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Immunogenität von Hautkrebszellen und dem Modellprotein Ovalbumin nach einer Kaltplasma-Behandlung
(2021)
Eine Behandlung von Tumoren mit physikalischem Kaltplasma zeigt eine erhöhte Toxizität und ein reduziertes Tumorwachstum. Zeitgleich werden während einer Behandlung mit Plasma eine Vielzahl an reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffspezies (RONS) generiert, welche Immunzellen stimulieren können. Viele neue Therapieansätze bestreben nicht nur eine Tumortoxizität, sondern auch eine Förderung der körpereigenen, da diese häufig durch Mechanismen der Tumorzellen unterdrückt wird. Zu solchen Therapien zählen checkpoint inhibitoren, Vakzinierungen oder ein adaptiver Zelltransfer mit transgenen oder vor-stimulierten Zellen. Die dadurch geförderte Antitumor-Immunantwort basiert grundlegend auf einem mehrphasigen Prozess. Dieser beginnt mit einer Antigen-unspezifischen frühen Phase, in der das innate Immunsystem aktiviert wird und zu einer Vermehrung und Differenzierung von Antigen-spezifischen CD4+ und CD8+ T-Zellen führt. Da während einer Entzündungsreaktion viele RONS gebildet werden, um Fremdkörper zu eliminieren und Immunzellen zu rekrutieren, ist eine Therapie mit RONS naheliegend. Durch die Anwendung von Kaltplasma können die gebildeten RONS zum Entzündungsgeschehen beitragen und Zellen des innaten und adaptiven Immunsystems stimulieren. Eine veränderte Immunogenität von Tumorzellen sowie eine daraus resultierende direkte Aktivierung von Immunzellen im Kontext einer Antitumor-Immunantwort wurden nach einer Behandlung mit Jet-Plasmen bislang nicht untersucht.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Kaltplasma-Behandlung von Hautkrebszellen und eines Modellantigens unter Berücksichtigung einer Antitumor-Immunantwort durch natürliche Killerzellen des innaten Immunsystems sowie adaptive Immunzellen in vitro und in vivo untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass eine Behandlung mit Kaltplasma zu einer erhöhten Tumortoxizität führt und das Repertoire der Oberflächenmoleküle auf Tumorzellen verändert. In vivo wurde eine vermehrte Infiltration von Immunzellen in das Tumormikromilieu beobachtet, welche mit einer erhöhten Aktivierung von Lymphozyten und Konzentrationen immunstimulatorischer Zytokine einherging. Durch die zeitgleich reduzierten Tumorgrößen, ist eine durch Immunzellen vermittelte Tumortoxizität als Erklärung naheliegend. In zwei Vakzinierungsstudien konnte die Immunogenität von Plasma-behandelter Tumorzellen und einem Tumorassoziierten Modellantigen bestätigt werden.
There has been a substantial evolution of anti-cancer therapies in the last decade, leading
to improved prognosis and disease-free survival of patients with melanoma. Due to the
number of patients that still develop resistance or to the high systemic toxicity and side
effects, new treatment options are still needed. Regardless of the type of therapeutic
interventions (except surgery), the reactive oxygen species (ROS) are a by-product or
contribute to the action mechanism of many successful therapies. In this context, medical
cold atmospheric plasma (CAP) arises as a promising tool, and studies are important to
prove the effectiveness of this new device.
Since combination therapies are the current standard way to treat melanoma, we explored
candidates to be combined with cold atmospheric plasma, with potential to become a
therapeutic option in the combination. Here, we tested the radiotherapy and clinically safe
mitochondrial inhibitor drugs. In the end of the study, both, ionizing radiation and four
mitochondrial-targeted-drugs showed to be promising candidates for the combination with
CAP. These combinations induced increased cytotoxicity and modulated the immune
system improving the anti-tumor immune response. Mitochondrial damage seems to be
the first stage to induce cellular deficiency and culminate in apoptotic cell death.
Furthermore the release of GM-CSF contribute to a pro inflammatory state and immune
system activation.
This dissertation showed that CAP serves as an excellent tool to boost melanoma cell
death and induce anti-tumor response. In addition, in our proposed therapeutic
combination, the intensity of plasma treatment could be decreased possibly resulting in
less systemic toxicity. Our results serves as model to be studied in other tumor entities.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Reaktion primärer dermaler Fibroblasten, die für die Versuche aus SKH1-Mäusen isoliert wurden, auf eine Kaltplasma-Behandlung mittels des Argon-betriebenen Plasmajets „kINPen MED“ hinsichtlich ihrer Reaktion auf oxidativen Stress, ihrer interzellulären Kommunikation über Gap Junctions (GJ) und der Organisation ihres Aktin-Zytoskeletts untersucht werden. Die Plasmabehandlung erfolgte dabei stets indirekt, also durch die Behandlung von Zellkulturmedium, in dem die Zellen anschließend inkubiert wurden. Es ergab sich für die angewendeten Versuchsmodalitäten keine signifikante Induktion von Apoptose durch die indirekte Plasmabehandlung von 20 s bis 180 s, wohingegen die metabolische Aktivität der Zellen bei längeren Behandlungszeiten bis 72 h nach der Plasmabehandlung signifikant reduziert wurde. Dies zeigt die von der Behandlungszeit abhängige Beanspruchung der Fibroblasten durch die Plasmabehandlung und gleichzeitig ihre Kompensationsfähigkeit, die die Zellen auch bei 180 s Behandlungszeit vor dem vermehrten Auftreten von Apoptose schützen konnte.
Nach einer Plasmabehandlung konnte die Aktivierung des Nrf2-Signalwegs nachgewiesen werden, der als zellulärer Schutzmechanismus gegen oxidativen Stress fungiert. So wurde sowohl in den Fibroblasten als auch im Primärgewebe eine Translozierung des Nrf2 in den Zellkern gezeigt. Hierbei wurde auch die Aktivierung des Redox-Sensors Keap1 nachgewiesen, der unter physiologischen Bedingungen Nrf2 bindet und dessen Abbau im Proteasom vermittelt.
Ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit lag in der Untersuchung der Zell-Zell-Kommunikation, die vor allem über funktionale GJ-Kanäle erfolgt. Dabei wurde in einem SLDT Assay die Zunahme funktionaler GJ-Kanäle in plasmabehandelten Fibroblasten festgestellt. Außerdem ergab sich eine Tendenz zum Anstieg der Gen- und Proteinexpression von Connexin 43, was unter physiologischen Bedingungen in dermalen Fibroblasten während der Frühphase der Wundheilung beschrieben wurde.
Die Plasmabehandlungen induzierten außerdem strukturelle Veränderungen am Aktin-Zytoskelett in den dermalen Fibroblasten. Solche dynamischen Veränderungen des Zytoskeletts sind während der Wundheilung ebenfalls von entscheidender Bedeutung, da sie die interzelluläre Adhäsion und damit die Migration von Fibroblasten ermöglichen.
Die hier beobachteten Veränderungen zeigten sich vor allem bei kürzeren Behandlungs- und Inkubationszeiten, während gleichzeitig keine signifikante Zunahme apoptotischer Zellen festgestellt wurde. Dies legt nahe, dass durch kurze Plasmabehandlungszeiten in primären Fibroblasten ein Hormesis-Effekt induziert wird, also dass die zeitlich begrenzte Aktivierung zellulärer Schutzmechanismen als Reaktion auf den Stress einer Plasmabehandlung (Radikalbildung, UV-Strahlung) günstige, die Wundheilung fördernde Effekte bewirkt.
Das Nierenzellkarzinom (NZK) gehört zu den häufigsten malignen Erkrankungen in Deutschland. Während lokal begrenzte Tumoren nach chirurgischer Resektion eine sehr gute Prognose haben, liegt die mittlere 5-Jahres-Überlebensrate bei metastasierten NZK bei lediglich 17 %. Die schlechte Prognose ist unter anderem auf die Resistenz von NZK gegenüber klassischen Chemotherapeutika zurückzuführen. Moderne zielgerichtete Wirk-stoffe zeigen ein etwas besseres Ansprechen, allerdings werden komplette Remissionen nur in den seltensten Fällen beobachtet. Dies macht die Entwicklung neuer Behandlungs-methoden erforderlich.
Der Einsatz kalter atmosphärischer Plasmen (CAP) ist eine innovative und vielverspre-chende Therapieoption bei der Behandlung von Malignomen. Diverse Arbeiten zeigten eine antiproliferative Wirkung auf Krebszelllinien verschiedener Entitäten. Die Wirkung von CAP auf NZK-Zellen wurde bisher nicht untersucht und ist Gegenstand dieser Arbeit.
Wir konnten zeigen, dass CAP die Proliferation von humanen NZK-Zellen effektiv hemmt. Dies war einerseits auf die Induktion von Apoptose und andererseits auf eine Reduktion der Zellteilungsrate zurückzuführen. Neben der Wachstumshemmung konnten wir auch eine herabgesetzte Migrations- und Invasionsfähigkeit der Zellen nach CAP-Behandlung beobachten. Außerdem konnten wir zeigten, dass CAP zu einer Schädigung der Cyto-plasmamembran führt. Darüber hinaus wurde die Expression von Resistenzfaktoren durch eine CAP-Behandlung beeinflusst.
Diese in-vitro gewonnenen Erkenntnisse zeigen, dass CAP das Potential hat, die beste-henden Therapieoptionen bei NZK zu erweitern bzw. zu ergänzen.