Proteins in Thrombozyten und der megakaryoblastischen Leukämiezelllinie M-07e auf RNA-Ebene untersucht und nachgewiesen. Damit konnte erstmals die Expression dieses scaffolding Proteins in Zellen der myeloischen Reihe gezeigt werden. Im Anschluss daran wurden Kofärbungen von MRP4 und den identifizierten Bindungspartnern durchgeführt. Die indirekte Immunfluoreszenzmikroskopie lieferte das Ergebnis einer zumindest partiellen Kolokalisation des Transporters mit Hsp90 – in Thrombozyten und M-07e-Zellen in intrazellulären Strukturen, in den Nierenepithelzellen LLC-PK1 und MDCKII in der Plasmamembran. Auch eine Kolokalisation von MRP4 mit PSD95 konnte in M-07e-Zellen und Thrombozyten beobachtet werden. Untersuchungen mit dem Hsp90-Hemmstoff Radicicol ergaben des Weiteren zum einen eine sichtbare Verringerung der MRP4-Expression im Western Blot nach der Inkubation, zum anderen auch eine Änderung der Lokalisation von Hsp90 und MRP4 in den verwendeten Nierenzelllinien nach intrazellulär. Ferner konnten funktionelle Transportversuche unter Verwendung von inside-out Thrombozytenmembranvesikeln einen Abfall der Aufnahme des radioaktiv markierten MRP4-Substrats cGMP in die Vesikel nach Behandlung mit Radicicol zeigen. Um den Einfluss von PSD95 auf die MRP4-Lokalisation zu untersuchen, wurde ein spezifischer knock-down von PSD95 mittels siRNA in M-07e-Zellen durchgeführt. Im Anschluss ergab sich in der Immunfluoreszenzmikroskopie eine deutliche Zunahme der MRP4-Lokalisation in der Plasmamembran. Zusammenfassend konnten im Rahmen dieser Arbeit EBP50, Moesin, PSD95 und Hsp90 als mögliche Bindungspartner von MRP4 in Thrombozyten identifiziert werden. Es ist denkbar, dass Hsp90 als Hitzeschockprotein möglicherweise zu der Prozessierung und Stabilisierung von MRP4 beiträgt. Die Interaktion mit PSD95 hingegen scheint die Internalisierung des Transportproteins zu begünstigen. Die gewonnenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass Protein-Protein-Interaktionen die Lokalisation und Funktion von MRP4 entscheidend beeinflussen.
Die Physiologie des Magens mit den unterschiedlichen Gegebenheiten im proximalen und distalen Magen stellt einen relevanten Einflussfaktor auf die Pharmakokinetik von oral applizierten Wirkstoffen dar. Innerhalb der peroralen Pharmakotherapie nimmt die Sondenapplikation von Arzneimitteln dabei eine Sonderrolle ein, da je nach Lokalisation des Sondenendes die Applikation tendenziell eher in proximale oder distale Anteile des Magens erfolgt. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Pharmakokinetik bei Sondenapplikation hinsichtlich der Variablen Sondenlage‚ Nahrungsaufnahme und Nüchternmotilität. Hierzu wurde in einer kontrollierten, randomisierten, drei-armigen Cross-Over-Studie an zwölf gesunden, männlichen Probanden 540 mg einer Paracetamol-Suspension über einen Zeitraum von sechs Stunden jeweils in den distalen und proximalen Magen infundiert. Unsere Ergebnisse konnten zeigen, dass die Bedingungen „proximale Applikation“ und „Nahrungsaufnahme“ die Wahrscheinlichkeit einer Retention im proximalen Magen erhöht. Merkmale hierfür waren größere Abweichungen der Invasionskinetik von der Applikationsrate im Sinne einer verspäteten Anflutung, vermehrt Schwankungen der Invasionsrate und mehr Nachflutungen in der Eliminationsphase. Umgekehrt ging die distale Applikation mit einer größeren Kontinuität der Invasion einher. Hinsichtlich der Invasionskinetik häuften sich bei Nahrungskarenz und proximaler Sondenlage Merkmale, die für einen Einfluss der interdigestiven Motilität auf die Pharmakokinetik sprechen. Limitiert wurde die Aussagekraft zum Einfluss der Nüchternmotilität durch das Fehlen einer simultanen Aufzeichnung der Motilität, zum Beispiel mittels elektrischer Impedanzmessung. Die angewandte Methodik mit kontinuierlicher Infusion der Prüfsubstanz, regelmäßigen Messungen der Serumkonzentration und Berechnung der Invasionskinetik mittels schneller Fouriertransformation erwies sich zur Untersuchung der Fragestellung als gut geeignet und kann als Grundlage zukünftiger Forschungen dienen.
Die optimale Behandlung von Patienten mit einer akuten Pankreatitis hängt stark von der frühen Prognose des Verlaufs der Erkrankung ab. In 80% der Fälle verläuft die akute Pankreatitis mild und die Patienten verlassen innerhalb einer Woche beschwerdefrei das Krankenhaus. Bei. 20% der Patienten nimmt die Erkrankung einen schweren Verlauf mit Komplikationen wie z.B. SIRS, Sepsis. Diese Patienten entwickeln (infizierte) Pankreasnekrosen, (Multi)-Organversagen und benötigen eine intensivmedizinische Betreuung. In 10-20% endet die schwere akute Pankreatitis tödlich. Bis zum jetzigen Zeitpunkt gibt es keine validen Marker die zuverlässig den Schweregrad der akuten Pankreatitis vorhersagen. Mustererkennungsrezeptoren sind Teil des angeborenen Immunsystems und dienen als Sensoren für pathogen bakterielle Bestandteile. Nach Erkennen der Bakterien werden pro- und anti-inflammatorische Immunantworten eingeleitet, die für die Eliminierung der Bakterien zuständig sind. Zur Familie der Mustererkennungsrezeptoren gehören u.a. die Toll-like Rezeptoren und die Nod-like Rezeptoren. Viele Studien konnten Assoziationen zwischen Mutationen in Mustererkennungsrezeptoren und immunologischen Erkrankungen aufzeigen. Die am besten untersuchten Assoziationen sind die zwischen Morbus Crohn und Mutationen in Toll-like Rezeptor 4 (TLR4) oder Nod-like Rezeptor 2 (NOD2). Mutationen in diesen Rezeptoren führen zu einem Funktionsverlust der Rezeptoren und verhindern eine effektive Eliminierung von Bakterien. Dadurch wird z.B. die entzündliche Darmerkrankung Morbus Crohn begünstigt. Während der akuten Pankreatitis, einer primär sterilen Inflammation, bilden sich bei einem schweren Verlauf, durch in das Pankreas translozierende Darmbakterien, (infizierte) Pankreasnekrosen. Die Annahme, dass ein Funktionsverlust der Mustererkennungsrezeptoren TLR4 oder NOD2 den Schweregrad der akuten Pankreatitis und das Ausbilden infizierter Pankreasnekrosen beeinflusst, sollte in dieser Arbeit sowohl bei Patienten mit akuter Pankreatitis als auch im Tiermodell der Nod2-knock-out Maus überprüft werden. Mutationen im Toll-like Rezeptor 4 wurden in dieser Arbeit weder als Risikofaktoren für die akute Pankreatitis, noch den Schweregrad der akuten Pankreatitis oder das Überleben identifiziert. Wir detektierten in Patienten mit akuter Pankreatitis und gesunden Blutspendern für die TLR4 Mutationen Asp299Gly und Thr399Ile vergleichbare Allelfrequenzen. Anders verhielt es sich für die Mutationen im Nod-like Rezeptor 2. Die Mutation Arg702Trp dieses Mustererkennungsrezeptors konnte als ein Risikofaktor für eine erhöhte Mortalität bei Patienten mit einer schweren akuten Pankreatitis identifiziert werden. Wir können zeigen, dass sich das Risiko, an einer schweren akuten Pankreatitis zu versterben bei heterozygoten Mutationsträgern auf 2,5 und bei Homozygoten auf das 9-fache erhöht. Mutationen in Arg702Trp führten allerdings nicht vermehrt zur Entwicklung von Sepsis oder (infizierten) Pankreasnekrosen. Lediglich die Häufigkeit ein Multiorganversagen zu entwickeln, war bei Mutationsträgern signifikant erhöht. Die beiden anderen untersuchten NOD2 Mutationen (Gly908Arg und Leu1007fsinsC) hatten keinen signifikanten Effekt auf die Entwicklung einer akuten Pankreatitis. Untersuchungen der Rolle einer Nod2-Defizienz im experimentellen Mausmodell der schweren nekrotisierenden Pankreatitis zeigten einen im Vergleich zum Menschen unterschiedlichen Phänotyp hinsichtlich des Verlaufs der schweren akuten Pankreatitis. Die lokalen Schäden am Pankreas, aber auch die systemischen Reaktionen waren in den ersten 36h nach Induktion der nekrotisierenden Pankreatitis nicht wesentlich verändert. Das Langzeitüberleben (14 Tage) der Nod2-defizienten Mäuse war jedoch deutlich verbessert. Wir stellten in den Nod2 knock-out Tieren sowohl eine persistierende intestinale Barrierestörung, als auch eine epitheliale Barrierestörung der Lunge fest. Als Konsequenz war bereits in den unbehandelten Nod2-defizienten Tiere eine erhöhte bakterielle Translokation und eine erhöhte Neutrophilentransmigration ins Gewebe sichtbar. Durch die Barrierestörungen entwickeln die Nod2 knock-out Mäuse eine Toleranz gegenüber den infiltrierenden Bakterien. Diese Toleranzentwicklung kommt 48h nach Induktion der Pankreatitis zum Tragen. Zu diesem Zeitpunkt stellt sich bei den Nod2-defizienten Mäusen ein hypoinflammatorischer Zustand ein. Im Vergleich dazu verstarben die Wildtyp-Mäuse an den Folgen sekundärer Infektionen und einem daraus resultierenden Organversagen. Die NOD2 Mutation Arg702Trp ist somit ein Risikofaktor und potentieller genetischer Prognosemarker für eine erhöhte Mortalität in Folge einer schweren akuten Pankreatitis. Der Funktionsverlust von NOD2 beeinflusst den systemischen Verlauf der schweren akuten Pankreatitis und trägt zu einer deregulierten inflammatorischen Antwort und verschlechterten bakteriellen Kompensation bei. Der lokale Schaden am Pankreas während der schweren akuten Pankreatitis ist dagegen vergleichbar zwischen Patienten mit und ohne NOD2 Arg702Trp Mutation. Ursächlich für das bessere Überleben der NOD2 knock-out Mäuse ist vermutlich die induzierte Barrierestörung, die eine bakterielle Toleranz in diesen knock-out Mäusen induziert. Dadurch wird unter schwerer akuter Pankreatitis eine Entgleisung des Immunsystems verhindert und die bakterielle Translokation in die Organe deutlich effizienter kompensiert. Vergleichende Untersuchungen mit einem knock-out/knock-in Model der NOD2 Mutation Arg702Trp könnten dazu beitragen den Pathomechanismus dieser spezifischen NOD2-Mutation im Menschen weiter aufzuschlüsseln.
Der Nukleäre Rezeptor SHP1 ist ein zentrales Stellglied zahlreicher biologischer Prozesse. So reguliert SHP1 über direkte Protein-Protein-Interaktion mit Nukleären Rezeptoren Stoffwechselwege, wie den Gallensäure-, Cholesterin- und Lipidmetabolismus sowie die Glucosehomöostase und den Arzneimittelstoffwechsel. Erweiternd konnte kürzlich ein tumorsupprimierender Effekt des SHP1 gezeigt werden. So wurde die Entwicklung eines Hepatozellulären Karzinoms im Mausmodell in Abwesenheit des SHP1 beschrieben. Es ist bekannt, dass SHP1 nicht nur in hepatischem Gewebe, sondern auch in Lunge, Herz, Milz, Dünndarm, Pankreas, Niere, Nebenniere und Hirn exprimiert ist. In einer orientierenden Expressionsanalyse konnten wir eine verminderte SHP1 Expression in Tumorentitäten der Organe Niere, Lunge und Magen zeigen. Diese Ergebnisse konnten in den Proben einer Kohorte von an einem klarzelligen Nierenzellkarzinom erkrankten Patienten verifiziert werden. Es zeigte sich eine signifikant verminderte SHP1 Expression im klarzelligen Nierenzellkarzinom (RCC) im Vergleich zu Nierengewebe. Nachfolgend konnten wir mittels adenoviral vermittelter Überexpression des SHP1 in einem Zellmodell des RCC einen antiproliferativen Effekt des SHP1 im RCC zeigen. Bisher wurde die Vermittlung dieser antiproliferativen Komponente über eine Hemmung des CyclinD1 durch SHP1 vermutet. Zwar konnten wir im Einklang hiermit eine verminderte CyclinD1 Expression im RCC gegenüber Niere detektieren, nach Überexpression des SHP1 zeigte sich jedoch keine Suppression des CyclinD1, so dass davon auszugehen ist, dass die antiproliferative Wirkung des SHP1 im RCC über andere Zielstrukturen vermittelt wird. Da sich das RCC durch eine hohe Chemotherapieresistenz auszeichnet und SHP1 in den Arzneimittelstoffwechsel involviert ist, untersuchten wir den Einfluss des SHP1 auf die Chemosensitivität des RCC. Hier konnten wir zunächst keinen Einfluss des SHP1 auf die Viabilität des zellulären Modells des RCC durch die Substanzen Vinblastin, Temsirolimus und Sunitinib zeigen. Dennoch ist ein Einfluss des SHP1 auf die Proliferationshemmung durch diese Substanzen nicht auszuschließen. Abschließend untersuchten wir Ursachen für die verminderte SHP1 Expression im RCC. Hier zeigte sich, dass sowohl eine verminderte Expression von Aktivatoren des SHP1 als auch genetischen Varianten in der Promotorregion des SHP1 zunächst nicht ursächlich für die Minderexpression im RCC zu sein scheinen. Zusammenfassend konnten wir den Nukleären Rezeptor SHP1 als Tumorsuppressorgen des klarzelligen Nierenzellkarzinoms, dessen Pathogenese nach dem heutigen Wissensstand nicht geklärt ist, identifizieren. Basierend auf der antiproliferativen Wirkung könnte der SHP1 zukünftig ein Zielmolekül einer pharmakologischen Therapie des RCC darstellen.
Das Prostatakarzinom ist in den westlichen Ländern der häufigste Krebs des Mannes und verantwortlich für einen beträchtlichen Teil der von Krebs verursachten Todesfälle. Es ist in fortgeschrittenen Stadien einer Zytostatikatherapie nur schwer zugänglich, neue Therapieansätze sind deshalb notwendig. In dieser Hinsicht ist „tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand“ (TRAIL) ein aussichtsreicher Kandidat, da er selektiv toxisch auf Tumorzellen wirkt. Allerdings entfaltet TRAIL allein in vielen Tumorzellen keine ausreichende Wirkung. Die Beeinflussung intrazellulärer Resistenzfaktoren zur Sensibilisierung der Tumorzellen ist hier ein vielversprechender Ansatzpunkt. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass die spezifische Herabregulation der Proteinkinase C(eta); in PC3-Prostatakarzinomzellen durch chimäre Zweitgenerations-Antisense-Oligonukleotide die zytotoxischen Effekte von TRAIL signifikant verstärkt. Nach „Knock-down“ der PKC(eta); zeigt sich ein deutlicher Anstieg der TRAIL-induzierten Apoptose-typischen Veränderungen, wie Caspase 3-Aktivierung und nukleosomale DNA-Fragmentierung. Außerdem kommt es zur Verstärkung der TRAIL-induzierten Störung des mitochondrialen Membranpotentials und einer erhöhten Cytochrom c-Freisetzung, was dafür spricht, dass die PKC(eta); innerhalb des Apoptosesignalweges oberhalb der Mitochondrien wirksam ist. Die PKC(eta); kann in Bezug auf TRAIL somit als ein bedeutender Resistenzfaktor in Prostatakarzinomzellen angesehen werden und ist damit ein vielversprechender Angriffspunkt zur Verstärkung der antineoplastischen Effekte von TRAIL. Im weiteren werden in dieser Arbeit mit Bcl-2 und Bcl-xL zwei bekannte antiapoptotische Proteine mit der Fragestellung untersucht, ob sie als Resistenzfaktoren in der TRAIL-induzierten Apoptose von PC3-Prostatakarzinomzellen eine wichtige Funktion besitzen. Gegen die Erwartungen hat der „Knock-down“ von Bcl-2 jedoch keinerlei Auswirkungen auf den TRAIL-induzierten Zelltod. Anders Bcl-xL: dessen Herabregulation führt zu einer signifikanten Verstärkung der Störung der Mitochondrienfunktion, der Caspase 9- und 3-Aktivitäten und des apoptotischen Zelltodes nach TRAIL-Behandlung. Die beiden Proteine scheinen in Prostatakarzinomzellen also unterschiedliche Funktionen in Bezug auf den TRAIL-aktivierten Apoptoseweg zu haben, wobei Bcl-xL als vielversprechendes Zielmolekül zur Potenzierung der zytotoxischen Effekte von TRAIL genannt werden kann. Zusammengenommen legen diese Befunde nahe, dass PKC(eta); und Bcl-xL erfolgversprechende Zielmoleküle zur Verbesserung der Therapie des Prostatakarzinoms, vor allem im Hinblick auf eine mögliche therapeutische Anwendung von TRAIL, darstellen.
Dynamics of Vascular Protective and Immune Supportive Sphingosine-1-Phosphate During Cardiac Surgery
(2021)
Introduction
Sphingosine-1-phosphate (S1P) is a signaling lipid and crucial in vascular protection and immune response. S1P mediated processes involve regulation of the endothelial barrier, blood pressure and S1P is the only known inducer of lymphocyte migration. Low levels of circulatory S1P correlate with severe systemic inflammatory syndromes such as sepsis and shock states, which are associated with endothelial barrier breakdown and immunosuppression. We investigated whether S1P levels are affected by sterile inflammation induced by cardiac surgery.
Materials and Methods
In this prospective observational study we included 46 cardiac surgery patients, with cardiopulmonary bypass (CPB, n=31) and without CPB (off-pump, n=15). Serum-S1P, S1P-sources and carriers, von-Willebrand factor (vWF), C-reactive protein (CRP), procalcitonin (PCT) and interleukin-6 (IL-6) were measured at baseline, post-surgery and at day 1 (POD 1) and day 4 (POD 4) after surgical stimulus.
Results
Median S1P levels at baseline were 0.77 nmol/mL (IQR 0.61-0.99) and dropped significantly post-surgery. S1P was lowest post-surgery with median levels of 0.37 nmol/mL (IQR 0.31-0.47) after CPB and 0.46 nmol/mL (IQR 0.36-0.51) after off-pump procedures (P<0.001). The decrease of S1P was independent of surgical technique and observed in all individuals. In patients, in which S1P levels did not recover to preoperative baseline ICU stay was longer and postoperative inflammation was more severe. S1P levels are associated with its sources and carriers and vWF, as a more specific endothelial injury marker, in different phases of the postoperative course. Determination of S1P levels during surgery suggested that also the anticoagulative effect of heparin might influence systemic S1P.
Discussion
In summary, serum-S1P levels are disrupted by major cardiac surgery. Low S1P levels post-surgery may play a role as a new marker for severity of cardiac surgery induced inflammation. Due to well-known protective effects of S1P, low S1P levels may further contribute to the observed prolonged ICU stay and worse clinical status. Moreover, we cannot exclude a potential inhibitory effect on circulating S1P levels by heparin anticoagulation during surgery, which would be a new pro-inflammatory pleiotropic effect of high dose heparin in patients undergoing cardiac surgery.
(1) Background: Sepsis is a leading cause of death and a global public health problem. Accordingly, deciphering the underlying molecular mechanisms of this disease and the determinants of its morbidity and mortality is pivotal. This study examined the effect of the rs951818 SNP of the negative costimulatory lymphocyte-activation gene 3 (LAG-3) on sepsis mortality and disease severity. (2) Methods: 707 consecutive patients with sepsis were prospectively enrolled into the present study from three surgical ICUs at University Medical Center Goettingen. Both 28- and 90-day mortality were analyzed as the primary outcome, while parameters of disease severity served as secondary endpoints. (3) Results: In the Kaplan–Meier analysis LAG-3 rs951818 AA-homozygote patients showed a significantly lower 28-day mortality (17.3%) compared to carriers of the C-allele (23.7%, p = 0.0476). In addition, these patients more often received invasive mechanical ventilation (96%) during the course of disease than C-allele carriers (92%, p = 0.0466). (4) Conclusions: Genetic profiling of LAG-3 genetic variants alone or in combination with other genetic biomarkers may represent a promising approach for risk stratification of patients with sepsis. Patient-individual therapeutic targeting of immune checkpoints, such as LAG-3, may be a future component of sepsis therapy. Further detailed investigations in clinically relevant sepsis models are necessary.
Organic cation transporter 1 (OCT1, SLC22A1) is localized in the sinusoidal membrane of human hepatocytes and mediates hepatic uptake of weakly basic or cationic drugs and endogenous compounds. Common amino acid substitutions in OCT1 were associated with altered pharmacokinetics and efficacy of drugs like sumatriptan and fenoterol. Recently, the common splice variant rs35854239 has also been suggested to affect OCT1 function. rs35854239 represents an 8 bp duplication of the donor splice site at the exon 7-intron 7 junction. Here we quantified the extent to which this duplication affects OCT1 splicing and, as a consequence, the expression and the function of OCT1. We used pyrosequencing and deep RNA-sequencing to quantify the effect of rs35854239 on splicing after minigene expression of this variant in HepG2 and Huh7 cells and directly in human liver samples. Further, we analyzed the effects of rs35854239 on OCT1 mRNA expression in total, localization and activity of the resulting OCT1 protein, and on the pharmacokinetics of sumatriptan and fenoterol. The 8 bp duplication caused alternative splicing in 38% (deep RNA-sequencing) to 52% (pyrosequencing) of the minigene transcripts when analyzed in HepG2 and Huh7 cells. The alternatively spliced transcript encodes for a truncated protein that after transient transfection in HEK293 cells was not localized in the plasma membrane and was not able to transport the OCT1 model substrate ASP+. In human liver, however, the alternatively spliced OCT1 transcript was detectable only at very low levels (0.3% in heterozygous and 0.6% in homozygous carriers of the 8 bp duplication, deep RNA-sequencing). The 8 bp duplication was associated with a significant reduction of OCT1 expression in the human liver, but explained only 9% of the general variability in OCT1 expression and was not associated with significant changes in the pharmacokinetics of sumatriptan and fenoterol. Therefore, the rs35854239 variant only partially changes splicing, causing moderate changes in OCT1 expression and may be of only limited therapeutic relevance.
The tricyclic antidepressant amitriptyline is frequently prescribed but its use is limited by its narrow therapeutic range and large variation in pharmacokinetics. Apart from interindividual differences in the activity of the metabolising enzymes cytochrome P450 (CYP) 2D6 and 2C19, genetic polymorphism of the hepatic influx transporter organic cation transporter 1 (OCT1) could be contributing to interindividual variation in pharmacokinetics. Here, the impact of OCT1 genetic variation on the pharmacokinetics of amitriptyline and its active metabolite nortriptyline was studied in vitro as well as in healthy volunteers and in depressive disorder patients. Amitriptyline and nortriptyline were found to inhibit OCT1 in recombinant cells with IC50 values of 28.6 and 40.4 µM. Thirty other antidepressant and neuroleptic drugs were also found to be moderate to strong OCT1 inhibitors with IC50 values in the micromolar range. However, in 35 healthy volunteers, preselected for their OCT1 genotypes, who received a single dose of 25 mg amitriptyline, no significant effects on amitriptyline and nortriptyline pharmacokinetics could be attributed to OCT1 genetic polymorphism. In contrast, the strong impact of the CYP2D6 genotype on amitriptyline and nortriptyline pharmacokinetics and of the CYP2C19 genotype on nortriptyline was confirmed. In addition, acylcarnitine derivatives were measured as endogenous biomarkers for OCT1 activity. The mean plasma concentrations of isobutyrylcarnitine and 2-methylbutyrylcarnitine were higher in participants with two active OCT1 alleles compared to those with zero OCT1 activity, further supporting their role as endogenous in vivo biomarkers for OCT1 activity. A moderate reduction in plasma isobutyrylcarnitine concentrations occurred at the time points at which amitriptyline plasma concentrations were the highest. In a second, independent study sample of 50 patients who underwent amitriptyline therapy of 75 mg twice daily, a significant trend of increasing amitriptyline plasma concentrations with decreasing OCT1 activity was observed (p = 0.018), while nortriptyline plasma concentrations were unaffected by the OCT1 genotype. Altogether, this comprehensive study showed that OCT1 activity does not appear to be a major factor determining amitriptyline and nortriptyline pharmacokinetics and that hepatic uptake occurs mainly through other mechanisms.
Exogenous glucocorticoids increase the risk for osteoporosis, but the role of endogenous glucocorticoids remains elusive. Here, we describe the generation and validation of a loss- and a gain-of-function model of the cortisol producing enzyme 11β-HSD1 (HSD11B1) to modulate the endogenous glucocorticoid conversion in SCP-1 cells — a model for human mesenchymal stem cells capable of adipogenic and osteogenic differentiation. CRISPR-Cas9 was successfully used to generate a cell line carrying a single base duplication and a 5 bp deletion in exon 5, leading to missense amino acid sequences after codon 146. These inactivating genomic alterations were validated by deep sequencing and by cloning with subsequent capillary sequencing. 11β-HSD1 protein levels were reduced by 70% in the knockout cells and cortisol production was not detectable. Targeted chromosomal integration was used to stably overexpress HSD11B1. Compared to wildtype cells, HSD11B1 overexpression resulted in a 7.9-fold increase in HSD11B1 mRNA expression, a 5-fold increase in 11β-HSD1 protein expression and 3.3-fold increase in extracellular cortisol levels under adipogenic differentiation. The generated cells were used to address the effects of 11β-HSD1 expression on adipogenic and osteogenic differentiation. Compared to the wildtype, HSD11B1 overexpression led to a 3.7-fold increase in mRNA expression of lipoprotein lipase (LPL) and 2.5-fold increase in lipid production under adipogenic differentiation. Under osteogenic differentiation, HSD11B1 knockout led to enhanced alkaline phosphatase (ALP) activity and mRNA expression, and HSD11B1 overexpression resulted in a 4.6-fold and 11.7-fold increase in mRNA expression of Dickkopf-related protein 1 (DKK1) and LPL, respectively. Here we describe a HSD11B1 loss- and gain-of-function model in SCP-1 cells at genetic, molecular and functional levels. We used these models to study the effects of endogenous cortisol production on mesenchymal stem cell differentiation and demonstrate an 11β-HSD1 dependent switch from osteogenic to adipogenic differentiation. These results might help to better understand the role of endogenous cortisol production in osteoporosis on a molecular and cellular level.
Organic cation transporter OCT1 is strongly expressed in the sinusoidal membrane of hepatocytes. OCT1 mediates the uptake of weakly basic and cationic compounds from the blood into the liver and may thereby facilitate the first step in hepatic metabolism or excretion of many cationic drugs. OCT1 is a polyspecific transporter and has a very broad spectrum of structurally highly diverse ligands (substrates and inhibitors). The exact transport mechanism and the amino acids involved in polyspecific ligand binding of OCT1 are poorly understood.
The aim of this work was to utilize the polyspecificity to better understand the structure-function relationships of OCT1 and to gain first insights into potential mechanisms conferring the polyspecificity. We followed two strategies, analyzing the effects of variability in both ligand and transporter structure on OCT1 function. The effects of ligand structure were analyzed by comparing uptake and inhibitory potencies of structurally similar drugs of the group of opioids. The effects of transporter structure were analyzed by comparing the effects of variability caused by naturally occurring genetic variants or artificial mutations on OCT1 uptake and inhibition of several substrates. Most importantly, the effects of interspecies variability in transporter structure were analyzed by comparing uptake kinetics between human and mouse OCT1 orthologs. To this end, we used stably or transiently transfected HEK293 cells overexpressing OCT1 and different chimeric and mutant variants thereof.
Focusing on OCT1 ligands, we compared the uptake and inhibitory potencies of structurally similar opioids. Only minor changes of the ligand structure strongly affected the interaction with OCT1. The presence of the ether linkage between C4 and C5 of the morphinan ring was associated with reduced OCT1 inhibitory potencies, while passive membrane permeability was the major negative determinant of OCT1-mediated uptake among structurally highly similar morphinan opioids. Only minor structural changes strongly increased the inhibitory potency by 28-fold from the lowest IC50 of 2004 µM for oxycodone to 72 µM for morphine. Additional removal of the ether linkage between C4-C5 increased the inhibitory potency by a total of 313-fold to the lowest IC50 of 6 µM for dextrorphan. Consequently, our data demonstrates that despite its polyspecificity, OCT1-mediated uptake and inhibition of this uptake is still somewhat very specific.
Focusing on OCT1 protein structure, we first analyzed the effects of variability caused by naturally occurring genetic variants on OCT1 uptake and inhibition. OCT1 transport was strongly affected by OCT1 genetic variants and these effects were often substrate-specific. Correlation of these effects revealed several substrates that were similarly affected by the variants and may therefore be suggested to share similar or overlapping binding sites in OCT1. In addition, the effects of the genetic variants OCT1*2 and OCT1*3 on different substrates correlated well which may suggest that the structural variability caused by these two variants similarly affects substrate uptake. OCT1 genetic variants also affected the inhibition of OCT1, with both substrate and genotype-specific differences. Ranitidine inhibited the uptake of several substrates, among them the clinically relevant drugs metformin and morphine. Moreover, the inhibition was more potent (about 2-fold) on the uptake mediated by the common genetic variant OCT1*2 than on the uptake mediated by the reference OCT1*1.
Second, we analyzed the effects of artificial mutations of key amino acids. Tyr222 and Asp475 in rat OCT1 had strongly substrate-specific and also species-specific effects on both OCT1-mediated uptake and inhibition. Mutation of these amino acids strongly decreased OCT1-mediated uptake, which further underscored an important role especially of Asp475. Interestingly, despite a proposed essential role of this amino acid, we observed Asp475-independent transport. This transport was observed in mouse, but not in human OCT1 and was substrate-specific. TMH10 was identified to be involved in determining the Asp475-independent uptake of mouse OCT1.
Finally and most importantly, we analyzed the effects of sequence differences between human and mouse OCT1 on the transport kinetics of several OCT1 substrates. The transport kinetics differed strongly between human and mouse OCT1 orthologs. These differences were substrate-specific and affected both the affinity (KM) and capacity (vmax) of transport. Human OCT1 had an 8-fold higher capacity of trospium transport, while mouse OCT1 had an 8-fold higher capacity of fenoterol transport. Furthermore, mouse OCT1 had a 5-fold higher affinity for metformin transport compared to human OCT1. The difference between Phe32 in human and Leu32 in mouse OCT1 in TMH1 was identified to confer a higher capacity of transport by human compared to mouse OCT1, while the difference between Cys36 in human and Tyr36 in mouse OCT1 in TMH1 was identified to confer a higher capacity of transport by mouse compared to human OCT1. Furthermore, Leu155 in human OCT1, corresponding to Val156 in mouse OCT1 in TMH2, in concert with TMH3 were identified to confer the differences in affinity for metformin transport between the species.
It may be speculated that ligand binding in OCT1 involves a core binding region that includes Asp474/475 and that polyspecific ligand binding is enabled by providing further binding partners (different amino acids) in more peripheral regions that different ligands can selectively interact with. This mechanism may also be a first step in explaining the substrate-specific effects of genetic variants with clinical relevance. Based on our findings, these “polyspecificity regions” may include TMH1, TMH2, and TMH3. Further analyses are warranted to characterize and narrow down these regions to unravel the structure-function relationships and with that the polyspecificity of OCT1.
To summarize, variability in both ligand and transporter structure strongly affected OCT1 function and we were able to identify ligand structures that affect inhibitory potency and protein structures that confer species-specific differences in OCT1 transport. This work emphasizes again the complexity of OCT1 transport and structure-function relationships. We also showed that, in spite of the difficulties for experimental analysis and data interpretation that arise from the polyspecific nature of OCT1, polyspecificity can also be used as a tool to better understand the structure-function relationships of this transporter.
Das Pankreaskarzinom ist eine maligne Tumorerkrankung mit sehr schlechter Prognose. In der Therapie werden, bislang allerdings nur mit begrenztem Erfolg, verschiedenste Chemotherapeutika verwendet. Die Gründe für dieses Therapieversagen sind noch weitgehend unklar, jedoch wird vermutet, dass die Aufnahme und Elimination der jeweiligen Zytostatika in die malignen Zellen eine Rolle spielen. Daher sind in dieser Arbeit die beiden ABC-Transporter MRP4 und MRP5, die als Effluxtransporter für diese Zytostatika diskutiert werden, hinsichtlich ihrer mRNA- und Proteinexpression, ihrer zellulären Lokalisation sowie ihrer möglichen Funktion in vier Pankreaskarzinomzelllinien (Capan-1, Capan-2, PaTu 8988 T und PaTu 8902) näher charakterisiert worden. Dabei zeigten sich zunächst zelllinienspezifische Unterschiede in der Transporterexpression, wobei MRP5 im Gegensatz zu MRP4 in allen untersuchten Zelllinien relativ stark exprimiert war. Die Membranständigkeit ließ sich an fast allen unters uchten Zelllinien eindeutig nachweisen. In folgenden Zytotoxizitätsversuchen wurden die beiden Capanzelllinien, ausgewählt aufgrund ihres unterschiedlichen Ursprungs, hinsichtlich möglicher Unterschiede im Ansprechen auf unterschiedliche Substanzen untersucht. Mit Blick auf einen möglichen Zusammenhang zwischen Therapieresistenz beim Pankreaskarzinom und der MRP4, 5 Transporterexpression erschienen hier vor allem Purin- und Pyrimidinanaloga interessant. Hierbei wurden, im Vergleich zu ersteren, wesentlich niedrigere IC50-Werte für die Pyrimidinanaloga ermittelt, was durch eine Interaktion zwischen Purinanaloga und den MRP-Transportern erklärbar wäre. Eine anschließende Inhibierung der Effluxtransporter durch Probenecid führte ebenfalls gerade bei den Purinanaloga zu einer verstärkten Empfindlichkeit, während hier die anderen untersuchten Wirkstoffe keine Reduktion bzw. sogar ein Anstieg der Zellviabilität bewirkten. Zusammenfassend scheint die Expression der beiden Effluxtr ansporter für die beim Pankreaskarzinom auftretende Zytostatikaresistenz von Bedeutung zu sein. Diese Arbeit gibt dabei insbesondere Hinweise auf eine Beteiligung des ABC-Transporters MRP5 möglicherweise auch von MRP4 an diesen Prozessen. Welche Bedeutung diese Ergebnisse jedoch für das in vivo geschehen haben werden bleibt abzuwarten.
Der ß-Adrenozeptorenblocker Talinolol (TAL) und das Herzglykosid Digoxin (DIG) sind geeignete Substrate, um die Expression von intestinalem P-Glykoprotein beim Menschen zu untersuchen.. Basierend auf der Tatsache, dass Digoxin-Plasmaspiegel bei hyperthyreoten Patienten niedriger sind als bei euthyreoten Personen, sollte mit der vorliegenden Arbeit untersucht werden, ob Schilddrüsenhormone einen Einfluss auf die intestinale P-gp-Expression haben. Dazu wurde an 8 gesunden Probanden (4 männl., 4 weibliche, 22-29 Jahre) die Pharmakokinetik von intravenös (30 mg) und oral (100 mg) appliziertem Talinolol vor und nach 17tägiger Gabe von Thyroxin untersucht. Mittels Immunhistochemie und RT-PCR wurde die intestinale P-gp-Expression in Dünndarmbiopsien, welche den Probanden vor und nach Thyroxin-Gabe entnommen wurden, bestimmt. Ergebnisse: (1) Durch 17tägige Gabe von Thyroxin lässt sich bei gesunden Probanden das Bild einer subklinischen Hyperthyreose erzielen. (2) Nach der Behandlung mit Thyroxin war sowohl in der Immunhistochemie als auch in der RT-PCR ein Anstieg der P-gp-Expres-sion zu beobachten. (3) Die pharmakokinetischen Daten nach oraler Gabe von Talinolol weisen darauf hin, dass Thyroxin ein Induktor des Transportproteins P-gp sein könnte (Abnahme der Bioverfügbarkeit, signifikante Abnahme der Halbwertszeit). Nach intravenöser Applikation konnte keine Veränderung der Pharmakoki-netik von Talinolol gezeigt werden. Schlussfolgerung: Die vorliegenden Ergebnissen zeigen, dass Thyroxin die Expression von intestinalem P-gp induziert. Aufgrund dieses Effektes ist damit zu rechnen, dass die Therapie mit Arzneimitteln, die durch P-gp transportiert werden, bei hyperthyreoten Patienten beeinflusst wird.
About 30 % of epileptic patients are non-responsive to multidrug antiepileptic therapy. One of non-responsiveness in epilepsy hypothesis claims that non-responsiveness occurs because of reduced access of antiepileptic drugs to their targets, as a result of increased efflux of antiepileptic drugs away from these targets. Transporters believed to be involved in non-responsiveness in epilepsy are mainly but not exclusively the members of the ABC superfamily including P-gp (MDR1, ABCB1), MRP1 (ABCC1), MRP2 (ABCC2) and others. These proteins are normally found in the blood-brain barrier and the blood-cerebrospinal fluid barrier where they function as protectors. There is emerging evidence that P-gp, MRP1 and MRP2 are up-regulated in epileptogenic brain tissue. The risk of non-responsiveness could be related also to the MDR1 or MRP2 gene polymorphisms. We hypothesised that changes in expression and function of multidrug transporters involved in non-responsiveness of epilepsy might be detectable not only in the brain but also in other tissues such as lymphocytes. Therefore we evaluated the expression of MDR1, MRP1 and MRP2 and function of P-gp in lymphocytes in patients with epilepsy and healthy subjects. Three groups of epileptic patients and 15 healthy subjects as a control group were included in the study. The patients’ group was defined as follows: Monotherapy – patients treated with carbamazepine monotherapy, without seizures - corresponded to group responders. Combined therapy – patients after monotherapy (two different medicines have been tried) and combined therapy (two trials of combined therapy), not free of seizures. Monotherapy and combined therapy groups each embraced 15 patients. Neurosurgery – patients who had undergone neurosurgery, afterwards were or were not additionally treated with carbamazepine, with or without seizures. This group comprised 24 patients. Combined therapy and neurosurgery groups composed the group of non-responders. The mRNA expression of MRP1, MRP2 and MDR1 by means of quantitative real-time PCR as well as MRP2 and P-gp protein content by Western blot in lymphocytes was measured. For P-gp functional analysis rhodamine efflux from lymphocytes and natural killer (NK) cells was performed. The influence of the polymorphisms C3435T, G2677T/A in the MDR1 gene and C24T, G1249A, C3972T in the MRP2 gene for the transporters expression, function and their association with non-responsive epilepsy phenotype was investigated. Our results showed that MRP1 expression in lymphocytes was significantly lower in epileptics than in healthy subjects. Non-responders had lower MRP1 mRNA content in lymphocytes than responders. We did not find any difference in MRP2 expression between epileptics and healthy volunteers. MRP2 mRNA levels in lymphocytes were higher in non-responders than in responders. However, at protein level epileptic patients had significantly lower MRP2 content in lymphocytes than controls. MRP2 protein content did not differ in responders and non-responders. There was no reliable correlation between MRP2 mRNA expression and MRP2 protein content in lymphocytes. Epileptics had significantly lower MDR1 expression in lymphocytes than healthy individuals. MDR1 expression was decreasing according to the consumption of antiepileptic drugs and seizures frequency: patients after neurosurgery had significantly lower MDR1 expression than patients after combined therapy and monotherapy. MDR1 expression was significantly lower in non-responders than in responders. At protein level epileptics had lower P-gp content than controls. Detected P-gp amount in lymphocytes did not differ between responders and non-responders. Rhodamine efflux from lymphocytes and NK cells did not differ significantly between epileptics and healthy subjects, but it was higher in patients after neurosurgery than in patients after monotherapy. Rhodamine efflux from NK cells, which are known to express the highest levels of P-gp, was significantly higher in non-responders than in responders. In this study, we showed that MRP1 mRNA expression in lymphocytes was significantly correlated to its expression in the brain. We detected also a significant co-correlation between MRP1 expression in the hippocampus and MDR1 expression in lymphocytes. We found no evidence regarding the impact of the MDR1 polymorphisms on mRNA expression, P-gp content and rhodamine efflux from lymphocytes. Our data showed lack of evidence regarding the impact of the MRP2 polymorphisms on mRNA expression and protein content. We did not detect any association between MDR1 or MRP2 polymorphisms and non-responsiveness in epilepsy or epilepsy in the main. In conclusion, our results suggest that lymphocytes are an appropriate surrogate for studies on changes of multidrug transporters expression in epilepsy. Lymphocytes as an easily accessible tissue might serve as a marker for responsiveness to antiepileptic drug therapy in epilepsy studies.
Doxorubicin is a frequently used anticancer drug to treat many types of tumors, such as breast cancer or bronchial carcinoma. The clinical use of doxorubicin is limited by its poorly predictable cardiotoxicity, the reasons of which are so far not fully understood. The drug is a substrate of several efflux transporters such as P-gp or BCRP and was recently reported to be a substrate of cation uptake transporters. To evaluate the potential role of transporter proteins in the accumulation of doxorubicin at its site of action (e.g., mammary carcinoma cells) or adverse effects (e.g., heart muscle cells), we studied the expression of important uptake and efflux transporters in human breast cancer and cardiac tissue, and investigated the affinity of doxorubicin to the identified transporters. The cellular uptake studies on doxorubicin were performed with OATP1A2*1, OATP1A2*2, and OATP1A2*3-overexpressing HEK293 cells, as well as OCT1-, OCT2-, and OCT3- overexpressing MDCKII cells. To assess the contribution of transporters to the cytotoxic effect of doxorubicin, we determined the cell viability in the presence and absence of transporter inhibitors in different cell lines. Several transporters, including P-gp, BCRP, OCT1, OCT3, and OATP1A2 were expressed in human heart and/or breast cancer tissue. Doxorubicin could be identified as a substrate of OCT1, OCT2, OCT3, and OATP1A2. The cellular uptake into cells expressing genetic OATP1A2 variants was markedly reduced and correlated well with the increased cellular viability. Inhibition of OATP1A2 (naringin) and OCT transporters (1-methyl-4-phenylpyridinium) resulted in a significant decrease of doxorubicin-mediated cytotoxicity in cell lines expressing the respective transporters. Similarly, the excipient Cremophor EL significantly inhibited the OCT1-3- and OATP1A2-mediated cellular uptake and attenuated the cytotoxicity of doxorubicin. In conclusion, genetic and environmental-related variability in the expression and function of these transporters may contribute to the substantial variability seen in terms of doxorubicin efficacy and toxicity.
Bis zum jetzigen Zeitpunkt wurden in der Plazenta über 30 membranständige Transportproteine identifiziert, die zum einen in der maternal zugewandten (apikalen) oder zum anderen in der fetal zugewandten (basalen) Membran der Synzytiotrophoblasten lokalisiert sein können. Trotz vieler Hinweise auf die Existenz plazentarer Transportproteine verfügen wir bis heute über kein umfassendes Wissen über ihre Funktion und Expression. Die vorliegende Arbeit wurde initiiert, um die Kenntnisse über plazentare Transportproteine zu vervollständigen und ein möglichst komplexes Wissen über ihre Expression und Funktion in der Plazenta zu gewinnen. Dazu wurden die Transportproteine ABCB1 (P-glycoprotein) und ABCC2 (multidrug resistance protein 2, MRP2) als Vertreter der Effluxtransporter einerseits und OCT3 (organic cation transporter 3) als Vertreter der Aufnahmetransporter anderseits zur weiteren Charakterisierung ausgewählt. Zuerst wurden die Untersuchungen zur plazentaren Expression der Transportproteine ABCB1, ABCC2 und OCT3 durchgeführt und der Einfluss von intrauteriner Entwicklung, schwangerschaftsassoziierten Erkrankungen und Genotyp auf die Expression geprüft. Anschließend wurde die Funktion von ABCB1, ABCC2 und OCT3 mittels Modellsubstraten und selektiver Hemmer untersucht. Die Expression wurde auf mRNA-Ebene mittels real-time RT-PCR (TaqMan®) und auf Protein-Ebene mittels quantitativer Western Blot-Analyse bestimmt. Die funktionellen Untersuchungen wurden an OCT3 überexprimierenden MDCKII-Zellen, plazentaren Membranvesikel, mittels der dualen ex vivo Perfusion der Rattenplazenta und des dualen in vitro Perfusionsmodells der menschlichen Plazenta durchgeführt. Die plazentare ABCC2-Expression in der Spätschwangerschaft war deutlich höher als die Expression von ABCB1. In Untersuchungen zur intrauterinen Entwicklung wurde ein signifikanter gestationsaltersabhängiger Anstieg der OCT3-Expression auf mRNA- und Protein-Ebene beobachtet. Die schwangerschaftsassoziierten Erkrankungen Präeklampsie und Gestationshypertonie verminderten signifikant die OCT3-Expression auf mRNA- und Protein-Ebene. In Untersuchungen zur Veränderungen der Expression in Abhängigkeit vom Genotyp waren die Polymorphismen C3435T und G2677T im ABCB1-Gen und C3972T und C24T im ABCC2-Gen mit einer veränderte Expression der Transporter verbunden. In den funktionellen Untersuchungen wurde zuerst der Einfluss von pharmakologisch relevanten Substanzen auf die Aufnahme des OCT3-Modellsubstrats 1-Methyl-4-phenyl-pyridinium (MPP) in die MDCKII-OCT3-Zellen getest. Einen signifikanten Hemmeffekt auf die MPP-Aufnahme zeigten Imipramin, Fluoxetin, Ecstasy, Nikotin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) und der bekannte OCT3-Inhibitor Disprocynium 24 (D24). Um die Funktion von OCT3 näher zu charakterisieren, wurde die MPP-Aufnahme in die apikalen und basalen Membranvesikel der menschlichen Plazenta untersucht. In den apikalen Vesikel zeigten Fluoxetin, Amphetamin und MPTP eine signifikante Hemmung des MPP-Transports. In den basalen Vesikel haben D24, Imipramin und Ecstasy die MPP-Aufnahme gehemmt. Im nächsten Schritt wurde die Funktion von Abcb1 und Abcc2 mit Hilfe der dualen ex vivo Perfusion der Rattenplazenta an Abcc2-defizienten- und Wildtyp-Ratten untersucht. Die Abwesenheit eines funktionsfähigen Abcc2-Transporters führte bei Abcc2-defizienten-Ratten zu einer erhöhten materno-fetalen Permeabilität des Modellsubstrats Talinolol, die durch Zugabe des Abcb1-Hemmers PSC833 weiter anstieg. Bei den Wildtyp-Ratten verursachte die Zugabe von PSC833 und dem Abcc2-Hemmer Probenecid einen Anstieg der materno-fetalen Permeabilität von Talinolol. Dies spricht für Beteiligung beider Transportproteine an der Plazentabarriere. Im dualen in vitro Perfusionsmodell der menschlichen Plazenta wurde ein unidirektionaler feto-maternaler Transfer des ABCB1- und ABCC2-Modellsubstrats Talinolol bewiesen. Dieser Transfer war durch den ABCC2-Inhibitor Probenecid und den unselektiven Inhibitor Verapamil modulierbar. Der ABCB1-Inhibitor PSC833 hatte dagegen keinen Einfluss auf die diaplazentare Permeabilität von Talinolol. Dies und die hohe ABCC2-Expression in der Terminplazenta spricht für eine größere Bedeutung von ABCC2 in der Spätschwangerschaft. Weitere Untersuchungen mittels des dualen in vitro Perfusionsmodells der menschlichen Plazenta wurden zur Beschreibung der Funktion von OCT3 durchgeführt. In der vorliegenden Arbeit wurde eine höhere materno-fetale Permeabilität des OCT3-Modellsubstrats MPP festgestellt. Der selektive OCT3-Hemmer D24 verminderte die materno-fetale Permeabilität des Modellsubstrats MPP signifikant. Daraus folgern wir, dass OCT3 in den diaplazentaren Transfer von organischen Kationen in fetale Richtung involviert sein muss. Psychopharmaka wie Fluoxetin, Imipramin oder illegale Drogen wie Ecstasy können die Funktion von OCT3 beeinflussen und damit den diaplazentaren Transfer von kationischen Substanzen verändern.
Die Variabilität von Arzneimitteln wird nicht nur durch die Spezifität der Substanzen für die Zielstrukturen bestimmt, sondern auch durch die interindividuelIe Variabilität von eliminierenden Prozessen. Im Hinblick auf die demographische Entwicklung mit zunehmendem Alter Schwangerer scheint auch die Notwendigkeit einer therapeutischen Intervention der Schwangerschaft wahrscheinlicher. Effekte von maternal gegebenen Arzneimitteln auf das sich entwickelnden Kind sind die Hauptrisiken einer schwangerschafts-assoziierten Therapie. Die Plazenta bildet die Schnittstelle zwischen Mutter und Kind und ist sowohl an der Versorgung, als auch an der Protektion des Kindes beteiligt. Es konnte bereits in vorhergehenden Studien gezeigt werden, dass Transportproteine welche auch die Mitglieder der ABC (ATP-binding cassette) Transporter Familie einschließen, an der Schutzfunktion beteiligt sind. Aus diesem Grund wurde die Expression Lokalisation und Funktion von Mitgliedern der ABC-Transporter in der Plazenta untersucht. Näher betrachtet wurden P-Glykoprotein (ABCB1), Breast Cancer Restance Protein (ABCG2), Multidrug Resistance Protein 2 (MRP2) und MRP5. Quantitative Real-Time Reaktion ergab tue Expression der Transport in allen untersuchten 60 Proben von Früh- und Termingeburten. Nachgewiesen werden konnte eine mit den Gestationsalter abnehmende Expression von MRP5, während die MRP2 und P-Glykoprotein mRNA mit dem Gestationsalter anstieg. Western Blot Analysen von Membranpräparation zeigte ähnliche Ergebnisse. Mittels Immunfluoreszenz Mikroskopie konnte MRP5 hauptsächlich in der basalen Membran des Synzytiotrophoblasten und in der Umgebung voll fetalen Gefäßen nachgewiesen werden, während die anderen 'Transporter hauptsächlich in der apikalen Syzytiotrophohlasten- Mernbran lokalisiert waren. Darüber hinaus wurde die Veränderung der Expression der Transporter in isolierten Zytotrophoblasten untersucht. Diese Vorläuferzellen des Synzytiotrophoblasten differenzieren in vitro und bilden ein multinukleäres Synzytium. Es zeigte sich, dass mit zunehmender Differenzierung die Expression der Transporter mit der hCG-Sekretion - einem biochemischem Marker der Differenzierung- ansteigt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Expression der hier untersuchten Transporter vorn Gestationsalter abhängig ist und sich mit der Differenzierung der Cytotrophoblasten verändert.
Die Zellen des menschlichen Körpers sind von einer Membran umgeben, durch die das Cytoplasma vom Umgebungsmilieu abgegrenzt wird. Für die Aufrechterhaltung ihrer Stoffwechselfunktionen sind sie jedoch auf eine ständige Aufnahme und Abgabe verschiedenster Moleküle angewiesen. Für immer mehr Substanzen kann inzwischen gezeigt werden, dass deren Membranpassage durch spezifische Transportproteine vermittelt wird. Auch das Herzgewebe ist Ziel- und Wirkort einer Reihe endogener und exogener Moleküle wie beispielsweise Hormone oder Arzneistoffe, die für den Eintritt in die Zelle Transportproteine, sogenannte Carrier, benötigen. Die vorliegende Arbeit sollte daher dazu beitragen, die Expression des Anionentransporters "Organic Anion Transporting Polypeptide B" (OATP-B/OATP2B1), eines Mitglieds der Transporterfamilie OATP (SCL21), im humanen Herzen aufzuklären. Dazu wurde zunächst ein sequenzspezifischer Antikörper gegen das OATP-B hergestellt und an Plazentagewebe charakterisiert. Mit diesem Antiserum wurde anschließend im Westernblot und immunhistologisch die Expression und die zelluläre Lokalisation des OATP-B Proteins in humanen Herzgewebeproben untersucht. Weiterhin wurde die mRNA Expression des OATP-B in 46 Vorhof- und 15 Ventrikelproben überwiegend herzkranker Patienten mittels Real time PCR bestimmt und Unterschiede in der Expression im Hinblick auf anamnestische und klinische Daten statistisch analysiert. In allen untersuchten Proben wurde OATP-B nachgewiesen. Dabei zeigte sich eine starke Expression im Bereich des Endothels kleiner Gefäße, Kardiomyozyten wiesen eine deutlich schwächere OATP-B Expression auf. Zwischen Vorhof- und Ventrikelproben zeigte sich kein signifikanter Unterschied, ebenso hatten kardiale Erkrankungen oder allgemeine Merkmale wie das Körpergewicht, Alter oder Geschlecht, keinenn Einfluss auf die OATP-B Expression. Es fand sich jedoch bei Patienten, die CSE-Hemmer und hierbei insbesondere Atorvastatin einnahmen, eine signifikant geringere Expression der OATP-B mRNA als bei Patienten ohne CSE-Hemmer Medikation (p < 0,05). Mit dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das OATP-B regelmäßig im humanen Herzen exprimiert ist, so dass eine Beteiligung des OATP-B an der kardialen Aufnahme seiner Substrate wie beispielsweise Steroid-Sulfate und CSE-Hemmer wahrscheinlich ist. Außerdem deuten die statistischen Ergebnisse auf mögliche Regulationsprozesse durch CSE-Hemmer bei der Expression des OATP-B hin.
Bei der Aufnahme von Arzneimitteln in Zellen spielen Transportprozesse eine große Rolle. Das ATP-abhängige Transportprotein P-Glykoprotein vermittelt häufig Resistenzen gegenüber Arzneimitteln. Zunächst wurde dieser Effekt in P-Glykoprotein-überexprimierenden Tumoren entdeckt. Auch viele gesunde Gewebe enthalten P-Glykoprotein. Einige der Substanzen, die von P-Glykoprotein transportiert werden, sind vielverwendete Medikamente bei der Therapie von Herzerkrankungen. Die individuelle Expressionhöhe von P-Glykoprotein im Herzen könnte für das unterschiedliche Ansprechen von Patienten auf von P-Glykoprotein transportierte Medikamente verantwortlich sein. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Expression von P-Glykoprotein an 15 humanen Herzgewebeproben untersucht. Verwendet wurde die Methode der RT-PCR und die immunhistochemische Darstellung des Proteins. Die Expression von P-Glykoprotein in humanem Herzmuskelgewebe konnte an allen Proben gezeigt werden. Immunhistochemisch ist P-Glykoprotein in den Endothelzellen der Arteriolen und Kapillaren lokalisiert worden. Hinsichtlich der Expression bei verschiedenen Krankheiten konnte bei Patienten mit einer dilatativen Kardiomyopathie eine signifikante Verminderung (p = 0,05) beobachtet werden. Die gewonnenen Ergebnisse zeigen eine Beteiligung des Herzens an Transportprozessen. Intrakardiale Konzentrationen vieler Substanzen können abhängig von der individuellen P-Glykoprotein-Expression beeinflusst werden
Das wasserlösliche, quaternäre Kation Trospiumchlorid (TC) wird nur unvollständig aus dem Darmlumen resorbiert, weist ein hohes Verteilungsvolumen auf und wird in die Leber aufgenommen und über Urin und Stuhl eliminiert. Die Blut-Hirn-Schranke überwindet es nicht und hat dadurch in der Anwendung als Anticholinergikum in der Behandlung des Syndroms der Überaktiven Blase (OAB) einen entscheidenden Vorteil gegenüber anderen Anticholinergika, da keine zerebralen Nebenwirkungen auftreten. Um relevante pharmakokinetische Transportmechanismen für TC abschätzen zu können, wurden in der vorliegenden Arbeit u. a. die mRNA-Expression von Transporterproteinen in humanem Blasenurothel gemessen und zellbasierte Transportassays zur Bestimmung der Affinität von TC zu verschieden pharmakokinetisch bedeutsamen Aufnahme- und Effluxtransportern durchgeführt. Die Analyse der mRNA-Expression identifizierte die folgenden Transporterproteine in humanem Blasenurothel: P-gp, MRP1 - 5, BCRP, OATP2B1, OATP4A1, OCT1, OCT3, OCTN1, OCTN2 und MATE1. TC zeigte eine Affinität zu OATP1A2, OCT1 und P-gp. Die Aufnahme von TC in primäre Blasenzellen konnte durch Naringin und Verapamil, Inhibitoren von OATP1A2 bzw. OCT1, gehemmt werden. In Immunfärbungen waren sowohl P-gp als auch OATP1A2 in apikalen, OATP1A2 auch in den darunter liegenden Urothelschichten lokalisiert. Die Affinität von TC zu den Aufnahmetransportern OATP1A2 und OCT1 und der Effluxpumpe P-gp ist möglicherweise der Grund für die inkomplette orale Absorption, die Verteilung in Leber und Nieren und die substantielle Sekretion über das Intestinum und die Niere. Das Fehlen zentraler, anticholinerger Effekte ist auf den Transport von TC durch P-gp zurückzuführen. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass das humane Urothel zahlreiche Transportproteine und AM-metabolisierende Enzyme, welche möglicherweise mit TC und anderen mit dem Urin ausgeschiedenen Medikamenten interagieren, exprimiert. Allerdings konnte nicht endgültig geklärt werden, wie genau eine anticholinerge Wirkung durch TC am Blasenurothel ausgelöst wird. Dies sollte Thema zukünftiger Untersuchungen sein.
Ziel der Arbeit war es, ein Probenkollektiv zu etablieren und die Expression, Lokalisation und Funktion pharmakologisch und physiologisch relevanter Membrantransporter systematisch zu untersuchen. Dafür wurde aus 70 humanen Plazenten mRNA, Protein und genomische DNA isoliert. Im Anschluss konnte die mRNA-Expression der Membrantransporter ABCB1 (P-gp), ABCC1 (MRP1), ABCC2 (MRP2), ABCC3 (MRP3), (ABCC5), ABCG2 (BCRP), SLC10A6 (SOAT), SLC22A4 (OCTN1), SLC22A5 (OCTN2), SLC22A11 (OAT4) und SLCO2B1 (OATP2B1) bestimmt und hinsichtlich ihrer Assoziation mit dem Gestationsalter und dem Geschlecht analysiert werden. Dabei zeigte sich eine signifikante gestationsabhängige Expressionsabnahme für das P-gp, BCRP, OATP2B1 und OAT4, darüber hinaus war die Expression von MRP1 in Plazenten männlichen Feten im Vergleich zu weiblichen Feten deutlich erhöht. Da fast alle Organe, mit Ausnahme der Leber, Niere und Gehirn, auf eine Carnitinaufnahme aus dem Blut angewiesen sind, spielen Carnitintransporter wie das SLC22A4 (OCTN1) und SLC22A5 (OCTN2) eine entscheidende Rolle: In der Plazenta sind sie bei der Versorgung des Fetus mit L-Carnitin unabdingbar. Auf mRNA-Ebene konnte in diesem Zusammenhang zunächst keine gestationsabhängige Expressionsänderung gezeigt werden, obwohl der Fetus zum Ende der Schwangerschaft einen deutlich erhöhten Carnitinbedarf hat. Die daraufhin durchgeführte Bestimmung der korrespondierenden OCTN2-Proteinexpression, die interessanter Weise nicht mit den mRNA-Werten korrelierte, zeigte tatsächlich eine erhöhte Transporterexpression zum Ende der Schwangerschaft hin. Für das OCTN2 wurden weiterhin Untersuchungen zum Einfluss eines bekannten Promotorpolymorphismus, dem -207G>C, der in anderen Studien mit der OCTN2 Expression assoziiert werden konnte, durchgeführt. Hier zeigte sich, dass diese genetische Variante zwar die mRNA Expression des Transporters beeinflusst, sich dieser Effekt aber wiederum nicht auf die Proteinebene übersetzt, so dass anzunehmen ist, dass die plazentare OCTN2 Expression auch von nicht transkriptionellen Faktoren (z.B. miRNA) bestimmt wird. Mit Blick auf die anderen untersuchten Transporter zeigte sich in vielen Fällen eine Korrelation in der Expression bestimmter Efflux- und Aufnahmetransporter. Ein Beispiel für ein solches Transporterpaar war dabei das BCRP und OATP2B1,das in der Folge weiter untersucht wurde, wobei insbesondere ein mögliches funktionelles Zusammenspiel im Mittelpunkt stand. Aufbauend auf der apikalen Expression des BCRP und der basalen des OATP2B1, wurde ein, auf MDCKII-Zellen basiertes, in vitro Zellsystem verwendet, um die Bedeutung dieser Transporter für den transzellulären Transport von Substanzen wie E1S und DHEAS zu zeigen. In der Tat war ein gerichteter Transporter dieser Substanzen nur zu beobachten, wenn beide Transporter in den Zellen exprimiert wurden. Diese Ergebnisse sind bezüglich der Hormonsynthese durch die Plazenta von Bedeutung, da diese während der Schwangerschaft einen zentralen Syntheseort darstellt, aber einige Vorläufermoleküle nicht selber synthetisieren kann. Zusammengefasst bietet die vorliegende Arbeit ein umfassendes Bild über die Regulation wichtiger physiologischer und auch pharmakologischer Membrantransporter im letzten Drittel der Schwangerschaft. Darüber hinaus konnte für ausgewählte Transporter das Zusammenspiel (OATP2B1 und ABCG2) und die Regulation (OCTN2) näher charakterisiert werden.
Die gleichzeitige Gabe von Arzneimitteln kann durch Inhibition oder Induktion von intestinalen Transportproteinen bzw. metabolischen Enzymen unerwünschte Arzneimittelinteraktionen verursachen. Bewirkt wird der induktive Effekt durch die Aktivierung von nukleären Rezeptoren wie PXR. Aktuell sind keine in vitro-Modelle verfügbar, die die Interaktion auf intestinaler Ebene infolge von Induktionsprozessen prognostizieren können. Für intestinale Absorptions- und inhibitorische Arzneistofftransportstudien werden bisher die häufig genutzten Caco-2-Zellen verwendet, da sie enterozytenartige Eigenschaften besitzen. Allerdings gibt es einige Unklarheiten, die das Caco-2-Modell betreffen, wie bspw. der optimale Zeitraum der Zellkultivierung, das fragliche Vorhandensein von nukleären Rezeptoren und die umstrittene Repräsentanz von Colon-Karzinomzellen für den intestinalen, jejunalen Arzneimitteltransport.
Ziel dieser Arbeit war es somit, die Eignung der präklinisch genutzten Caco-2-Zellen als in vitro-Modell für Transporter-bedingte Arzneimittelinteraktion und intestinalen Arzneimitteltransport zu untersuchen. Hierzu wurde die Expression klinisch relevanter intestinaler Arzneistofftransporter, Metabolisierungsenzyme und nukleärer Rezeptoren in Caco-2-Zellen auf Gen- und Proteineben mittels real time-RT PCR (TaqMan®-Prinzip) und LC-MS/MS-basiertem targeted proteomics bestimmt und mit der Expression in humanem Jejunum verglichen. Ferner wurde die Expression der erwähnten Determinanten in Abhängigkeit von der Kultivierungszeit und nach Induktion mit den prototypischen Induktoren Carbamazepin, Efavirenz, Hyperforin, Hypericin und Rifampicin untersucht. Zuletzt wurde der Einfluss der Induktoren auf die Funktion des Transporters ABCB1, anhand eines bidirektionalen Transportassays mit den radioaktivmarkierten ABCB1-Substraten [3H]-Digoxin und [3H]-Talinolol, ermittelt.
Die Expression der Transporter und nukleären Rezeptoren auf Gen- und Proteinebene in Caco-2-Zellen unterschieden sich deutlich zu der von jejunalem Gewebe. Für die Transporter ABCB1, ABCC2, OATP1A2, OATP2B1, PETP1 und das Enzym UGT1A1 konnte eine signifikante Zunahme der mRNA-Expression mit der Dauer der Kultivierungszeit festgestellt werden, die auf Proteinebene nicht gezeigt werden konnte. Die Induktoren Carbamazepin, Hyperforin, Hypericin und Rifampicin wiesen einen Effekt auf die mRNA-Expression, nicht aber auf die Proteinmenge der Transporter auf. In Übereinstimmung zu den Befunden der fehlenden Transporterinduktion konnte kein Effekt der Induktoren auf die Funktion von ABCB1 beobachtet werden.
Caco-2-Zellen sind daher nicht als in vitro-Modell geeignet um Arzneimittel-interaktionen prognostizieren zu können, die durch die Induktion von Transportern entstehen.
The Na+/taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) is located in the basolateral membrane of hepatocytes, where it transports bile acids from the portal blood back into hepatocytes. Furthermore, NTCP has a role for the hepatic transport of some drugs. Extrapolation of drug transport data from rodents to humans is not always possible, because species differences in the expression level, localization, affinity, and substrate selectivity of relevant transport proteins must be considered. In the present study, a functional comparison of human NTCP (hNTCP) and mouse Ntcp (mNtcp) showed similar Km values of 67 ± 10 µM and 104 ± 9 µM for the probe substrate estrone-3-sulfate as well as of 258 ± 42 µM and 199 ± 13 µM for the drug rosuvastatin, respectively. IC50 values for the probe inhibitor cyclosporine A were 3.1 ± 0.3 µM for hNTCP and 1.6 ± 0.4 µM for mNtcp. In a drug and pesticide inhibitory screening on both transporters, 4 of the 15 tested drugs (cyclosporine A, benzbromarone, MK571, and fluvastatin) showed high inhibitory potency, but only slight inhibition was observed for the 13 tested pesticides. Among these compounds, only four drugs and three pesticides showed significant differences in their inhibition pattern on hNTCP and mNtcp. Most pronounced was the difference for benzbromarone with a fivefold higher IC50 for mNtcp (27 ± 10 µM) than for hNTCP (5.5 ± 0.6 µM).
In conclusion, we found a strong correlation between the transport kinetics and inhibition pattern among hNTCP and mNtcp. However, specific compounds, such as benzbromarone, showed clear species differences. Such species differences have to be considered when pharmacokinetic data are transferred from rodent to humans.
Das Glioblastom ist ein hochmaligner und aggressiver Hirntumor, der von der WHO als Grad IV eingestuft wird. Die Betroffenen haben eine mittlere Überlebenszeit von 12 bis 15 Monaten, was auf dem invasiven Wachstum und der Chemo- und Radioresistenz des Tumors beruht. Dadurch existiert keine kurative Behandlung und es kommt in nahezu allen Fällen zu Rezidiven. Zunehmend wird deutlich, dass das Glioblastom einen stark veränderten Energiestoffwechsel aufweist, wobei das sogenannte lipidomic remodelling (Koundouros und Poulogiannis, 2020), welches für maßgebliche Alterationen im Fettsäuremetabolismus sorgt, besonders interessant erscheint. Die Fettsäureoxidation sowie damit assoziierte Prozesse und Proteine sind als eine bedeutende Energiequelle in den Fokus der Forschung getreten. So auch der hoch-affine Carnitintransporter OCTN2 (SLC22A5), welcher essentiell für den Carnitinhaushalt und damit die β-Oxidation der Zelle ist. In der vorgelegten Arbeit wurde daher das komplexe OCTN2/L-Carnitin System in seiner Funktion als potenzielle pharmakologische Zielstruktur zur therapeutischen Intervention beim Glioblastom tiefergehend untersucht und vorhandenes Wissen weiter ausgebaut. Hierzu diente eine Vielzahl experimenteller Bedingungen und Methoden, um Teilcharakteristiken des Glioblastoms darzustellen und die Bedeutung des OCTN2/L-Carnitin System zu überprüfen.
Da in vorausgegangenen Studien eine erhöhte Expression von OCTN2 mit einem signifikant schlechteren Überleben von Patienten mit Glioblastom nachgewiesen werden konnte, wurden als weitere potentiell interessante Zielstrukturen der niedrig-affine Carnitintransporter OCTN1 (SLC22A4) sowie Komponenten der β-Oxidation (CPT1C, CRAT) in die Patientenanalysen eingeschlossen. Zwar konnte für OCTN1 eine signifikant erhöhte mRNA-Expression in den humanen Glioblastomproben festgestellt werden, diese war jedoch nicht mit dem Überleben der Patienten assoziiert. Auch CPT1C und CRAT zeigten sich nicht als relevante Zielstrukturen beim Glioblastom.
In den durchgeführten Zellkulturexperimenten mit humanen LN-18 und murinen GL261 Glioblastomzellen zeigten sich partiell signifikante Effekte auf die wachstumsfördernden Kinasen AKT1 und ERK1/2, deren Phosphorylierungsgrad durch L-Carnitin moduliert wurde und die damit möglicherweise an carnitinvermittelten Wirkungen beteiligt sein könnten. Auf die Zellviabilität und Zellvitalität ließen sich hemmende Wirkungen des OCTN2-Inhibitors Meldonium sowie des CPT1-Hemmstoffes Etomoxir nachweisen, welche teilweise durch die zusätzliche Gabe von L-Carnitin revertiert wurden. Hinsichtlich der durch Zytostatika (Doxorubicin, Carmustin, Vincristin und Temozolomid) induzierten Apoptose konnte L-Carnitin nur die durch Carmustin in niedriger Dosierung ausgelöste Caspase-3 Aktivierung verhindern. Ein durch L-Carnitin ausgelöster Effekt auf die Migration der Glioblastomzellen konnte nicht nachgewiesen werden, jedoch wurde die migratorische Aktivität durch die Zytostatika Temozolomid und Carmustin, sowie interessanterweise auch durch den CPT1-Inhibitor Etomoxir, beeinträchtigt.
Um die Möglichkeit einer zielgerichteten Therapie gegen das OCTN2/L-Carnitin System präklinisch zu evaluieren, wurden tierexperimentelle Studien durchgeführt. Unter Verwendung eines orthotopen Glioblastommodelles der Maus konnte gezeigt werden, dass Etomoxir und Meldonium einen hemmenden Einfluss auf das in vivo Tumorwachstum besitzen, wobei dieser Effekt nur für den OCTN2-Inhibitor Meldonium signifikant ausfiel. In den OCTN2-defizienten jvs(-/-)-Mäusen konnte keine ausreichende Anzahl von Versuchstieren erreicht werden, um zuverlässige und finale Aussagen zu tätigen. In den heterozygoten jvs(+/-)-Mäusen, die zwar phänotypisch unauffällig sind, aber durch die geringere OCTN2 Ausstattung verminderte Carnitin-Gewebespiegel aufweisen, zeigte sich eine leichte, nicht signifikante Reduktion des intrazerebralen Tumorwachstums im Vergleich zu den C57BL/6-Wildtyp Mäusen.
Zusammenfassend wurde in der vorliegenden Arbeit das OCTN2/L-Carnitin System und seine Bedeutung für das Glioblastom umfassend dargelegt und experimentell überprüft. Als Endresultat dieser Studie können Etomoxir und Meldonium als Substanzen zur zielgerichteten Beeinflussung des Glioblastomwachstums angesehen werden und sollten in weiteren Versuchsreihen detailliert auf ihre Eignung für die Entwicklung neuer Therapieformen überprüft werden.
Gene Expression and Protein Abundance of Hepatic Drug Metabolizing Enzymes in Liver Pathology
(2021)
Background: Unwanted drug-drug interactions (DDIs), as caused by the upregulation of clinically relevant drug metabolizing enzymes and transporter proteins in intestine and liver, have the potential to threaten the therapeutic efficacy and safety of drugs. The molecular mechanism of this undesired but frequently occurring scenario of polypharmacy is based on the activation of nuclear receptors such as the pregnane X receptor (PXR) or the constitutive androstane receptor (CAR) by perpetrator agents such as rifampin, phenytoin or St. John’s wort. However, the expression pattern of nuclear receptors in human intestine and liver remains uncertain, which makes it difficult to predict the extent of potential DDIs. Thus, it was the aim of this study to characterize the gene expression and protein abundance of clinically relevant nuclear receptors, i.e., the aryl hydrocarbon receptor (AhR), CAR, farnesoid X receptor (FXR), glucocorticoid receptor (GR), hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4α), PXR and small heterodimer partner (SHP), in the aforementioned organs. Methods: Gene expression analysis was performed by quantitative real-time PCR of jejunal, ileal, colonic and liver samples from eight human subjects. In parallel, a targeted proteomic method was developed and validated in order to determine the respective protein amounts of nuclear receptors in human intestinal and liver samples. The LC-MS/MS method was validated according to the current bioanalytical guidelines and met the criteria regarding linearity (0.1–50 nmol/L), within-day and between-day accuracy and precision, as well as the stability criteria. Results: The developed method was successfully validated and applied to determine the abundance of nuclear receptors in human intestinal and liver samples. Gene expression and protein abundance data demonstrated marked differences in human intestine and liver. On the protein level, only AhR and HNF4α could be detected in gut and liver, which corresponds to their highest gene expression. In transfected cell lines, PXR and CAR could be quantified. Conclusions: The substantially different expression pattern of nuclear receptors in human intestinal and liver tissue may explain the different extent of unwanted DDIs in the dependence on the administration route of drugs.
This communication introduces the first-time application of high-resolution continuum-source molecular absorption spectrometry (HR CS MAS) for the quantification of a peptide. The graphite furnace technique was employed and the tripeptide glutathione (GSH) served as a model compound. Based on measuring sulfur in terms of carbon monosulfide (CS), a method was elaborated to analyze aqueous solutions of GSH. The most prominent wavelength of the CS molecule occurred at 258.0560 nm and was adduced for monitoring. The methodological development covered the optimization of the pyrolysis and vaporization temperatures. These were found optimally to be 250 °C and 2250 °C, respectively. Moreover, the effect of modifiers (zirconium, calcium, magnesium, palladium) on the absorption signals was investigated. The best results were obtained after permanent coating of the graphite tube with zirconium (total amount of 400 μg) and adding a combination of palladium (10 µL, 10 g L−1) and calcium (2 µL, 1 g L−1) as a chemical modifier to the probes (10 µL). Aqueous standard samples of GSH were used for the calibration. It showed a linear range of 2.5–100 µg mL−1 sulfur contained in GSH with a correlation coefficient R2 > 0.997. The developed method exhibited a limit of detection (LOD) and quantification (LOQ) of 2.1 µg mL−1 and 4.3 µg mL−1 sulfur, respectively. The characteristic mass accounted for 5.9 ng sulfur. The method confirmed the general suitability of MAS for the analysis of an oligopeptide. Thus, this study serves as groundwork for further development in order to extend the application of classical atomic absorption spectrometry (AAS).
Osteoporosis, a complex chronic disease with increasing prevalence, is characterised by reduced bone mineral density (BMD) and increased fracture risk. The high heritability of BMD suggests substantial impact of the individual genetic disposition on bone phenotypes and the development of osteoporosis. In the past years, genome-wide association studies (GWAS) identified hundreds of genetic variants associated with BMD or osteoporosis. Here, we analysed 1103 single nucleotide polymorphisms (SNPs), previously identified as associated with estimated BMD (eBMD) in the UK Biobank. We assessed whether these SNPs are related to heel stiffness index obtained by quantitative ultrasound in 5665 adult participants of the Study of Health in Pomerania (SHIP). We confirmed 45 significant associations after correction for multiple testing. Next, we analysed six selected SNPs in 631 patients evaluated for osteoporosis [rs2707518 (CPED1/WNT16), rs3779381 (WNT16), rs115242848 (LOC101927709/EN1), rs10239787 (JAZF1), rs603424 (PKD2L1) and rs6968704 (JAZF1)]. Differences in minor allele frequencies (MAF) of rs2707518 and rs3779381 between SHIP participants (higher MAF) and patients evaluated for osteoporosis (lower MAF) indicated a protective effect of the minor allele on bone integrity. In contrast, differences in MAF of rs603424 indicated a harmful effect. Co-localisation analyses indicated that the rs603424 effect may be mediated via stearoyl-CoA desaturase (SCD) expression, an enzyme highly expressed in adipose tissue with a crucial role in lipogenesis. Taken together, our results support the role of the WNT16 pathway in the regulation of bone properties and indicate a novel causal role of SCD expression in adipose tissue on bone integrity.
Heart Rate Reduction by Ivabradine Improves Aortic Compliance in Apolipoprotein E-Deficient Mice
(2012)
Background: Impaired vascular compliance is associated with cardiovascular mortality. The effects of heart rate on vascular compliance are unclear. Therefore, we characterized effects of heart rate reduction (HRR) by I(f) current inhibition on aortic compliance and underlying molecular mechanisms in apolipoprotein E-deficient (ApoE<sup>–</sup>/<sup>–</sup>) mice. Methods: ApoE<sup>–</sup>/<sup>–</sup> mice fed a high-cholesterol diet and wild-type (WT) mice were treated with ivabradine (20 mg/kg/d) or vehicle for 6 weeks. Compliance of the ascending aorta was evaluated by MRI. Results: Ivabradine reduced heart rate by 113 ± 31 bpm (∼19%) in WT mice and by 133 ± 6 bpm (∼23%) in ApoE<sup>–</sup>/<sup>–</sup> mice. Compared to WT controls, ApoE<sup>–</sup>/<sup>–</sup> mice exhibited reduced distensibility and circumferential strain. HRR by ivabradine increased distensibility and circumferential strain in ApoE<sup>–</sup>/<sup>–</sup> mice but did not affect both parameters in WT mice. Ivabradine reduced aortic protein and mRNA expression of the angiotensin II type 1 (AT1) receptor and reduced rac1-GTPase activity in ApoE<sup>–</sup>/<sup>–</sup> mice. Moreover, membrane translocation of p47<sup>phox</sup> was inhibited. In ApoE<sup>–</sup>/<sup>–</sup> mice, HRR induced anti-inflammatory effects by reduction of aortic mRNA expression of IL-6, TNF-alpha and TGF-beta. Conclusion: HRR by ivabradine improves vascular compliance in ApoE<sup>–</sup>/<sup>–</sup> mice. Contributing mechanisms include downregulation of the AT1 receptor, attenuation of oxidative stress and modulation of inflammatory cytokine expression.
Purpose: Periodontitis is an inflammatory disease of the oral cavity with an alarmingly high prevalence within the adult population. The signaling lipid sphingosine-1-phosphate (S1P) plays a crucial role in inflammatory and immunomodulatory responses. In addition to cardiovascular disease, sepsis and tumor entities, S1P has been recently identified as both mediator and biomarker in osteoporosis. We hypothesized that S1P may play a role in periodontitis as an inflammation-prone bone destructive disorder. The goal of our study was to evaluate associations between periodontitis and S1P serum concentrations in the Study of Health in Pomerania (SHIP)-Trend cohort. In addition, we investigated the expression of S1P metabolizing enzymes in inflamed gingival tissue.
Patients and Methods: We analyzed data from 3371 participants (51.6% women) of the SHIP-Trend cohort. Periodontal parameters and baseline characteristics were assessed. Serum S1P was measured by liquid chromatography tandem mass spectrometry. The expression of S1P metabolizing enzymes was determined by immunofluorescence staining of human gingival tissue.
Results: S1P serum concentrations were significantly increased in subjects with both moderate and severe periodontitis, assessed as probing depth and clinical attachment loss. In contrast, no significant association of S1P was seen with caries variables (number and percentage of decayed or filled surfaces). S1P concentrations significantly increased with increasing high-sensitivity C-reactive protein (hs-CRP) levels. Interestingly, inflamed compared to normal human gingival tissue exhibited elevated expression levels of the S1P-generating enzyme sphingosine kinase 1 (SphK1).
Conclusion: We report an intriguingly significant association of various periodontal parameters with serum levels of the inflammatory lipid mediator S1P. Our data point towards a key role of S1P during periodontitis pathology. Modulation of local S1P levels or its signaling properties may represent a potential future therapeutic strategy to prevent or to retard periodontitis progression and possibly reduce periodontitis-related tooth loss.
Postoperative restenosis in patients with external ear canal (EEC) atresia or stenosis is a common complication following canaloplasty. Our aim in this study was to explore the feasibility of using a three dimensionally (3D)-printed, patient-individualized, drug ((dexamethasone (DEX)), and ciprofloxacin (cipro))-releasing external ear canal implant (EECI) as a postoperative stent after canaloplasty. We designed and pre-clinically tested this novel implant for drug release (by high-performance liquid chromatography), biocompatibility (by the MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay), bio-efficacy (by the TNF-α (tumor necrosis factor-alpha)-reduction test (DEX) and inhibition zone test (for cipro)), and microbial contamination (formation of turbidity or sediments in culture medium). The EECI was implanted for the first time to one patient with a history of congenital EEC atresia and state after three canaloplasties due to EEC restenosis. The preclinical tests revealed no cytotoxic effect of the used materials; an antibacterial effect was verified against the bacteria Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa, and the tested UV-irradiated EECI showed no microbiological contamination. Based on the test results, the combination of silicone with 1% DEX and 0.3% cipro was chosen to treat the patient. The EECI was implantable into the EEC; the postoperative follow-up visits revealed no otogenic symptoms or infections and the EECI was explanted three months postoperatively. Even at 12 months postoperatively, the EEC showed good epithelialization and patency. Here, we report the first ever clinical application of an individualized, drug-releasing, mechanically flexible implant and suggest that our novel EECI represents a safe and effective method for postoperatively stenting the reconstructed EEC.
Die Atherosklerose ist eine weit verbreitete, mit dem Alter zunehmende Erkrankung der Gefäße, die schwerwiegende Folgeerkrankungen auslösen kann. Zu den Hauptrisikofaktoren gehören Störungen im Lipidstoffwechsel. Insbesondere erhöhte Cholesterin- und Triglyceridspiegel im Blut fördern die Entstehung von atherosklerotischen Läsionen in der Gefäßwand.
Protease-aktivierte Rezeptoren (PAR) spielen in vielen verschiedenen entzündlichen Prozessen unseres Körpers eine große Rolle, dabei ist der PAR-2 aktuell weniger gut erforscht. Der PAR-2 wird durch die Serinprotease Faktor Xa aktiviert und vermittelt proinflammatorische Antworten. Eine wesentliche Rolle des PAR-2 im Lipidstoffwechsel ist derzeit nicht bekannt. Aus der Arbeit von Frau Dr. Flößer war eine Zunahme des Körpergewichts, sowie erhöhte Triglycerid- und Cholesterinspiegel, bedingt durch den Knockout des PAR-2 und des ApoE-Gens bekannt. Dadurch wurde ein Einfluss des PAR-2 auf den Lipidstoffwechsel vermutet.
Das LIGHT-Protein wurde sowohl im Zusammenhang mit atherosklerotischen Läsionen, als auch im Rahmen des Lipidstoffwechsels beschrieben. Ebenso ist eine Interaktion des LIGHT-Proteins mit dem PAR-2 bekannt. Demnach ergab sich die Vermutung, dass der Einfluss des PAR-2 auf den Lipidstoffwechsel über das LIGHT-Protein erfolgt.
Die Analyse der Expression der mRNA in vier verschiedenen Mauslinien ergab eine signifikante Reduktion der Expression der mRNA des LIGHT-Proteins und der Expression der mRNA seiner beiden Rezeptoren HVEM und LTβ-Rezeptor. Da ebenfalls bereits ein Einfluss des LIGHT-Proteins auf die Expression der hepatischen Lipase bekannt war und die hepatische Lipase eine wesentliche Rolle im Lipidstoffwechsel spielt, wurde auch die mRNA-Expression der hepatischen Lipase bestimmt. Es konnte eine erniedrigte Expression der mRNA der hepatischen Lipase festgestellt werden, was die erhöhten Triglycerid- und Cholesterinspiegel begründet. Gegensprüchlich in dieser Arbeit war jedoch, dass das LIGHT-Protein in anderen Arbeiten als negativer Regulator der hepatischen Lipase beschrieben wurde und somit eine verminderte Expression von LIGHT eher zu einer vermehrten Expression der hepatischen Lipase führen würde. Da aber ebenfalls beide Rezeptoren des LIGHT-Proteins vermindert exprimiert wurden und die Interaktion mit der hepatischen Lipase über den LTβ-Rezeptor erfolgt, wird davon ausgegangen, dass die LIGHT-LTβ-Rezeptor Interaktion durch den Knockout des PAR-2 weniger beeinflusst wird und dadurch weiterhin aktiv stattfand.
Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass der PAR-2 eine Rolle im Lipidstoffwechsel spielt und zu einer verminderten Expression des LIGHT-Proteins und seiner Rezeptoren führt.
Die Parodontitis ist neben der Karies die häufigste Infektionskrankheit beim Menschen. In der Arbeit wurde nach Verbindungen zwischen genetischen Risikofaktoren, systemischen Entzündungen und der Parodontitis gesucht. Aus der Summe der Arbeit ist erkenntlich, dass der Interleukin-1 Composite Genotyp bei einem repräsentativen Bevölkerungsquerschnitt eher ein Kofaktor ist, als ein eigenständig wirkender kausaler Faktor. Dieser modifizierende Kofaktor beeinflusst auch die wechselseitige Assoziation zwischen systemischen Entzündungsmarkern und der Parodontitis. Gerade diese Interaktion der Parodontitis mit systemischen Entzündungen ist bisher wenig erforscht und stellt einen zusätzlichen Risikofaktor der Parodontitis dar. Im Ergebnis der Arbeit auf der Grundlage der SHIP-0 Studie finden sich starke Hinweise auf eine protektive Wirkung des MPO Polymorphismus. Außerdem zeigt der CRP-Level einen starken Einfluss auf das Ausmaß der Parodontitis. sodass der Nachweis einer Assoziation zwischen lokaler Entzündung und systemischer Entzündung nahe liegt. Des Weiteren sind nicht alle möglichen Faktoren für die Entstehung einer Parodontitis bekannt, sodass auch hier noch weiterer Forschungsbedarf besteht. Aber schon diese neuen Erkenntnisse über Kofaktoren und über das komplexe Zusammenspiel derselben - vor allem aufgrund der gefundenen Interaktionen zwischen der Parodontitis, systemischen Entzündungen und genetischen Risikomarkern - rückt die Parodontitis mehr in den Focus der Medizin und führt dazu, dass die Parodontitis nicht losgelöst als „lokales Entzündungsgeschehen" ohne Wirkung auf den restlichen Organismus betrachtet darf.
Die Rolle der Kandidatengene Interleukin IL-1α und IL-1β, des Interleukin-1 Rezeptorantagonisten IL-1Ra und der Faktoren Parodontitis, systemische Entzündungen für ein erhöhtes Risiko von oralen Präkanzerosen – oralen Leukoplakien und oralen Lichen Ruber – war bis dato noch unerforscht. Ziel dieser Arbeit sollte es daher sein, unter Zuhilfenahme einer Bevölkerungsstudie die These einer wechselseitigen Assoziation zwischen der Parodontitis, den genetischen Risikomarkern, systemischen Entzündungen und oralen Präkanzerosen in Form der Leukoplakie und des Lichen Ruber zu verifizieren. Zu diesem Zwecke erfolgte neben der standardisierten Untersuchung der Probanden im Rahmen der SHIP-0 Studie eine Genotypisierung aller Probanden in der Altersgruppe von 40 – 60 Jahre. Bei 1515 Probanden konnte der Genotyp bestimmt werden. Es sind folgende Aussagen auf der Grundlage der Ergebnisse formuliert worden: 1. Wir fanden eine direkte Korrelation zwischen Markern der parodontalen Gesundheit wie durchschnittlicher Taschentiefe und durchschnittlichem Attachmentverlust und dem Erkrankungsrisiko für die oralen Präkanzerosen Leukoplakie (OL) und Lichen ruber planus (OLP). 2. In der Gruppe der Probanden mit OL fanden wir erhöhte Werte für die Entzündungsmarker CRP und Fibrinogen. Aufgrund der geringen Fallzahlen für die OL sollte diese Assoziation noch in Fallkontrollstudien näher untersucht werden. Weiterhin sollte noch die Frage nach der Richtung der Beeinflussung geklärt werden. 3. Wir wiesen eine Verbindung zwischen Diabetes mellitus und der OL nach. Dabei zeigte sich in der Gruppe der Probanden mit OL eine signifikant erhöhte Prävalenz des Diabetes mellitus. Weiterhin führte die Kombination der beiden Risikofaktoren parodontale Gesundheit und Diabetes mellitus (odds ratio OR: 3.52) zu einem weiteren signifikanten Anstieg des Risikos einer oralen Leukoplakie (OR: 5.04). Die Klärung der Frage nach dem Mechanismus der Verbindung zwischen Diabetes mellitus und OL ist notwendig und sollte in entsprechenden Fallkontrollstudien untersucht werden. 4. In der Arbeit wurde keine Assoziation des Alters und Geschlechtes mit OL und OLP gefunden. 5. Wir konnten die Bedeutung des Rauchens als modulierenden Risikofaktor für die Entstehung einer OL und OLP bestätigen. 6. Für den SNP des Interleukin-1 α Gens an der Position -889 fanden wir eine signifikant erhöhte Erkrankungschance für OL (OR Konfidenzintervall 2.26 bis 12.51). Dies traf für den OLP nicht zu. 7. Weiterhin fanden sich keine Zusammenhänge mit den untersuchten genetischen Markern IL-1B +3954, IL-1B -511, IL-RN und des IL-1 Composite Genotyp mit OL und OLP. Ein Vergleich der hier betrachteten Risikofaktoren – SNP des IL-1 Gen- Clusters, systemische Entzündungsparameter, parodontale Gesundheit, Diabetes mellitus, Rauchen – macht den bis dato unbekannten Einfluss dieser Faktoren auf die Entwicklung oraler Präkanzerosen deutlich. Dabei zeigt die Arbeit, dass man bei der Suche nach Risikofaktoren für die Entwicklung dieser Präkanzerosen noch am Anfang steht und sowohl weitere genetische als auch nicht genetische Risikofaktoren denkbar sind. Weiterhin erfordert die Wechselwirkung systemischer Entzündungen, des Diabetes mellitus und der Parodontitis mit oralen Präkanzerosen in Form der OL und OLP weitere Untersuchungen.
Genome-wide association studies have identified an association between isobutyrylcarnitine (IBC) and organic cation transporter 1 (OCT1) genotypes. Higher IBC blood concentrations in humans with active OCT1 genotypes and experimental studies with mouse OCT1 suggested an OCT1-mediated efflux of IBC. In this study, we wanted to confirm the suggested use of IBC as an endogenous biomarker of OCT1 activity and contribute to a better understanding of the mechanisms behind the association between blood concentrations of carnitine derivatives and OCT1 genotype. Blood and urine IBC concentrations were quantified in healthy volunteers regarding intra- and interindividual variation and correlation with OCT1 genotype and with pharmacokinetics of known OCT1 substrates. Furthermore, IBC formation and transport were studied in cell lines overexpressing OCT1 and its naturally occurring variants. Carriers of high-activity OCT1 genotypes had about 3-fold higher IBC blood concentrations and 2-fold higher amounts of IBC excreted in urine compared to deficient OCT1. This was likely due to OCT1 function, as indicated by the fact that IBC correlated with the pharmacokinetics of known OCT1 substrates, like fenoterol, and blood IBC concentrations declined with a 1 h time delay following peak concentrations of the OCT1 substrate sumatriptan. Thus, IBC is a suitable endogenous biomarker reflecting both, human OCT1 (hOCT1) genotype and activity. While murine OCT1 (mOCT1) was an efflux transporter of IBC, hOCT1 exhibited no IBC efflux activity. Inhibition experiments confirmed this data showing that IBC and other acylcarnitines, like butyrylcarnitine, 2-methylbutyrylcarnitine, and hexanoylcarnitine, showed reduced efflux upon inhibition of mOCT1 but not of hOCT1. IBC and other carnitine derivatives are endogenous biomarkers of hOCT1 genotype and phenotype. However, in contrast to mice, the mechanisms underlying the IBC-OCT1 correlation in humans is apparently not directly the OCT1-mediated efflux of IBC. A plausible explanation could be that hOCT1 mediates cellular concentrations of specific regulators or co-substrates in lipid and energy metabolism, which is supported by our in vitro finding that at baseline intracellular IBC concentration is about 6-fold lower alone by OCT1 overexpression.
Kardioprotektive Wirkung von Antagonisten am Mineralokortikoidrezeptor nach akutem Myokardinfarkt
(2013)
Der akute Myokardinfarkt ist eine der häufigsten Todesursachen in den Industrienationen. Dieser entsteht überwiegend durch artherosklerotische oder entzündliche Veränderungen der Herzkranzgefäße, welche zu einem thrombotischen Verschluss einer oder mehrerer Koronararterien und damit zu plötzlicher Unterbrechung der Blutversorgung, der sogenannten Ischämie, führen. Um die entstehende Herzmuskelschädigung möglichst klein zu halten, ist die schnelle Wiedereröffnung des Koronargefäßes notwendig. Heute ist bekannt, dass diese gewünschte Reperfusion aber auch irreversible Herzschäden verursachen kann. Mit dem Verfahren der ischämischen Postkonditionierung durch kurze Intervalle der Ischämie und Reperfusion nach Wiederöffnung des Koronargefäßes kann die Infarktgröße deutlich gesenkt werden. Für den klinischen Einsatz ist dieses Verfahren jedoch technisch zu aufwändig, sodass der Wunsch nach pharmakologischen Interventionen, die ein hohes Potenzial zur Reduktion der Myokardschädigung nach einem Infarkt bieten, steigt. Aus diesem Grund besteht ein großes Interesse daran, neue Therapien zu entwickeln, ihre kardioprotektiven Signalwege zu erforschen und in den klinischen Alltag einzubringen. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich daher mit der Untersuchung der kardioprotektiven Wirkung der Mineralokortikoidrezeptor-Antagonisten (MR-Antagonisten) Eplerenon und Canrenoat sowie der Charakterisierung wichtiger Elemente der Signalkaskade. Hierfür wurde in dem Modell der isolierten Rattenherzen die kardioprotektive Wirkung dieser MR-Antagonisten während der Reperfusion und die mögliche Beteiligung bekannter Elemente der Signalkaskade für Prä- und Postkonditionierung untersucht. Des Weiteren wurde ein in situ Mausmodell etabliert, um die Infarktgrößen im Gesamtorganismus zu bestimmen. Zur Charakterisierung der Rolle der Adenosinrezeptoren wurden CD73-/-- und A2bAR-/--Mäuse verwendet. Die CD73-/--Mäuse können durch die fehlende 5-Ektonukleotidase (CD73) kein endogenes Adenosin bilden, welches ein wichtiger Mediator für den Myokardschutz ist. Dagegen wurde bei den A2bAR-/--Mäusen der Adenosin-A2b-Rezeptor deletiert, welcher bei der Reperfusion eine Schlüsselrolle spielt. In einem in situ Kaninchenmodell haben weitere Untersuchungen des Canrenoats stattgefunden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Eplerenon während der Reperfusion die Infarktgröße nach einem Myokardinfarkt signifikant reduziert und dass dieser Schutzmechanismus von PKC, PI3-Kinase und den weiteren Kinasen Akt und ERK 1/2 abhängig ist. Weiterhin konnte sowohl bei der Infarktgrößenbestimmung in isolierten Rattenherzen als auch im in situ Mausmodell, in den CD73-/--Mäusen, die Beteiligung des Adenosins bei dem durch Eplerenon vermittelten Myokardschutz nachgewiesen werden. Mit Hilfe des in situ Mausmodells konnte gezeigt werden, dass Canrenoat ebenfalls eine Myokard schützende Wirkung zeigt. Dabei wurde die maximale Reduktion der Infarktgröße mit einer Konzentration von 1 mg/kg erreicht, wenn das Canrenoat 5 min vor Beginn der Reperfusion injiziert wurde. Anhand der Untersuchungen an den CD73-/-- und A2bAR-/--Mäusen konnte gezeigt werden, dass das extrazelluläre Adenosin und der Adenosin-A2b-Rezeptor für den durch Canrenoat vermittelten Myokardschutz essenziell sind. Canrenoat hat sich im in situ Kaninchenmodell ebenfalls als kardioprotektiv erwiesen und zeigte keine Veränderungen der hämodynamischen Parameter. In dem Modell der isolierten Rattenherzen konnte die kardioprotektive Wirkung des Canreonats erneut bestätigt werden und der Schutzmechanismus war von den Kinasen Akt und ERK 1/2 abhängig. Die beiden MR-Antagonisten haben die Fähigkeit, die negative Wirkung von Aldosteron zu unterbinden und damit die Infarktgröße nach einem akuten Myokardinfarkt zu senken. Die Untersuchungen zeigten, dass erst mit einer höheren Aldosteron-Konzentration die kardioprotektive Wirkung dieser MR-Antagonisten aufgehoben und die Phosphorylierung der Akt- und ERK 1/2-Kinase reduziert werden konnte. Die in dieser Arbeit vorliegenden Ergebnisse liefern neue Ansätze für pharmakologische Interventionen zur Behandlung des akuten Myokardinfarktes.
Background: Chronic kidney disease (CKD) and low serum total testosterone (TT) concentrations are independent predictors of mortality risk in the general population, but their combined potential for improved mortality risk stratification is unknown. Methods: We used data of 1,822 men from the population-based Study of Health in Pomerania followed- up for 9.9 years (median). The direct effects of kidney dysfunction (estimated glomerular filtration rate <60 ml/min/ 1.73 m<sup>2</sup>), albuminuria (urinary albumin-creatinine ratio ≧2.5 mg/mmol) and their combination (CKD) on all-cause and cardiovascular mortality were analyzed using multivariable Cox regression models. Serum TT concentrations below the age-specific 10th percentile (by decades) were considered low and were used for further risk stratification. Results: Kidney dysfunction (hazard ratio, HR, 1.40; 95% confidence interval, CI, 1.02–1.92), albuminuria (HR, 1.38; 95% CI, 1.06–1.79), and CKD (HR, 1.42; 95% CI, 1.09–1.84) were associated with increased all-cause mortality risk, while only kidney dysfunction (HR, 2.01; 95% CI, 1.21–3.34) was associated with increased cardiovascular mortality risk after multivariable adjustment. Men with kidney dysfunction and low TT concentrations were identified as high-risk individuals showing a more than 2-fold increased all-cause mortality risk (HR, 2.52; 95% CI, 1.08–5.85). Added to multivariable models, nonsignificant interaction terms suggest that kidney dysfunction and low TT are primarily additive rather than synergistic mortality risk factors. Conclusion: In the case of early loss of kidney function, measured TT concentrations might help to detect high-risk individuals for potential therapeutic interventions and to improve mortality risk assessment and outcome.
Noch immer stellt der akute Myokardinfarkt eine der Haupttodesursachen in den Industrienationen dar. Dabei ist hinlänglich bekannt, dass eine möglichst schnelle Wiederherstellung des koronaren Blutflusses nach einem Koronarverschluss die entscheidende therapeutische Maßnahme ist. Leider führt aber genau diese Maßnahme oftmals selbst zu ausgeprägten Reperfusionsschäden am unterversorgten Myokardgewebe. Mit Entdeckung der ischämischen Postkonditionierung durch kurze Ischämie/ Reperfusionssequenzen nach Wiedereröffnung der betroffenen Koronarie wurde erstmals deutlich, dass eine drastische Senkung der Infarktgröße möglich ist. Da diese Art der Behandlung aber technisch sehr aufwendig ist, besteht vermehrt der Wunsch, pharmakologische Interventionen zu Beginn der Reperfusion mit dem Ziel der Infarktgrößensenkung zu etablieren. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich daher mit der rezeptorvermittelten Postkonditionierung ischämischer Herzen und der Charakterisierung der zugrunde liegenden Signaltransduktion. Hierfür wurden die Aktivierung von delta-Opioidrezeptoren mittels DADLE und die Stimulation von Adenosinrezeptoren mittels NECA gewählt. Zunächst wurde ein Infarktmodell mit isolierten Kaninchenherzen etabliert, welches sowohl die Untersuchung der Infarktausprägung als auch die Ermittlung der am Myokardschutz beteiligten Signalelemente ermöglichte. Des Weiteren wurde ein Kardiomyozyten-basiertes Zellmodell entwickelt, an dem die oxidativen Bedingungen während der Reperfusion durch Zugabe von Wasserstoffperoxid simuliert werden können. Hierbei führt der Radikalstress durch Öffnung der mPTP zum Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials. Mit Hilfe dieses Zellmodells war es möglich, die Beteiligung einzelner Kardiomyozyten am rezeptorvermittelten Zellschutz näher zu charakterisieren. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine Stimulation von delta-Opioidrezeptoren mittels DADLE während der Reperfusion zu einer deutlichen Senkung der Infarktgröße in isolierten Kaninchenherzen führt. Dabei trat die Signalweiterleitung in Abhängigkeit von membranständigen Matrix-Metalloproteinasen und der Aktivierung des EGF-Rezeptors auf. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass durch die Behandlung mit DADLE eine Phosphorylierung und somit auch Aktivierung der zellschützenden Signalelemente EGFR, Akt und Erk 1/2 stattfindet. Auch die Stimulation von Adenosinrezeptoren (A1 und/oder A2) mittels NECA führte in diesem Infarktmodell zu einer signifikanten Senkung der Infarktgröße. Es konnte sowohl die Infarktgrößensenkung als auch die NECA-vermittelte Phoshorylierung der p70S6-Kinase durch Rapamycin blockiert werden. Des Weiteren konnten Wasserstoffperoxid-behandelte Kardiomyozyten durch NECA über eine deutlich verzögerte Öffnung der mPTP vor einem Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials geschützt werden. Auch hier zeigte sich der NECA-vermittelte Zellschutz in Abhängigkeit von einer Aktivierung der p70S6-Kinase. Ein weiterer Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der Rolle der konstitutiv aktiven GSK-3beta (Glykogensynthasekinase-3beta) während der Postkonditionierung ischämischer Herzen. Es konnte nachgewiesen werden, dass eine Inhibition dieser Kinase mittels SB216763 zu einem deutlichen Schutz vor ischämiebedingter Infarzierung führt. Dabei zeigte sich eine Abhängigkeit von der Aktivierung der Signalelemente Src und PI3-Kinase/Akt. Eine Involvierung von Adenosinrezeptoren, der PKC und Erk 1/2 wurde dagegen nicht gefunden. Anhand des Kardiomyozytenmodells konnte die Bedeutung der GSK-3beta bei der Übermittlung des Zellschutzes nochmals bestätigt werden. So führte eine adenovirale Transfektion mit einer dominant negativen GSK-3beta zu einem stabilisierten mitochondrialen Memranpotential, während eine DADLE-vermittelte Protektion durch die Expression einer konstitutiv aktiven GSK-3beta unterdrückt wurde. Zusammengefasst konnte in dieser Arbeit eine mögliche pharmakologische Intervention zur Behandlung des akuten Myokardinfarktes durch Auslösung einer rezeptorvermittelten Myokardprotektion aufgezeigt werden. Ein weiterer möglicher Therapieansatz könnte außerdem die pharmakologische Inhibition der GSK-beta sein.
Salivary glands provide secretory functions, including secretion of xenobiotics and among
them drugs. However, there is no published information about protein abundance of drug transporters
measured using reliable protein quantification methods. Therefore, mRNA expression and absolute
protein content of clinically relevant ABC (n = 6) and SLC (n = 15) family member transporters in the
human parotid gland, using the qRT-PCR and liquid chromatography-tandem mass spectrometry
(LC−MS/MS) method, were studied. The abundance of nearly all measured proteins ranged between
0.04 and 0.45 pmol/mg (OCT3 > MRP1 > PEPT2 > MRP4 > MATE1 > BCRP). mRNAs of ABCB1,
ABCC2, ABCC3, SLC10A1, SLC10A2, SLC22A1, SLC22A5, SLC22A6, SLC22A7, SLC22A8, SLCO1A2,
SLCO1B1, SLCO1B3 and SLCO2B1 were not detected. The present study provides, for the first time,
information about the protein abundance of membrane transporters in the human parotid gland,
which could further be used to define salivary bidirectional transport (absorption and secretion)
mechanisms of endogenous compounds and xenobiotics.
In Germany, around 5.7 million people suffer from osteoporosis. Osteoporosis is characterised by a reduced bone mineral density that leads to an increased risk of fractures. The 11β-hydroxysteroid dehydrogenase 1 (11β-HSD1) is an important regulator of local cortisol metabolism. It converts biologically inactive cortisone to biologically active cortisol, but can also catalyse the reverse reaction. 11β-HSD1 is strongly expressed in liver, but 11β-HSD1 expression and activity were also reported in bone. Moreover, polymorphisms in intron 5 of HSD11B1 (the gene encoding for 11β-HSD1) are associated with bone mineral density (BMD) and risk of fractures.
This work aimed to confirm and refine the associations between polymorphisms in intron 5 of HSD11B1 and BMD, and to identify the underlying molecular and cellular mechanisms. To this end, analyses were performed on three different levels:
i) studies in humans, to confirm and refine the association of polymorphisms in intron 5 of HSD11B1 with BMD, suppressed cortisol levels (PDC) and stiffness index,
ii) cellular analyses, to identify the role of 11β-HSD1 in differentiation of the immortalised human mesenchymal stem cell line SCP-1,
iii) molecular genetic analyses, to reveal the effect of intron 5 polymorphisms on transcriptional regulation.
Fine-mapping analyses of already existing clinical data from 452 osteoporosis patients (HSD study) did not point to another intron 5 SNP as being causative for the observed clinical association. A second prospective clinical study (OsteoGene) was performed to confirm the association of rs11811440 and rs932335 with PDC levels and BMD. A trend to decreased PDC levels and increased BMD was observed in homozygous carriers of the minor A-allele of rs11811440 in patients above the age of 65 years. Pooled analyses of the HSD and the OsteoGene studies revealed a significant association of the minor A-allele with increased Z-scores of the left femoral neck. No associations of rs11811440 and rs932335 with stiffness index, BMI and fat depots were detected the general population using data from the SHIP study.
To analyse the effect of 11β-HSD1 on differentiation of mesenchymal stem cells, HSD11B1 overexpressing and HSD11B1 knockout SCP-1 cells were generated. HSD11B1 was stably overexpressed in SCP-1 cells using targeted chromosomal integration. The successful overexpression was shown by 243-fold increased HSD11B1 mRNA expression levels and a 9 fold increased 11β-HSD1 activity, compared to the wildtype cells. Knockout cells were generated by CRISPR-Cas9 mediated gene editing targeting exon 2 and exon 5 of HSD11B1. Using next generation sequencing, the clones 1C4 and 2D10 were confirmed to carry two inactive HSD11B1 alleles and were chosen for further analyses. mRNA expression was unchanged in both knockout clones. However, a clear enzyme activity was detected in the 2D10 clone, whereas no cortisol production was detected in the 1C4 clone. SNaPshot analyses revealed the presence of wildtype cells in the 2D10 clone that became predominant with increased passages. Therefore, further analyses were focused on the 1C4 clone only. The protein expression in the 1C4 clone decreased to 30% of the expression of the wildtype cells.
HSD11B1 expression and cortisol production were compared between wildtype, knockout and overexpressing SCP-1 cells under three differentiation conditions: adipogenic, osteogenic with 1α,25-dihydroxyvitamin D3 and osteogenic with dexamethasone. HSD11B1 expression increased upon adipogenic differentiation and in the presence of cortisone in the wildtype and the overexpressing, but not in the knockout cells. Also, the cortisol production from cortisone increased over time in the overexpressing and the wildtype cells, but not in the knockout cells. The increase was dependent on the differentiation used between 3-fold and 9-fold higher in the overexpressing than in the wildtype cells.
The generated and validated overexpressing and knockout cell lines were used to analyse the influence of 11β-HSD1 on adipogenic and osteogenic differentiation. Upon adipogenic differentiation, the overexpressing cells accumulated significantly more lipid droplets than the wildtype cells. The accumulation of lipid droplets was not abolished in the knockout. However, when dexamethasone was substituted by cortisone, the knockout cells accumulated less lipid droplets than in the presence of dexamethasone, supporting the involvement of 11β-HSD1 in adipogenic differentiation. Expression of the adipogenic markers FABP4 and LPL increased upon adipogenic differentiation, but a distinct influence of the presence or absence of HSD11B1 on the FABP4 and LPL expression was not detected. Upon osteogenic differentiation with 1α,25-dihydroxyvitamin D3, ALP activity increased only in the knockout cells (more than 5-fold). Accordingly, the strongest increase in ALPL expression was detected also in the knockout cells. Both, ALP activity and gene expression were independent of cortisone. Addtionally, BGLAP expression was increased upon osteogenic differentiation. Unexpectedly, in the presence of cortisone, BGLAP expression increased in the overexpressing cells. Expression of the Wnt inhibitor DKK1 also increased in the overexpressing cells in the presence of cortisone indicating a decreased osteogenic differentiation. Moreover, expression of the adipogenic markers FABP4 and LPL increased in the overexpressing cells in the presence of cortisone indicating a switch from osteogenic to adipogenic differentiation. Upon osteogenic differentiation with dexamethasone, ALP activity and matrix mineralisation was lowest in the overexpressing cells.
Finally, the effects of the SNPs rs11811440, rs11119328, rs1000283 and rs932335 in intron 5 of HSD11B1 on transcriptional regulation were analysed by reporter gene assays and electrophoretic mobility shift assays. All four SNPs are genetically linked and are localized within evolutionary conserved regions. The minor C-allele of rs932335 significantly increased luciferase activity. In contrast, the major G-allele of rs932335 showed strong protein binding. However, no transcription factor binding sites were identified at the SNP sites. Additionally, bioinformatics analyses of publicly available RNA-Seq data of adipose tissue and liver confirmed the absence of alternative splicing. Alignment of HSD11B1 intron 5 to the Rfam database predicted the presence of non-coding RNAs (ncRNAs) in intron 5. However, none of the ncRNAs overlapped with the SNP sites.
In conclusion, 11β-HSD1 was shown to be involved in adipogenic differentiation and peripheral cortisol production by 11β-HSD1 promotes a switch from osteogenic to adipogenic differentiation. Moreover, among osteoporosis patients, homozygous carriers of the minor A-allele of rs11811440 have increased Z-scores of the femoral neck. Furthermore, HSD11B1 knockout and overexpressing cell lines were successfully generated and validated. These cell lines could be a useful tool in future analyses of the role of peripheral cortisol activation by 11β-HSD1 in differentiation of mesenchymal stem cells.
Die Bedeutung der Einschätzung von Interaktionen verschiedener Medikamente und der hiermit potentiell einhergehenden Nebenwirkungen nehmen aufgrund der stetigen Entwicklung neuer medikamentöser Therapieansätze und der hierdurch bedingt vermehrt auftretenden Polypharmazie kontinuierlich zu. Die Grundlage für das Verständnis dieser Interaktionen bilden die Pharmakokinetik und die Pharmakodynamik. Wichtige Einflussfaktoren im Hinblick auf die Regulation dieser beiden Prozesse sind die nukleären Rezeptoren CAR und PXR, die als ligandenabhängige Transkriptionsfaktoren entsprechend der anfallenden Metaboliten den Metabolismus mitbestimmen. Ein bekannter Induktor von CAR mit seinen Zielgenen in der Pharmakokinetik ist Efavirenz – ein wichtiger Bestandteil der HIV- Therapie. Hierauf basierend wurde in einer klinischen Studie mit 12 Probanden u.a. Gewebe (PBMCs und Intestinum) unter der kontrollierten Gabe von Efavirenz mit Ezetimib untersucht. Letzteres Medikament wurde zum einen als Parameter für den Metabolismus der zahlreichen Zielgene von CAR und zum anderen als eine mögliche Option zur Behandlung der Dyslipidämie – der Entstehung einer Dysbalance als vermeintliche Nebenwirkung von Efavirenz – eingesetzt. Diese klinische Studie ergab, dass Efavirenz keine Regulation im Intestinum auf die mRNA bewirken konnte, jedoch vereinzelt Induktionen auf Proteinebene. Im Modell der Caco2-Zellen ließ sich prinzipiell nach Exposition von Efavirenz eine Induktion feststellen. Auch im Kompartiment der PBMCs ließ sich generell – innerhalb der Studie und auch in vitro– eine Induktion detektieren. Dabei konnte jedoch weder eine relevante pharmakokinetische noch eine pharmakodynamische Interaktion zwischen Efavirenz und Ezetimib eindeutig nachgewiesen werden. Insgesamt scheinen gleiche Zielgene von CAR abhängig vom Kompartiment regulationsfähig zu sein. Ob letztendlich die Distribution von Efavirenz über die Induktion oder auch das Kompartiment und dessen Umstände an sich die Induktion beeinflussen bleibt offen. Die Feststellung grundlegender Schlussfolgerungen ist somit aufgrund der derzeit noch unklaren Confounder noch nicht möglich, weshalb weitere komplementäre Forschungsvorhaben erforderlich sind, um zusätzliche Erkenntnisse zu erzielen.
Im modernen hygienischen Selbstverständnis westlicher und ostasiatischer Kulturen spielt die Reduktion des Schweißgeruchs eine zentrale Rolle. Dies wird durch eine Verringerung der Schweißsekretion, die Bekämpfung schweißgeruchverursachender Bakterien und die Maskierung des Restgeruchs erreicht. Ein Präventivkonzept auf der Basis der Reduktion von apokrinen Sekreten konnte bisher nicht etabliert werden. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die Stoffwechselwege, auf denen Schweißgeruchpräkursoren entstehen und sekretiert werden, nicht umfassend untersucht wurden. Vorarbeiten zu dieser Arbeit lieferten jedoch bereits Hinweise darauf, dass das Transportprotein ABCC11 eine bedeutende Komponente in der Entstehung von Schweißgeruch darstellt. Für den kaukasischen Körpergeruch ist u.a. das schwefelhaltige Geruchsmolekül 3-Methyl-3-sulfanylhexanol charakteristisch. In der vorliegenden Arbeit wurde durch Messung des ABCC11-vermittelten Transports in isolierten Membranvesikeln gezeigt, dass der postulierte Glutathionylpräkursor von 3-Methyl-3-sulfanylhexanol (SG3MHol) ein Transportsubstrat darstellt, während für das final auf der Haut nachweisbare Cysteinyl-Glycyl-Konjugat (CG3MHol) kein ABCC11-vermittelter Transport festgestellt werden konnte. Dies legt nahe, dass in den apokrinen sekretorischen Vesikeln SG3MHol zu CG3MHol umgewandelt wird. Diese Reaktion wird durch γ-Glutamyltransferasen katalysiert. Sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene konnte die Expression von γ-Glutamyltransferase 1 (GGT1) in der apokrinen Schweißdrüse nachgewiesen werden. Immunfluoreszenzmikroskopische Analysen gaben darüber hinaus den Hinweis auf eine Lokalisation in apikalen Vesikeln sekretorischer Zellen. Durch rekombinantes humanes GGT1 konnte die Abspaltung der γ-peptidisch gebundenen Glutaminsäure des SG3MHol in vitro katalysiert werden. Der Nachweis des entstehenden CG3MHol wurde durch massenspektrometrische Verfahren erbracht. Auf diese Weise konnten sowohl die Frage nach der Rolle des ABCC11-vermittelten Transports, als auch der intravesikulären Deglutamylierung durch GGT1 beantwortet werden. Für die Entstehung des Glutathionylkonjugats von 3-Methylhexanol (3MHol) wurde mit GSTM5 eine Glutathion-S-Transferase identifiziert, die auf mRNA- und Proteinebene abundant in apokrinen Schweißdrüsen exprimiert wird. Für die Konjugation mit GSH wurde mit 3-Methylhex-2-enal (3MHal) eine α, β-ungesättige Carbonylverbindung untersucht. Das aus der Konjugation hervorgehende aldehydische Glutathionylkonjugat SG3MHal wurde durch NMR-Spektroskopie nachgewiesen, allerdings entstand es unter in vitro Bedingungen auch in Abwesenheit Glutathion-transferierender Enzyme. Vor einem Transport durch ABCC11 muss SG3MHal jedoch noch zum alkoholischen SG3MHol reduziert werden. Hinweise auf das beteiligte Enzym Aldo-Keto-Reduktase 1 B10 (AKR1B10) konnten wiederum aus mRNA-Expressionsdaten entnommen werden. Auf Proteinebene konnte AKR1B10 ebenfalls nachgewiesen werden. Dieses Enzym ist unter anderem in der Lage aldehydische Glutathionylkonjugate zu reduzieren. Für die Reduktion von SG3MHal zu SG3MHol durch AKR1B10 konnten in vitro erste Anhaltspunkte gefunden und durch massenspektrometrische Verfahren bestätigt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmalig ein potentieller Entstehungsweg von schwefelhaltigen Schweißgeruchpräkursoren postuliert und durch experimentelle Befunde gestützt. Die beteiligten enzymatischen Umsetzungs- und Transportvorgänge wurden in vitro nachgestellt und die Entstehung der Schweißgeruchpräkursoren damit in die Nähe von Detoxifizierungsprozessen gerückt. Der in dieser Arbeit beschriebene trunkierte Mercapturatweg der apokrinen Schweißdrüse stellt damit einen ersten Ansatz dar, die Entstehung sekretierter Geruchsvorläufermoleküle zu erklären. Dies liefert einen Angriffspunkt zur kosmetischen Reduktion von Schweißgeruch an seiner Wurzel. Für die beteiligten Schlüsselenzyme konnten bereits erste Inhibitoren identifiziert werden.
Thrombozyten sind von zentraler Bedeutung sowohl für die Blutstillung als auch für die Regulation von Entzündungsprozessen. Nach der Aktivierung setzen sie proinflammatorische Mediatoren wie Sphingosin-1-Phosphat (S1P) frei. Die spezifischen Mechanismen der S1P-Freisetzung aus Thrombozyten sind jedoch noch weitgehend unbekannt. In der vorliegenden Arbeit konnte anhand eines vesikulären Transportassays bestätigt werden, dass ein ATP-abhängiges Transportsystem für S1P in Thrombozytenmembranen vorliegt. Der ATP-abhängige Transport von fluoreszenzmarkiertem S1P (F-S1P) in inside-out-Membranvesikel von humanen Thrombozyten wurde durch das organische Anion MK571, einen Inhibitor von ABC-Transportern der Multidrug Resistance Protein (MRP)-Subfamilie, gesenkt. Anhand von Transportversuchen mit inside-out-Membranvesikeln von MRP4 (ABCC4)-überexprimierenden Sf9-Insektenzellen und MRP5 (ABCC5)-überexprimierenden V79-Fibroblasten konnten MRP4 und MRP5 als S1P-Transporter identifiziert werden. Die Untersuchung von MRP4-defizienten Mäusen ergab signifikante Abnahmen der S1P-Spiegel im plättchenreichen Plasma dieser Tiere. Die S1P-Spiegel der MRP5-defizienten Männchen glichen dem WT, während die Weibchen nahezu eine Verdopplung des S1P-Gehalts im plättchenarmen Plasma im Vergleich zum Wildtyp zeigten. Die Ergebnisse bei den genetisch veränderten Mäusen lassen vermuten, dass der Transporter MRP4 auch physiologisch an der S1P-Speicherung und -Freisetzung aus Thrombozyten beteiligt ist, während MRP5 die S1P-Plasmaspiegel eher unabhängig von den Thrombozyten zu beeinflussen scheint. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass der MRP4-vermittelte Transport von F-S1P durch Fluvastatin mit einer IC50 von 52 µM und Rosuvastatin mit einer IC50 von 32 µM gehemmt wird. Darauf aufbauend konnte mittels Massenspektrometrie (LC-MS/MS) nachgewiesen werden, dass die Vorinkubation mit Fluvastatin bzw. Rosuvastatin die endogene stimulierte S1P-Freisetzung aus humanen Thrombozyten ex vivo senkt. Diese inhibitorische Wirkung der Statine auf den Transport des proinflammatorischen S1P stellt einen neuen möglichen Mechanismus dar, mit dem die Statine pleiotrope entzündungshemmende Effekte ausüben können. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass MRP4 als S1P-Transporter identifiziert wurde und Statine den MRP4-vermittelten Transport beeinträchtigen.
Membrane monocarboxylate transporter 1 (SLC16A1/MCT1) plays an important role in
hepatocyte homeostasis, as well as drug handling. However, there is no available information
about the impact of liver pathology on the transporter levels and function. The study was aimed to
quantify SLC16A1 mRNA (qRT-PCR) and MCT1 protein abundance (liquid chromatography–tandem
mass spectrometry (LC¬¬–MS/MS)) in the livers of patients diagnosed, according to the standard
clinical criteria, with hepatitis C, primary biliary cirrhosis, primary sclerosing hepatitis, alcoholic liver
disease (ALD), and autoimmune hepatitis. The stage of liver dysfunction was classified according to
Child–Pugh score. Downregulation of SLC16A1/MCT1 levels was observed in all liver pathology
states, significantly for ALD. The progression of liver dysfunction, from Child–Pugh class A to C,
involved the gradual decline in SLC16A1 mRNA and MCT1 protein abundance, reaching a clinically
significant decrease in class C livers. Reduced levels of MCT1 were associated with significant
intracellular lactate accumulation. The MCT1 transcript and protein did not demonstrate significant
correlations regardless of the liver pathology analyzed, as well as the disease stage, suggesting
posttranscriptional regulation, and several microRNAs were found as potential regulators of MCT1
abundance. MCT1 membrane immunolocalization without cytoplasmic retention was observed in all
studied liver pathologies. Overall, the study demonstrates that SLC16A1/MCT1 is involved in liver
pathology, especially in ALD
ATP-abhängige Transporter spielen eine wichtige Rolle beim Transport von endogenen und exogenen Stoffen durch Zellmembranen. Die ATP-Transporter ABCG2 und MRP5 wurden in Medikamenten-resistenten Tumorzelllinien entdeckt. Später konnten sie auch in gesundem Gewebe nachgewiesen werden. Sie transportieren ganz unterschiedliche Stoffe, die keiner einheitlichen Gruppe angehören. ABCG2 transportiert unter anderem Medikamente, die in der Therapie maligner Erkrankungen eingesetzt werden und eine ausgesprochene Kardiotoxizität besitzen. MRP5 transportiert als Substrat zyklisches Guanosinmonophosphat (cGMP), welches bei der Relaxation glatter Muskelzellen kardialer Gefäße eine große Rolle spielt. In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression von ABCG2 und MRP5 an 15 Proben humanen Ventrikelmyokards und 52 Proben humanen Vorhofgewebes von Patienten mit koronarer Herzkrankheit untersucht. Von den 15 Proben humanen Ventrikelmyokards waren fünf von Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie (DCM), fünf von Patienten mit ischämischer Kardiomyopathie (ICM) und fünf von herzgesunden Patienten. Mittels realtime- RT-PCR wurde ABCG2- bzw. MRP5-mRNA in allen Proben nachgewiesen. Zum einen wurde mittels ausgewählter Primer eine ABCG2- bzw. MRP5-cDNA-Sequenz auf dem TaqMan® von Applied Biosystems vervielfältigt und anschließend statistisch ausgewertet. Zum anderen wurde ABCG2 bzw. MRP5 mit den monoklonalen Antikörpern BXP-21 bzw. AFM immunhistochemisch dargestellt. ABCG2 wurde außerdem mittels Immunfluoreszenz dargestellt. Die Expression von ABCG2 und MRP5 konnte in allen Proben humanen Herzgewebes mittels real-time PCR und Immunhistochemie / Immunfluoreszenz gezeigt werden. Hinsichtlich der Expression konnte für die mRNA von ABCG2 eine signifikante Erhöhung (p = 0,05) bei DCM und ICM gegenüber gesundem Gewebe gezeigt werden. Die im Rahmen dieser Arbeit vorgelegten Ergebnisse weisen auf eine mögliche Beteiligung der ATP-Transporter ABCG2 und MRP5 an Transportprozessen am Herzen hin. Die Interaktionen von Pharmaka und die individuell unterschiedlichen Wirkungen am Herzen bei der Pharmakotherapie können durch diese Arbeit besser verstanden werden.
Neurosteroids, comprising pregnane, androstane, and sulfated steroids can alter neuronal excitability through interaction with ligand-gated ion channels and other receptors and have therefore a therapeutic potential in several brain disorders. They can be formed in brain cells or are synthesized by an endocrine gland and reach the brain by penetrating the blood–brain barrier (BBB). Especially sulfated steroids such as pregnenolone sulfate (PregS) and dehydroepiandrosterone sulfate (DHEAS) depend on transporter proteins to cross membranes. In this review, we discuss the involvement of ATP-binding cassette (ABC)- and solute carrier (SLC)-type membrane proteins in the transport of these compounds at the BBB and in the choroid plexus (CP), but also in the secretion from neurons and glial cells. Among the ABC transporters, especially BCRP (ABCG2) and several MRP/ABCC subfamily members (MRP1, MRP4, MRP8) are expressed in the brain and known to efflux conjugated steroids. Furthermore, several SLC transporters have been shown to mediate cellular uptake of steroid sulfates. These include members of the OATP/SLCO subfamily, namely OATP1A2 and OATP2B1, as well as OAT3 (SLC22A3), which have been reported to be expressed at the BBB, in the CP and in part in neurons. Furthermore, a role of the organic solute transporter OSTα-OSTβ (SLC51A/B) in brain DHEAS/PregS homeostasis has been proposed. This transporter was reported to be localized especially in steroidogenic cells of the cerebellum and hippocampus. To date, the impact of transporters on neurosteroid homeostasis is still poorly understood. Further insights are desirable also with regard to the therapeutic potential of these compounds.
Intestinal transporter proteins are known to affect the pharmacokinetics and in turn the efficacy and safety of many orally administered drugs in a clinically relevant manner. This knowledge is especially well-established for intestinal ATP-binding cassette transporters such as P-gp and BCRP. In contrast to this, information about intestinal uptake carriers is much more limited although many hydrophilic or ionic drugs are not expected to undergo passive diffusion but probably require specific uptake transporters. A transporter which is controversially discussed with respect to its expression, localization and function in the human intestine is the organic cation transporter 1 (OCT1). This review article provides an up-to-date summary on the available data from expression analysis as well as functional studies in vitro, animal findings and clinical observations. The current evidence suggests that OCT1 is expressed in the human intestine in small amounts (on gene and protein levels), while its cellular localization in the apical or basolateral membrane of the enterocytes remains to be finally defined, but functional data point to a secretory function of the transporter at the basolateral membrane. Thus, OCT1 should not be considered as a classical uptake transporter in the intestine but rather as an intestinal elimination pathway for cationic compounds from the systemic circulation.
Das P-Glykoprotein stellt ein wichtiges membranäres Transportprotein zum Schutz des Organismus vor Xenobiotika sowie toxischen endogenen Metaboliten dar und ist an der Aufrechterhaltung der Barrierefunktion von Blut-Gewebe-Schranken beteiligt. Außerdem beeinflussen Pgp-vermittelte Transportvorgänge die Pharmakokinetik einiger Arzneimittel. Eine Modulation der Pgp-Funktion ist in vielerlei Hinsicht von Bedeutung. Daher war es Ziel dieser Arbeit, die Interaktionen zweier unterschiedlicher Substanzen, des mit der AD assoziierten Beta-Amyloids und des Arzneistoffes Heparin, mit dem Pgp zu untersuchen und die modulatorischen Fähigkeiten auf die Aktivität des Effluxtransporters in einem Zellsystem zu bewerten. Dafür stand eine polar wachsende, mit humanem MDR1-transfizierte Zelllinie zur Verfügung, die sich zur Untersuchung des transepithelialen Transportes eignete. Bei der Durchführung der funktionellen in-vitro-Assays ließen sich eine signifikant verstärkte Akkumulation, ein signifikant inhibierter apikaler Efflux von Rh123 und die signifikant verminderte ATP-abhängige Rh123-Aufnahme in Membranvesikel in Gegenwart von UFH sowie LMWH im Pgp-überexprimierenden Epithelzellmodell nachweisen. Ein direkter Transport markierter Heparine konnte ebenso gezeigt werden. Als Kontrolle dienten zum Einen parentale LLC-PK1, zum Anderen zeigten vergleichende Betrachtungen bekannter Pgp-Modulatoren wie Verapamil oder CsA in diesen Transportversuchen ähnliche Ergebnisse. Neben inhibitorischen Effekten der Aβ-Peptide auf die Pgp-Funktion konnte ein direkter aktiver Pgp-vermittelter Transport von synthetischem Aβ1-40 und Aβ1-42 gezeigt werden. Sowohl in polarisierten Zellmonolayern aus MDR1-transfizierten LLC-Zellen, die als in-vitro-Modell für das vaskuläre Endothel der Blut-Hirn-Schranke dienen, als auch in aus den Zellen isolierten Membranvesikeln konnte ein vektorieller bzw. ATP-abhängiger Transport der fluoreszenzmarkierten Peptide nachgewiesen werden. Eine Beteiligung des Pgp wurde anhand der Minderung des Transportes durch den spezifischen Inhibitor CsA verifiziert. Damit stellen sowohl die Heparine als auch die Beta-Amyloide nicht nur Inhibitoren des Pgp-vermittelten Transportes dar, sondern können selbst zum breiten Spektrum der affinen Pgp-Substrate gezählt werden. Sie bewirken eine nachgewiesene pharma-kologische Modulation der Pgp-Aktivität und bieten Anhaltspunkte für weitere Untersuchungen der komplexen Funktionen des Transportproteins.
PIM1 Inhibition Affects Glioblastoma Stem Cell Behavior and Kills Glioblastoma Stem-like Cells
(2021)
Despite comprehensive therapy and extensive research, glioblastoma (GBM) still represents the most aggressive brain tumor in adults. Glioma stem cells (GSCs) are thought to play a major role in tumor progression and resistance of GBM cells to radiochemotherapy. The PIM1 kinase has become a focus in cancer research. We have previously demonstrated that PIM1 is involved in survival of GBM cells and in GBM growth in a mouse model. However, little is known about the importance of PIM1 in cancer stem cells. Here, we report on the role of PIM1 in GBM stem cell behavior and killing. PIM1 inhibition negatively regulates the protein expression of the stem cell markers CD133 and Nestin in GBM cells (LN-18, U-87 MG). In contrast, CD44 and the astrocytic differentiation marker GFAP were up-regulated. Furthermore, PIM1 expression was increased in neurospheres as a model of GBM stem-like cells. Treatment of neurospheres with PIM1 inhibitors (TCS PIM1-1, Quercetagetin, and LY294002) diminished the cell viability associated with reduced DNA synthesis rate, increased caspase 3 activity, decreased PCNA protein expression, and reduced neurosphere formation. Our results indicate that PIM1 affects the glioblastoma stem cell behavior, and its inhibition kills glioblastoma stem-like cells, pointing to PIM1 targeting as a potential anti-glioblastoma therapy.
Sphingosine-1-phosphate (S1P) is a versatile signaling lipid involved in the regulation of numerous cellular processes. S1P regulates cellular proliferation, migration, and apoptosis as well as the function of immune cells. S1P is generated from sphingosine (Sph), which derives from the ceramide metabolism. In particular, high concentrations of S1P are present in the blood. This originates mainly from erythrocytes, endothelial cells (ECs), and platelets. While erythrocytes function as a storage pool for circulating S1P, platelets can rapidly generate S1P de novo, store it in large quantities, and release it when the platelet is activated. Platelets can thus provide S1P in a short time when needed or in the case of an injury with subsequent platelet activation and thereby regulate local cellular responses. In addition, platelet-dependently generated and released S1P may also influence long-term immune cell functions in various disease processes, such as inflammation-driven vascular diseases. In this review, the metabolism and release of platelet S1P are presented, and the autocrine versus paracrine functions of platelet-derived S1P and its relevance in various disease processes are discussed. New pharmacological approaches that target the auto- or paracrine effects of S1P may be therapeutically helpful in the future for pathological processes involving S1P.
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Rosuvastatin auf die eNOS-Expression (endotheliale NO-Synthase), LOX-1, dem Rezeptor für oxidiertes LDL, und verschiedene Adhäsionsmoleküle (ICAM-1, VCAM-1) in humanen Endothelzellen analysiert. Rosuvastatin zeigte keine physiologisch relevante Abnahme der Zellviabilität. In Hinblick auf die eNOS-mRNA- und Proteinexpression führte Rosuvastatin zu einer signifikanten Verbesserung sowohl unter normalen physiologischen als auch unter inflammatorsichen Bedingungen, ausgelöst durch eine Koinkubation mit TNF-alpha. Auch war es in der Lage, die Aktiviät der endothelialen NO-Synthase signifikant zu erhöhen. Eine Inkubation humaner Endothelzellen mit TNF-alpha resultierte in einer signifikanten Expressionserhöhung von LOX-1 sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene, welche durch eine gleichzeitige Gabe von Rosuvastatin sogar noch ausgeprägter ausfiel. Trotz dieser vermehrten Expression führte die Inkubation mit Rosuvastatin aber zu einer signifikant verminderten Aufnahme von oxLDL in die Zellen. Diese statinvermittelten Effekte ließen sich durch einen Inhibitor der Rho-assoziierten Proteinkinase (Y27632) imitieren. Des Weiteren konnte diese Arbeit zeigen, dass Rosuvastatin die Oberflächenexpression von ICAM-1 und VCAM-1 signifikant vermindert, wohingegen auf mRNA-Ebene eine Expressionssteigerung zu beobachten war. Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit konnten klären, dass dieser Widerspruch auf ein vermehrtes Shedding der löslichen Proteine zurückzuführen ist. Rosuvastatin vermittelt diese Effekte auf die Adhäsionsmoleküle möglicherweise durch das Eingreifen in den NF-kappaB-Signalweg, da es sowohl Effekte auf die Degradation von IkappaB-alpha als auch die Translokation der NF-kappaB-Untereinheit p50 ausübt.
Bei ersten Betrachtungen zum Zelltransport nahm man an, dass Stoffe passiv über die Zellmembran diffundieren. Nach weiteren Forschungen musste dies revidiert werden. Heute weiß man, dass dies fast nur über spezielle Proteine möglich ist. Diese Proteine sind Kanäle und Transporter welche aufgrund ihrer Funktion eine Schlüsselposition in der zellulären Homöostaste darstellen. Sie sorgen für die Aufnahme und den Ausstrom fast aller wichtigen Substanzen.
Im Jahr 2007 wurde die Entdeckung eines neue Zelltransporters, TETRAN (Tetracycline transporter-like protein), veröffentlicht. In ersten Untersuchungen zeigte sich ein bevorzugter Transport von NSAIDs über die Zellmembran. NSAIDs haben bei unterschiedlichen Personen abweichende Wirkungen bzw. Nebenwirkungen deren Gund bis heute noch nicht endgültig geklärt ist.
In dieser Arbeit konnten polymorphe TETRAN überexprimierende Zellen erzeugt werden und der Nachweis unterschiedlich starker Expression des Proteins in verschiedenen Geweben nachgewiesen werden. Unter anderem zeigte sich eine gute Expression in Plazentagewebe. Welches auch wegen guter Verfügbarkeit zur Reihensequenzierung von 25 Proben genutzt wurde. Es zeigten sich 28 Synonyme und 85 Veränderungen im Gencode welche Einfluss auf die Primärsequenz des Proteins haben. Diese wurden alle in einer berechneten Grafik des Proteins zusammengefasst und dargestellt. In drei Situationen bildete sich anstatt des Wechsels einer Aminosäure ein Stopcodon. Dies trat jedoch nie homozygot auf. So das immer ein vollständiges Protein vorhanden war. In Anlehnung an vergleichbare Studien könnte dies mit ein Grund der differenten Wirkung von NSAIDs sein. Umfangreichere Beweise können in weiteren Studien noch folgen.
Renal drug transporters such as the organic cation transporters (OCTs), organic anion
transporters (OATs) and multidrug resistance proteins (MRPs) play an important role in the tubular
secretion of many drugs influencing their efficacy and safety. However, only little is known about
the distinct protein abundance of these transporters in human kidneys, and about the impact of
age and gender as potential factors of inter-subject variability in their expression and function.
The aim of this study was to determine the protein abundance of MDR1, MRP1-4, BCRP, OAT1-3,
OCT2-3, MATE1, PEPT1/2, and ORCTL2 by liquid chromatography-tandem mass spectrometry-based
targeted proteomics in a set of 36 human cortex kidney samples (20 males, 16 females; median age
53 and 55 years, respectively). OAT1 and 3, OCT2 and ORCTL2 were found to be most abundant
renal SLC transporters while MDR1, MRP1 and MRP4 were the dominating ABC transporters.
Only the expression levels of MDR1 and ORCTL2 were significantly higher abundant in older donors.
Moreover, we found several significant correlations between different transporters, which may
indicate their functional interplay in renal vectorial transport processes. Our data may contribute to
a better understanding of the molecular processes determining renal excretion of drugs.
Transmembrane drug transport in hepatocytes is one of the major determinants of drug pharmacokinetics. In the present study, ABC transporters (P-gp, MRP1, MRP2, MRP3, MRP4, BCRP, and BSEP) and SLC transporters (MCT1, NTCP, OAT2, OATP1B1, OATP1B3, OATP2B1, OCT1, and OCT3) were quantified for protein abundance (LC-MS/MS) and mRNA levels (qRT-PCR) in hepatitis C virus (HCV)-infected liver samples from the Child–Pugh class A (n = 30), B (n = 21), and C (n = 7) patients. Protein levels of BSEP, MRP3, MCT1, OAT2, OATP1B3, and OCT3 were not significantly affected by HCV infection. P-gp, MRP1, BCRP, and OATP1B3 protein abundances were upregulated, whereas those of MRP2, MRP4, NTCP, OATP2B1, and OCT1 were downregulated in all HCV samples. The observed changes started to be seen in the Child–Pugh class A livers, i.e., upregulation of P-gp and MRP1 and downregulation of MRP2, MRP4, BCRP, and OATP1B3. In the case of NTCP, OATP2B1, and OCT1, a decrease in the protein levels was observed in the class B livers. In the class C livers, no other changes were noted than those in the class A and B patients. The results of the study demonstrate that drug transporter protein abundances are affected by the functional state of the liver in hepatitis C patients.
The G protein-coupled receptor proteinase-activated receptor 2 (PAR2) has been implicated
in various aspects of cellular physiology including inflammation, obesity and cancer. In cancer,
it usually acts as a driver of cancer progression in various tumor types by promoting invasion and
metastasis in response to activation by serine proteinases. Recently, we discovered another mode
through which PAR2 may enhance tumorigenesis: crosstalk with transforming growth factor-β
(TGF-β) signaling to promote TGF-β1-induced cell migration/invasion and invasion-associated gene
expression in ductal pancreatic adenocarcinoma (PDAC) cells. In this chapter, we review what is
known about the cellular TGF-β responses and signaling pathways affected by PAR2 expression,
the signaling activities of PAR2 required for promoting TGF-β signaling, and the potential molecular
mechanism(s) that underlie(s) the TGF-β signaling–promoting effect. Since PAR2 is activated through
various serine proteinases and biased agonists, it may couple TGF-β signaling to a diverse range of
other physiological processes that may or may not predispose cells to cancer development such as
local inflammation, systemic coagulation and pathogen infection.
Das MRP4 ist ein Mitglied der ABCC-Subfamilie der ATP-binding cassette transporters. Es transportiert eine große Vielfalt an endogenen und xenobiotischen Verbindungen aus der Zelle. Des Weiteren vermittelt MRP4 den Transport von Signalmolekülen wie z.B. zyklische Nukleotide. Das einzigartige Substratspektrum, die Regulation und die zelluläre Lokalisation des MRP4 stehen in Verbindung mit seiner möglichen Funktion beim Zell-Schutz und dem zellulären Signaling. MRP4 ist abhängig vom Zelltyp entweder in der basolateralen (Prostata, Leber) oder apikalen (Nieren, Kapillaren des Gehirns) Membran von polarisierten Zellen lokalisiert. Des Weiteren wird MRP4 auch in Thrombozyten und Erythrozyten exprimiert. Protein-Protein-Interaktionen können die Funktion, Lokalisation und Expression von Transportern in der Plasmamembran beeinflussen. Viele Interaktionen beinhalten die stabile Assoziation von Proteinen innerhalb von Multi-Untereinheitskomplexen sowie die vorübergehende Assoziation von regulatorischen Proteinen. MRP4 weist u.a. ein sogenanntes PDZ-Bindemotiv auf, welches durch die Aminosäuren ETAL charakterisiert wird und die Interaktion mit PDZ-Adaptorproteinen vermitteln kann. Speziell in Thrombozyten ist MRP4 neben der Plasmamembran auch in den δ-Granula lokalisiert. Hier könnten interagierende Proteine eine wichtige Rolle spielen. Änderungen in diesen Proteinen könnten eine Ursache für Störungen der Thrombozytenfunktion mit einer Fehllokalisation von MRP4 sein. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung möglicher Interaktionspartner von MRP4, insbesondere in Thrombozyten. Dafür wurde ein Fusionsprotein aus einem c-terminalen Fragment (117 Aminosäuren) des MRP4 mit der Glutathion-S-Transferase (GST) generiert. Nach Aufreinigung des Fusionsproteins (GST-MRP4) mittels Glutathion-Sepharose wurden pull-down-Experimente mit Thrombozytenlysat durchgeführt. Mittels Western Blot und LC-MS/MS-Analyse konnten als mögliche Interaktionspartner das EBP50/NHERF1, das PSD95, SNX27, die β-Untereinheit des AP3B1 und das HSP90 identifiziert werden. Durch indirekte Immunfluoreszenz konnte außerdem eine partielle Ko-Lokalisation der genannten möglichen Interaktionspartner und MRP4 in den Thrombozyten dargestellt werden. Ein weiterer Ansatz zur Untersuchung der Protein-Interaktion war die Ko-Präzipitation des MRP4 und der daran gebundenen Proteine mittels eines anti-MRP4-Antikörpers, der an magnetische beads gebunden war. Mithilfe der Ko-Immunpräzipitation konnten SNX27, HSP90, AP3B1, EBP50 und PSD95 unterschiedlich stark ko-präzipitiert werden. Es wurde untersucht, inwiefern das PDZ-Bindemotiv des MRP4 für die Interaktion der detektierten Interaktionsproteine essentiell ist. Dafür wurde ein GST-MRP4-Konstrukt ohne das C-terminale PDZ-Motiv generiert. Damit konnte gezeigt werden, dass das PDZ-Bindemotiv nur für die Interaktion mit SNX27, EBP50 und PSD95 notwendig ist, während die Bindung von AP3B1 und HSP90 unabhängig davon erfolgte. Nachdem auf Proteinebene mit verschiedenen Versuchen dargestellt werden konnte, welche Adaptorproteine mit dem MRP4 interagieren, sollte im letzten Abschnitt auf funktioneller Ebene gezeigt werden, inwiefern sich die Lokalisation des MRP4 verändert, sofern das Bindemotiv des MRP4 nicht mehr vorhanden ist bzw. die Adaptorproteine herunterreguliert werden. In Bezug auf das Herunterregulieren der Adaptorproteine wurde die megakaryoblastische Leukämie-Zelllinie M07e als Modell für Thrombozyten-Vorläuferzellen verwendet. Des Weiteren lag das Interesse bei den Interaktionsproteinen AP3, PSD95 und SNX27. Nach Transfektion der M07e-Zellen mit der entsprechenden siRNA und der sich anschließenden Immunfluoreszenz konnte gezeigt werden, dass die Ko-Lokalisation des MRP4 mit den Adaptorproteinen nach knock-down verringert und die Plasmamembran-Lokalisation von MRP4 signifikant gesteigert war. Umgekehrt sollte die Überexpression dieser Adaptorproteine die Plasmamembran-Lokalisation verringern. Dies wurde exemplarisch für SNX27 in MDCK-Zellen untersucht. Dabei sollte auch nochmals die Rolle des PDZ-Bindungsmotivs für die MRP4-Lokalisation gezeigt werden. Dafür wurden die Fluoreszenz-markierten Fusionsproteine CFP-MRP4, SNX27-YFP und das CFP-MRP4(-PDZ) synthetisiert, in MDCK-Zellen transfiziert und ihre Lokalisation mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Es zeigte sich, dass nach Ko-Transfektion des CFP-MRP4 mit SNX27-YFP das MRP4 hauptsächlich im Zell-Inneren lokalisiert war. Außerdem wurde verdeutlicht, dass das PDZ-Bindemotiv für die Internalisierung des MRP4 in das Innere der Zelle durch das Interaktionsprotein SNX27 essentiell ist. Zusammenfassend liefert diese Arbeit wichtige grundlegende Erkenntnisse zu möglichen Protein-Interaktionen von MRP4 und deren Einfluss auf die Lokalisation des Transporters. Deren mögliche physiologische und pathophysiologische Rolle für die MRP4-Funktion in Thrombozyten sollte in weiterführenden Studien näher untersucht werden.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Ort der Wirkstofffreisetzung als eine wichtige Einflussgröße für die Absorption von Arzneistoffen zu charakterisieren. Bezugnehmend auf die unterschiedliche Expression von Transportproteinen in den einzelnen Abschnitten des Magen-Darm-Traktes sollten Erkenntnisse über die regioselektive Absorption des P-gp-Substrates Talinolol nach Gabe verschiedener Arzneizubereitungsformen gewonnen werden. Dazu wurde in einer kontrollierten, randomisierten klinischen Studie an acht gesunde, männliche Probanden je eine konventionelle Hartkapsel, eine magensaft-resistente Kapsel und ein Suppositorium verabreicht. Jede Arzneiform enthielt neben Talinolol auch noch Paracetamol, das als Referenzsubstanz für die Bestimmung des Zeitpunktes der Wirkstoffliberation diente. Paracetamol wurde nach Gabe aller drei Arzneiformen in gleichem Umfang absorbiert. Es zeigte in jedem Fall regelmäßige Peaks und war ein zuverlässiger Indikator für die Freisetzung des Wirkstoffes aus der Arzneiform. Der Verlauf der Serumkonzentrations-Zeit-Kurven von Talinolol war insgesamt weitaus weniger regelmäßig als der von Paracetamol. Im interindividuellen Vergleich fielen insbesondere nach Gabe der magensaftstabilen Kapsel und des Suppositoriums erhebliche Schwankungen auf. Dabei sank die relative Bioverfügbarkeit nach Gabe der magensaftstabilen Kapsel auf 50%, nach Gabe des Suppositoriums sogar auf 20% des Wertes nach Einnahme einer konventionellen Hartkapsel. Die Auflösung von magensaftstabilen Zubereitungsformen erfolgt vorrangig im distalen Jejunum oder Ileum. Nach Aussage mehrerer Autoren ist hier die P-gp-Expression im Vergleich zum Duodenum deutlich erhöht. Dies könnte unserer Meinung nach die verminderte Bioverfügbarkeit des P-gp-Substrates Talinolol nach Einnahme einer magensaftresistenten Kapsel erklären. Der noch stärkere Abfall des AUC-Wertes nach Gabe eines Suppositoriums kann indes nur teilweise auf die rektale Expression von P-gp zurückgeführt werden, die zwar höher als im Duodenum, aber nicht höher als im Jejunum/Ileum ist. Hauptursache für die schlechte Absorption scheint hier die im Vergleich zu Paracetamol schlechte Löslichkeit von Talinolol zu sein, die wohl auf die Bedingungen der rektalen Zufuhr des nicht gelösten Arzneistoffes zurückzuführen ist. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Talinolol in tieferen Darmabschnitten schlechter absorbiert wird. Eine solche regioselektive Absorption wurde auch bei anderen Wirkstoffen beobachtet. Dies ist bei der Entwicklung von Arzneizubereitungsformen bedeutsam, welche den Arzneistoff in einem bestimmten Abschnitt des Magen-Darm-Traktes freisetzen sollen.
Trotz intensiver Forschungsarbeit stellt die kardiale Toxizität von Doxorubicin auch heute noch ein therapielimitierendes Problem in der chemotherapeutischen Behandlung dar und ist nur unzureichend verstanden. In früheren Studien konnte gezeigt werden, dass sowohl in vitro als auch in vivo lipidsenkende Medikamente, wie Statine oder Probucol, in Komedikation positive Auswirkungen auf diese Nebenwirkung besitzen. Der bereits 1985 erstmalig beschriebene Anstieg des Serumcholesterolsspiegels konnte darüberhinaus in eigenen Voruntersuchungen im akuten Doxorubicin-Mausmodell bestätigt werden. Gleichzeitig wurden erhöhte Spiegel oxigenierter Cholesterolderivate in Serum, Herz und Leber nachgewiesen. Vor diesem Hintergrund, wurde die Hypothese aufgestellt, dass Doxorubicin die Bildung von Oxysterolen begünstigt und somit Einfluss auf die Cholesterolhomöostase nimmt. Es ist bekannt, dass erhöhte Cholesterol- und Oxysterolspiegel die Elektrophysiologie, genauer die Kalziumhomöostase in Kardiomyozyten beeinträchtigen, was auf eine mögliche Bedeutung dieser Beobachtung für die Kardiotoxizität hinweist. In der vorliegenden Arbeit konnte diese Hypothese erhärtet werden, indem zunächst sowohl auf RNA- und Proteinebeneeine gesteigerte Expression der Cholesteroleffluxtransporter ABCA1 und ABCG1 in Kardiomyozyten aber auch eine erhöhte Aktivität gezeigt werden konnte. Ursächlich für diese Beobachtung konnte in der Folge eine verstärkte Aktivierung des nukleären Transkriptionsfaktors und Oxysterolliganden LXR unter Doxorubicinexposition identifiziert und durch die Koinkubation von Doxorubicin mit LXR-Agonisten und–Antagonist bestätigt werden. Bei der Charakterisierung verschiedener Oxysterole konnte zudem für 24(S) Hydroxy- und 7 Ketocholesterol ein dem Doxorubicin-vergleichbaren Effekt auf die Expression Karditoxizitäts-assoziierter Gene (wie Gata4, Edn1, Tgfb) festgestellt werden, insbesondere das 7-Ketocholesterol zeigte zudem auch eine ausgeprägte Toxizität im HL-1-Zellmodell. Vor diesem Hintergrund wurde ein Tierversuch durchgeführt, bei dem der Einfluss einer Vorbehandlung mit einem LXR-Agonisten zur Verminderung der zellulären Cholesterolkonzentration durch Aufregulation der genannten Effluxtransporter einen Einfluss auf die akute Doxorobicin-induzierte Kardiotoxizität besitzt. Drei Tage nach der Doxorubicingabezeigte sich dabei für die Ejektionsfraktion in den mit dem LXR-Agonisten vorbehandelten Tieren ein signifikant verbesserter Wert. Dieser Effekt konnte allerdings in der Folge nicht aufrechterhalten werden. Ein Grund hierfür könnte in der zu geringen Halbwertszeit des LXR Agonisten, da dieser mit der Doxorubicingabe abgesetzt wurde, liegen. Trotzallem weisen die Daten auf eine Kardioprotektion hin, so dass weitere Untersuchung in diesem Bereich angestrebt werden sollten.
Das MRP4(ABCC4)-Protein gehört zur ABC-Transporter-Familie und ist neben einem vielfältigen Expressionsmuster durch ein sehr breites Substratspektrum charakterisiert. Es wird in zahlreichen Geweben, beispielsweise in der Niere, im Gehirn, in Blutzellen und in vaskulären glatten Muskelzellen exprimiert. Das MRP4-Protein vermittelt den Efflux und damit auch Resistenz gegenüber einer großen Anzahl exogener Substanzen, wie z.B. Nukleosid-basierten Standardtherapeutika der antiviralen und zytostatischen Krebstherapie, aber auch den zellulären Export verschiedener endogener Signalmoleküle insbesondere von zyklischen Nukleotiden. Der Export zyklischer Nukleotide durch MRP4 gewann hinsichtlich der Beeinflussung intrazellulärer cAMP-Spiegel in jüngster Vergangenheit immer mehr an Beachtung. Während die Daten zur Expression und zum Substratspektrum von MRP4 schon recht umfangreich sind, ist bislang sehr wenig über die Regulationsmechanismen des Transporters bekannt. Im Hinblick darauf war es das zentrale Thema der vorliegenden Arbeit neue Erkenntnisse bezüglich der Regulation von MRP4 zu gewinnen. Dabei wurden insbesondere zwei Aspekte untersucht, die den Einfluss des zyklischen Nukleotids cAMP auf transkriptioneller und der Proteinkinase C (PKC) auf posttranslationaler Ebene in den Fokus stellen. Mithilfe von Reportergen-Analysen, quantitativer Real-Time PCR sowie proteinanalytischen Methoden konnte gezeigt werden, dass die MRP4-Expression durch eine langanhaltende Steigerung der intrazellulären cAMP-Konzentrationen signifikant erhöht wird. Untersuchungen zu den involvierten Signalwegen dieser Regulation deuten auf eine Beteiligung der direkt durch cAMP aktivierten EPAC-Proteine hin, die über die MEK/ERK Proteinkinasen-Kaskade zur Aktivierung der MRP4/ABCC4-Transkription führt. In der Folge resultiert ein erhöhter Efflux von cAMP und möglicherweise weiterer MRP4-Substrate. Bei dieser Art der Regulation könnte es sich um einen autoregulatorischen feedback-Mechanismus handeln. Pharmakologisch bedeutend könnte dies hinsichtlich einer Langzeittherapie mit cAMP-steigernden Arzneistoffen, beispielsweise Phosphodiesterase-Hemmstoffen oder β-Adrenozeptor-Agonisten, sein, da dieser Rückkopplungsmechanismus zu einer Toleranzentwicklung mit einer Abnahme der Wirkung beitragen kann. Ein weiterer Teil dieser Arbeit fokussierte sich auf den Einfluss der PKC auf die MRP4Expression und -Lokalisation. Anhand von Transportstudien und Immunfluoreszenzanalysen konnte eine PKC-vermittelte MRP4-Regulation gezeigt werden. Es wurde ein signifikant verringerter Substratexport mit einhergehender Abnahme des MRP4-Anteils in der Plasmamembran in verschiedenen Zellsystemen beobachtet. Dabei wurde nach Aktivierung der PKC eine vermehrte Lokalisation von MRP4 in intrazellulären Vesikeln beobachtet, deren Herkunft aufgrund von Versuchen mit einer Biotin-Markierung der Zelloberfläche der Plasmamembran zugeordnet werden konnte. Im Anschluss an die Internalisierung kam es zur Verschmelzung mit frühen Endosomen, über die durch Recycling-Prozesse der erneute Protein-Einbau in die Membran realisiert werden kann. Untersuchungen mit einer CFP-getaggten MRP4Deletionsvariante ohne die carboxy-terminale PDZ-Bindedomäne ließen auf eine Beteiligung des PDZ-Interaktionsmotivs im Rahmen der PKC-modulierten MRP4Regulation schließen. Möglicherweise kommt es über dieses Bindungsmotiv zu einer Interaktion zwischen MRP4 und möglichen Adapterproteinen, die für diesen regulatorischen Mechanismus notwendig sein könnten. Da keine Zelltyp-abhängigen Unterschiede festgestellt wurden, könnte es sich bei dieser posttranslationalen Art der MRP4-Regulation um einen ubiquitär verbreiteten Mechanismus handeln, der mittlerweile auch für bestimmte andere Transporter beobachtet wurde und in vivo auch die Aufnahme bzw. Elimination von Pharmaka beeinflussen könnte. Diese Arbeit lieferte neue Erkenntnisse zur Regulation von MRP4 auf transkriptioneller und posttranslationaler Ebene. Durch weitere Untersuchungen sollte die pharmakologische und physiologische Relevanz dieser Regulationsmechanismen noch intensiver charakterisiert werden.
Die Sepsis und der septische Schock stellen die häufigste Todesursache auf chirurgischen Intensivstationen dar. Viele Studien haben gezeigt, dass die Barriere-funktion in sekretorischen Organen, wie z. B. Leber, Gehirn und Darm, durch das septische Krankheitsbild beeinflusst wird. Wichtige Determinanten dieser Organbarrieren sind die Effluxtransporter multidrug resistance protein 1 (kodiert durch Mdr1) und das multidrug resistance-associated protein 2 (Mrp2). Sie haben großen Einfluss auf die Absorption und Verteilung sowie Ausscheidung von potentiell toxischen Xenobiotika, unter anderem auch Arzneimittel. Unser Ziel war es, mit der vorliegenden Arbeit einerseits die Expression, anderseits die Funktion der Membran-Transporter Mdr1 und Mrp2 in verschiedenen Organen mit und ohne Sepsis zu untersuchen. Des Weiteren sollte geklärt werden, inwieweit Talinolol als probe drug neben dem bereits gut charakterisierten Transport über Mdr1 auch ein Substrat für Mrp2 ist. Hierzu wurden jeweils 12 männliche Lew.1W-Ratten des Wildtyps und 12 des Mrp2-defizienten Stamms mit Talinolol vorbehandelt. Je sechs Tieren beider Rattenstämme wurde ein Röhrchen in die Darmwand implantiert (colon ascendens stent peritonitis – CASP), die Kontrolltiere wurden scheinoperiert. Nach drei Tagen wurde die Mdr1b- und Mrp2-mRNA-Expression über die real time reverse transcription- Polymerasekettenreaktion im Jejunum, Ileum, Leber, Niere, Gehirn und Hoden analysiert. Weiterhin bestimmten wir sowohl aus den oben genannten Organen als auch aus dem Blut sowie dem gesammelten Urin und Stuhl die Talinololkonzentrationen mittels high pressure liquid chromatography (HPLC) und Fluoreszenzdetektion. Septische Ratten des Wildtyps zeigten gegenüber ihrer Kontrolle eine nominal gesunkene jejunale Mdr1b-mRNA-Expression mit einer gleichzeitig um 20% verminderten Talinololausscheidung über den Stuhl als möglichen Ausdruck der gestörte Absorptionsbarriere des Darms. Weiterhin waren die Mdr1b-mRNA-Level in der Leber erhöht, jedoch ließ sich die zu erwartende Reduzierung der intrahepatische Talinololkonzentration nicht bestätigen. Die Konzentrationen von Talinolol im Gehirn sanken während der Sepsis auf fast ein Drittel der Kontrollgruppe bei unveränderter Mdr1-Expression. Mrp2 scheint hingegen keinen Einfluss auf die Talinololkinetik während der Sepsis zu haben.
Der akute Myokardinfarkt ist die häufigste Todesursache in den Industrieländern. Um die Spätfolge Herzinsuffizienz so gering wie möglich zu halten, ist eine schnelle Wiederherstellung des koronaren Blutflusses entscheidend. Dieser gewünschten Reperfusion wird jedoch eine zusätzliche Schädigung des Myokardgewebes zugeschrieben. Durch kurze Intervalle von Ischämie und Reperfusion nach Wiederöffnung des Koronargefäßes konnte die Infarktgröße drastisch gesenkt werden, so dass dieses als ischämische Postkonditionierung bezeichnete Verfahren, hohes Potential zur Reduktion der Myokardschädigung nach einem Infarkt bietet. Für den klinischen Einsatz erweist sich dieses Verfahrens jedoch als technisch aufwendig, so dass der Wunsch nach pharmakologischen Ansätzen zu Beginn der Reperfusion steigt. Die vorliegende Arbeit befasste sich daher mit der Untersuchung möglicher kardioprotektiver Substanzen und der Charakterisierung wichtiger Elemente der zugrunde liegenden Signalkaskade. Hierfür wurde in dem Modell der ex vivo perfundierten Rattenherzen die kardioprotektive Wirkung des endogenen Mediators Bradykinin während der Reperfusion und die mögliche Beteiligung des EGF-Rezeptors untersucht. In einem kardiomyozytenbasierten Zellmodell, bei dem HL-1-Zellen mit den Kalziumionophor Calcimycin gestresst wurden, sollte die Beteiligung wichtiger Signalelemente bestätigt werden. Zur Charakterisierung der Rolle der Adenosinrezeptoren während der Reperfusion wurde ein in vivo Maus Modell etabliert, welches die Untersuchung der Infarktgröße im Tier erlaubt. Hierfür wurden selektive Adenosinrezeptoragonisten und -antagonisten sowie CD73-/- Mäuse, die kein endogenes Adenosin durch die 5’-Ektonukleotidase (CD73) bilden können, verwendet. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Bradykinin während der Reperfusion zu einer signifikanten Reduktion der Infarktgröße führt und dass dieser Schutzmechanismus von einer Transaktivierung des EGF-Rezeptors und der survival Kinase Akt abhängig ist. Des Weiteren konnte sowohl bei den Infarktgrößen als auch im zellbasierten Modell eine Beteiligung der MMP-8 bei der Transaktivierung des EGF-Rezeptors nachgewiesen werden. Anhand des in vivo Maus Modells konnte gezeigt werden, dass der durch die ischämische Postkonditionierung vermittelte Myokardschutz durch den selektiven A2bAR Antagonisten MRS1754 aufgehoben werden konnte und dass eine Aktivierung des A2bAR durch den selektiven A2bAR Agonisten BAY60-6583 während der Reperfusion zu einer Senkung der Infarktgröße führt. Des Weiteren konnte mit Hilfe der CD73-/- Mäuse und unter Verwendung von selektiven Adenosinrezeptoragonisten und -antagonisten gezeigt werden, dass bei fehlendem extrazellulärem Adenosin kein Schutz durch eine ischämische Postkonditionierung, dem selektiven A2bAR Agonisten BAY60-6583 oder dem A2aAR Agonisten CGS21680 erzielt werden kann, sondern dass nur die gleichzeitige Aktivierung von A2aAR und A2bAR zum Schutz des Herzens vor Reperfusionsschäden führt. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen mögliche Ansätze für pharmakologische Interventionen zur Behandlung des akuten Myokardinfarkts auf. Die Verwendung von Agonisten zur Aktivierung von G-Protein gekoppelten Rezeptoren rückt damit immer mehr in den Vordergrund für mögliche klinische Ansatzpunkte.
The multidrug resistance protein 4 (MRP4) is highly expressed in platelets and several lines of evidence point to an impact on platelet function. MRP4 represents a transporter for cyclic nucleotides as well as for certain lipid mediators. The aim of the present study was to comprehensively characterize the effect of a short-time specific pharmacological inhibition of MRP4 on signaling pathways in platelets. Transport assays in isolated membrane vesicles showed a concentrationdependent inhibition of MRP4-mediated transport of cyclic nucleotides, thromboxane (Tx)B2 and fluorescein (FITC)- labeled sphingosine-1-phosphate (S1P) by the selective MRP4 inhibitor Ceefourin-1. In ex vivo aggregometry studies in human platelets, Ceefourin-1 significantly inhibited platelet aggregation by about 30-50% when ADP or collagen was used as activating agents, respectively. Ceefourin-1 significantly lowered the ADP-induced activation of integrin aIIbb3, indicated by binding of FITC-fibrinogen (about 50% reduction at 50 mM Ceefourin-1), and reduced calcium influx. Furthermore, pre-incubation with Ceefourin-1 significantly increased PGE1- and cinaciguat-induced vasodilatorstimulated phosphoprotein (VASP) phosphorylation, indicating increased cytosolic cAMP as well as cGMP concentrations, respectively. The release of TxB2 from activated human platelets was also attenuated. Finally, selective MRP4 inhibition significantly reduced both the total area covered by thrombi and the average thrombus size by about 40% in a flow chamber model. In conclusion, selective MRP4 inhibition causes reduced platelet adhesion and thrombus formation under flow conditions. This finding is mechanistically supported by inhibition of integrin aIIbb3 activation, elevated VASP phosphorylation and reduced calcium influx, based on inhibited cyclic nucleotide and thromboxane transport as well as possible further mechanisms.
The multifunctional sphingosine-1-phosphate (S1P) is a lipid signaling molecule and central
regulator in the development of several cancer types. In recent years, intriguing information has
become available regarding the role of S1P in the progression of Glioblastoma multiforme (GBM),
the most aggressive and common brain tumor in adults. S1P modulates numerous cellular processes
in GBM, such as oncogenesis, proliferation and survival, invasion, migration, metastasis and stem cell
behavior. These processes are regulated via a family of five G-protein-coupled S1P receptors (S1PR1-5)
and may involve mainly unknown intracellular targets. Distinct expression patterns and multiple
intracellular signaling pathways of each S1PR subtype enable S1P to exert its pleiotropic cellular
actions. Several studies have demonstrated alterations in S1P levels, the involvement of S1PRs
and S1P metabolizing enzymes in GBM pathophysiology. While the tumorigenic actions of S1P
involve the activation of several kinases and transcription factors, the specific G-protein (Gi, Gq,
and G12/13)-coupled signaling pathways and downstream mediated effects in GBM remain to be
elucidated in detail. This review summarizes the recent findings concerning the role of S1P and its
receptors in GBM. We further highlight the current insights into the signaling pathways considered
fundamental for regulating the cellular processes in GMB and ultimately patient prognosis.
Background: Recently, the expression of proteinase-activated receptor 2 (PAR2) has been
shown to be essential for activin receptor-like kinase 5 (ALK5)/SMAD-mediated signaling and cell
migration by transforming growth factor (TGF)-β1. However, it is not known whether activation
of non-SMAD TGF-β signaling (e.g., RAS–RAF–MEK–extracellular signal-regulated kinase (ERK)
signaling) is required for cell migration and whether it is also dependent on PAR2. Methods: RNA
interference was used to deplete cells of PAR2, followed by xCELLigence technology to measure
cell migration, phospho-immunoblotting to assess ERK1/2 activation, and co-immunoprecipitation
to detect a PAR2–ALK5 physical interaction. Results: Inhibition of ERK signaling with the MEK
inhibitor U0126 blunted the ability of TGF-β1 to induce migration in pancreatic cancer Panc1 cells.
ERK activation in response to PAR2 agonistic peptide (PAR2–AP) was strong and rapid, while it was
moderate and delayed in response to TGF-β1. Basal and TGF-β1-dependent ERK, but not SMAD
activation, was blocked by U0126 in Panc1 and other cell types indicating that ERK activation is
downstream or independent of SMAD signaling. Moreover, cellular depletion of PAR2 in HaCaT
cells strongly inhibited TGF-β1-induced ERK activation, while the biased PAR2 agonist GB88 at 10
and 100 µM potentiated TGF-β1-dependent ERK activation and cell migration. Finally, we provide
evidence for a physical interaction between PAR2 and ALK5. Our data show that both PAR2–APand TGF-β1-induced cell migration depend on ERK activation, that PAR2 expression is crucial for
TGF-β1-induced ERK activation, and that the functional cooperation of PAR2 and TGF-β1 involves a
physical interaction between PAR2 and ALK5
The role of uptake and efflux transporters in the pharmacokinetics of ß1-receptor blocker talinolol
(2016)
Introduction: The β1-adrenergic receptor antagonist talinolol is a probe drug for P-glycoprotein (P-gp). It is absorbed erratically and incompletely from the gastrointestinal tract. However, its pharmacokinetics might also be influenced by further uptake and efflux transporters as concluded from interaction studies with naringin and verapamil in human. Additionally, the transcellular transport through the different tissues, including enterocytes, hepatocytes and kidney tubular cells, is not completely understood so far. Therefore, we aimed to measure the affinity of talinolol to drug transporting proteins (OCT1-3, PEPT1, OCTN2, ASBT, NTCP, MRP 1-3 and P-gp as well as OATP 1B1, 1B3, 2B1 and 1A2) and some of their genetic variants known to be of pharmacokinetic relevance (OATP1A2 *2 and*3 as well as OATP2B1 V201M, R312Q and S486F). In a further step, we retrospectively evaluated the impact of clinically relevant genetic polymorphisms of transporters on the pharmacokinetics of talinolol in healthy subjects. Materials and Methods: Time and concentration-dependent uptake assays with [3H]-talinolol were performed either in stable transfected HEK293 or MDCKII cells expressing OATP1A2 *1, *2 and *3, OATP1B1, OATP1B3, OATP2B1 (and its genetic variants p.V201M, p.R312Q and p.S486F), NTCP, ASBT, PEPT1, OCTN2, OCT 1-3 and the respective vector control or in inside-out lipovesicles expressing the efflux transporters MRP1-3 and P-gp. Talinolol was quantified by liquid scintillation counting. The transport rates were then corrected by the transporter proteomics measured in the cellular membrane. Regarding the pharmacogenomic evaluation, it was carried out retrospectively in 39 healthy subjects who had participated in former pharmacokinetic studies with talinolol. This evaluation included a variety of transporter related genetic variants, known to be of a clinical meaning for their substrates. Results: Among the uptake transporters, talinolol was shown to be a substrate of OATP1B3 (Km= 153 ± 137 μmol/l; Vmax= 168 ± 30.3 μmol/mgxmin), OATP1B1 (Km= 301 ± 133 μmol/l; Vmax= 1135 ± 348 μmol/mgxmin), OATP2B1 (Km= 459 ± 260 μmol/l; Vmax= 4.32 ± 1.33 μmol/mgxmin), OATP1A2 (Km= 477 ± 158 μmol/l; Vmax= 0.61 ± 0.1 μmol/mgxmin) and NTCP (Km= 2560 ± 781 μmol/l; Vmax= 15944 ± 3741 μmol/mgxmin) but not a substrate of OCT1-3, OCTN2, PEPT1 or ASBT. When it comes to the efflux transporters, talinolol was transported by both P-gp (Km = 175 ± 206 mol/l; Vmax = 14 ± 10.8 nmol/mgxmin) and MRP3 (Km= 86.8 ± 62.8 μmol/l; Vmax= 133 ± 51.5 μmol/mgxmin) but not by MRP2. The pharmacogenomic analysis supported the in-vitro results, as it showed a significant decrease in talinolol absorption (AUC and Cmax) in subjects with the loss of function variant MRP3 211C>T and in those with a decreased P-gp function due to having less than 5 T-allels in the haplotype P-gp 1236-2677-3435-TTT. No significant changes were found associated with other transporters’ genetic variants. Conclusion: Our in-vitro results suggested the vectorial transport of talinolol through the enterocytes to consist mainly of apical OATP2B1 and P-gp and basolateral MRP3. Additionally in the hepatocytes, apical OATP1B1, OATP1B3 and NTCP seem to be involved as well. This vectorial transport was demonstrated in-vivo for the first time by our pharmacogenomic analysis, where talinolol absorption was significantly influenced by both P-gp and MRP3 genetic variants.
Previous studies have reported the fundamental role of immunoregulatory
proteins in the clinical phenotype and outcome of sepsis. This study investigated two functional single
nucleotide polymorphisms (SNPs) of T cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3
(TIM-3), which has a negative stimulatory function in the T cell immune response. Methods: Patients
with sepsis (n = 712) were prospectively enrolled from three intensive care units (ICUs) at the University
Medical Center Goettingen since 2012. All patients were genotyped for the TIM-3 SNPs rs1036199 and
rs10515746. The primary outcome was 28-day mortality. Disease severity and microbiological findings
were secondary endpoints. Results: Kaplan–Meier survival analysis demonstrated a significantly
lower 28-day mortality for TIM-3 rs1036199 AA homozygous patients compared to C-allele carriers
(18% vs. 27%, p = 0.0099) and TIM-3 rs10515746 CC homozygous patients compared to A-allele
carriers (18% vs. 26%, p = 0.0202). The TIM-3 rs1036199 AA genotype and rs10515746 CC genotype
remained significant predictors for 28-day mortality in the multivariate Cox regression analysis after
adjustment for relevant confounders (adjusted hazard ratios: 0.67 and 0.70). Additionally, patients
carrying the rs1036199 AA genotype presented more Gram-positive and Staphylococcus epidermidis
infections, and rs10515746 CC homozygotes presented more Staphylococcus epidermidis infections.
Conclusion: The studied TIM-3 genetic variants are associated with altered 28-day mortality and
susceptibility to Gram-positive infections in sepsis.
Im proximalen Nierentubulus ist SLC2A9 ein bedeutender Bestandteil des „Harnsäure-Transportosoms“, welches ein funktionelles Netzwerk von Aufnahme- und Effluxtransportern der Harnsäure darstellt. Unter diesen sind auch bekannte Arzneimitteltransporter, die zu den Transporter-Familien SLC22A und SLC17A sowie der ATP-abhängigen ABCTransporter-Familie ABC gehören. Ebenso ist SLC2A9 Bestandteil dieses Transporter-Netzwerkes. Es ist wenig darüber bekannt, wie der transzelluläre Transport der Harnsäure koordiniert wird. Ein möglicher Mechanismus wäre die koordinierte transkriptionelle Regulation der Transporter-Expression über einen gemeinsamen Transkriptionsfaktor bzw. Modulator. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Regulation der Genexpression von SLC2A9, einem Faktor der Harnsäure-Homöostase, zu charakterisieren. Außerdem sollte überprüft werden, ob sich unter den identifizierten SLC2A9-regulierenden Transkriptionsfaktoren solche befinden, die auch als Modulatoren des „Harnsäure-Transportosoms“ in Frage kämen.
Oral Squamous Cell Carcinoma (OSCC) is the most common malignant cancer affecting the oral cavity. It is characterized by high morbidity and very few therapeutic options. Angiotensin (Ang)-(1-7) is a biologically active heptapeptide, generated predominantly from AngII (Ang-(1-8)) by the enzymatic activity of angiotensin-converting enzyme 2 (ACE 2). Previous studies have shown that Ang-(1-7) counterbalances AngII pro-tumorigenic actions in different pathophysiological settings, exhibiting antiproliferative and anti-angiogenic properties in cancer cells. However, the prevailing effects of Ang-(1-7) in the oral epithelium have not been established in vivo. Here, we used an inducible oral-specific mouse model, where the expression of a tamoxifen-inducible Cre recombinase (CreERtam), which is under the control of the cytokeratin 14 promoter (K14-CreERtam), induces the expression of the K-ras oncogenic variant KrasG12D (LSLK-rasG12D). These mice develop highly proliferative squamous papilloma in the oral cavity and hyperplasia exclusively in oral mucosa within one month after tamoxifen treatment. Ang-(1-7) treated mice showed a reduced papilloma development accompanied by a significant reduction in cell proliferation and a decrease in pS6 positivity, the most downstream target of the PI3K/Akt/mTOR signaling route in oral papilloma. These results suggest that Ang-(1-7) may be a novel therapeutic target for OSCC.