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The introduction of two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2-D PAGE) enabled the separation and visualization of a substantial fraction of an organism’s entire proteome, and when mass spectrometry entered protein science, these proteins became even amenable to identification on a grand scale. Nevertheless, important classes of proteins elude a separation on classical 2 D gels, as the ones showing extremes in isoelectric point or molecular weight, and foremost very hydrophobic proteins naturally embedded in lipid membranes. This thesis aimed at the establishment and adaptation of alternatives to 2-D PAGE. New techniques allowing for an identification and quantification of critical protein classes were designed and adopted to physiological questions in the Gram-positive bacteria Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus. In a comprehensive study on cytoplasmic proteins of S. aureus COL the number of proteins identified by a 2-D gel based approach could be extended by 650 proteins employing gel free technologies. Application of these complementary methods resulted in the establishment of a comprehensive reference map of the cytosolic proteome in growing and non-growing S. aureus cells which can serve as basis for further physiological investigations. Gel free separation of complex protein digests was likewise used in a quantitative study on heat stress in B. subtilis. By implementation of the iTRAQ® technology four different physiological states could be relatively quantified in one experiment. A parallel generation of 2-D gel based data enabled the depiction of strengths and weaknesses of protein quantitation by both, spot intensities on 2-D gels and iTRAQ® signal intensities in MS/MS spectra. Furthermore, new insights into heat sensitivity of pivotal enzymes involved in amino acid biosynthesis could be delivered. The institution of gel free approaches and advancements in 2-D PAGE provide the tools to penetrate into yet unamenable scopes of proteomes. A review on proteome coverage in B. subtilis gives an overview on the strategies which have been explored for most comprehensive protein identification in various sub-proteomes. Although more than one third of B. subtilis’ open reading frames could be demonstrated on protein level, one has to be aware of the fact that it still is a long way to achieve complete coverage of its proteome. Integral membrane proteins make up about one quarter of the entirety of proteins in a cell. Despite their large portion they are clearly understudied due to the intricacy of identification. Their low abundance and non-accessibility of membrane-spanning domains represent major experimental difficulties. The establishment of a protocol efficiently depleting cytosolic proteins by membrane shaving and targeting trans-membrane peptides by novel digestion strategies essentially facilitated identification of highly hydrophobic integral membrane proteins. This protocol was not only successfully applied to the membrane proteome of growing S. aureus cells, but was shown to be applicable in B. subtilis as well. Both studies displayed the novel membrane shaving approach to be highly complementary to a previously established separation of membrane proteins via 1 D PAGE. A combination of the two techniques resulted in identification of about half of the theoretical membrane proteome in both bacteria, and hence layed the foundation for advanced and quantitative analyses. In this regard, 14N/15N metabolically labeled membrane samples of growing and non-growing cells of S. aureus COL were relatively quantified revealing a significant difference in amount for more than one third of the proteins. A corresponding experimental setup was used to compare the membrane proteomes of S. aureus SA113 and its mutant deficient in the lysylphosphatidylglycerol synthetase MprF. Interesting quantitative differences were obtained for proteins most likely involved in the regulation of cellular surface net charge as well as for virulence-associated proteins.
In dieser Arbeit wurden Experimente an einem DC-Magnetron-Beschichtungsplasma zur (reaktiven) Abscheidung von Ti, TiNx und TiOx-Schichten durchgeführt. Das Ziel war es, durch Korrelation von Messungen des Ionen- und des Energieeinstroms auf das Substrat während des Beschichtungsvorgangs mit Analysen der abgeschiedenen Schichten Aussagen über die Zusammenhänge von Abscheidebedingungen und Schichteigenschaften zu treffen. Von besonderem Interesse waren hierbei die Unterschiede zwischen den beiden Betriebsmodi des eingesetzten Magnetrons (balanced mode und unbalanced mode), da sich über diesen Parameter der Ioneneinstrom auf das Substrat signifikant beeinflussen lässt, sowie der Einfluss hochenergetischer negativ geladener Ionen, die beim Einsatz von Sauerstoff im Gegensatz zu dem von Stickstoff als Reaktivgas auftreten. Die Maxima der mittels energieaufgelöster Massenspektrometrie gemessenen Energieverteilungen aller Ionenspezies liegen im unbalanced mode im Vergleich zum balanced mode bei um etwa 0,2...1 eV höherer Energie. Der im Wesentlichen von den einfach positiv geladenen Argonionen und bei hohem Reaktivgasfluss den molekularen Reaktivgasionen getragene Gesamtioneneinstrom auf das Substrat ist im unbalanced mode deutlich höher als im balanced mode. Der mit Hilfe einer Thermosonde gemessene Energieeinstrom auf das Substrat steigt linear mit der Entladungsleistung an. Im unbalanced mode ist er, bedingt durch den höheren Gesamtioneneinstrom auf das Substrat und die größere mittlere Energie aller Ionenspezies, um mehr als eine Größenordnung höher als im balanced mode. Eine Abhängigkeit des Energieeinstroms vom Reaktivgasfluss wurde nicht beobachtet. Die röntgenreflektometrisch gemessenen Beschichtungsraten steigen über der Entladungsleistung linear an und sind im unbalanced mode trotz geringerer Sputterraten am Target um ca. 10...20 % höher als im balanced mode. Die Begründung hierfür liefert der im unbalanced mode deutlich höhere Energieeinstrom auf das Substrat. Durch diesen erhöhten Energieeintrag in die aufwachsenden Schichten steht im unbalanced mode mehr Energie für Prozesse an der Oberfläche, wie die Oberflächendiffusion, zur Verfügung. Die somit verbesserte laterale Mobilität der Teilchen an der Oberfläche führt dazu, dass diese besser in die wachsende Kristallstruktur eingebaut werden können. Damit ergibt sich letztendlich im unbalanced mode trotz des geringeren Teilcheneinstroms in allen untersuchten Plasmen eine höhere Abscheiderate von Titan auf dem Substrat. Der Energieeinstrom auf das Substrat ist demnach durch seinen signifikanten Einfluss auf die laterale Mobilität der aufwachsenden Teilchen ein bestimmender Parameter für das Schichtwachstum. Die durch die Beimischung von Reaktivgas zum Plasma auftretende Targetnitrierung bzw. –oxidation verursacht ein deutliches Absinken der Sputterraten am Target und damit der Beschichtungsraten über dem Reaktivgasfluss. Messungen der chemischen Zusammensetzungen der Schichten mittels Röntgenphotoelektronenspektroskopie zeigen, dass die Menge des in die Schichten eingebauten Reaktivgases über dessen Konzentration im Beschichtungsplasma zu kontrollieren ist. Im Argon-Stickstoff-Plasma sind die Werte der aus den röntgenreflektometrisch erhaltenen Dichten bei den im unbalanced mode abgeschiedenen Schichten deutlich höher als bei den im balanced mode abgeschiedenen. Untersuchungen mittels Röntgendiffraktometrie zeigen für diese Schichten auch höhere makroskopische Spannungen. Offenbar führt der größere Energieeinstrom hier zu lokalen Temperaturunterschieden, aus denen aufgrund unterschiedlicher Ausdehnungskoeffizienten von Schicht und Substrat beim Abkühlen makroskopische Schichtspannungen resultieren. Insgesamt werden im Argon-Stickstoff-Plasma im unbalanced mode des Magnetrons kompaktere Schichten mit weniger Lücken abgeschieden als unter denselben Bedingungen im balanced mode. Im Argon-Sauerstoff-Plasma wird dieser positive Effekt des höheren Energieeintrags in die aufwachsenden Schichten durch den im unbalanced mode deutlich höheren Beschuss des Substrats mit hochenergetischen negativ geladenen Sauerstoffionen mehr als aufgehoben. Dadurch kommt es in diesem Betriebsmodus des Magnetrons zu einer erhöhten Lückenbildung in den aufwachsenden Schichten, die somit geringere makroskopische Spannungen und geringere mittlere Dichten aufweisen als die im balanced mode abgeschiedenen. Die Summe dieser Ergebnisse zeigt, dass die Eigenschaften der im hier untersuchten DC-Magnetronplasma abgeschiedenen Schichten maßgeblich von der Zusammensetzung des Beschichtungsplasmas und insbesondere von der Art und der Energie der auf das Substrat auftreffenden Ionen abhängen.
Trotz aller Fortschritte der modernen Medizin ist die Letalität der Sepsis nahezu unverändert hoch. Immer noch handelt es sich um die häufigste Todesursache bei Patienten auf operativen Intensivstationen. Als ein kardinaler Mechanismus für die Entwicklung des Multiorganversagens gilt die Störung der intestinalen Mikrozirkulation. In dieser Arbeit konnten wir zeigen, dass GLN zu einer signifikanten Verbesserung der intestinalen Mikrozirkulation unter experimenteller Endotoxinämie führt. So konnten wir eine signifikante Verbesserung der funktionellen Kapillardichte (FCD) im Stratum circulare und Stratum longitudinale der Tunica muscularis sowie in der Tunica mucosa durch GLN nachweisen. Außerdem konnten wir zeigen, dass GLN eine Verminderung der Leukozyten-Endothelzell-Interaktion bewirkt. Die Zahl der permanent adhärenten Leukozyten war in den mit GLN behandelten Gruppen deutlich geringer als in der LPS-Gruppe. Einen Einfluss auf die Plasmaspiegel des Tumor Nekrose Faktors α (TNFα) und der Interleukine-1β, -6, -10 fanden wir nicht. Im Bereich der Makrozirkulation war unter GLN-Therapie eine signifikant geringere Herzfrequenz zu messen, als in der LPS-Gruppe. Die Differenzen im Bereich des mittleren arteriellen Druckes waren statistisch nicht signifikant. Darüber hinaus haben wir nachgewiesen, dass GLN der Entstehung einer Hyperthermie deutlich entgegenwirkt. Die Temperaturen der Tiere in den mit GLN behandelten Gruppen unterschieden sich kaum von den Kontrolltieren, aber signifikant von denen der LPS-Gruppe. Auch die Laktatspiegel und die Hypokapnie waren in den Glutamin Gruppen deutlich geringer ausgeprägt als in der LPS-Gruppe. Dahingegen konnten wir im Bereich des pH-Wertes, der Bikarbonatkonzentration und des arteriellen Sauerstoffpartialdruckes keine signifikanten Unterschiede ermitteln. Die hier geschilderten positiven Effekte des Glutamins waren sowohl im pre-, als auch im post-treatment Teil des Versuchs zu finden. Die hier gewonnenen Daten entstammen einem Tiermodell. Daher ist eine direkte Übertragung der Befunde auf den Menschen nicht gerechtfertigt. Aufgrund der entscheidenden Rolle, die das Intestinum in der Pathogenese der Sepsis spielt, können diese Ergebnisse allerdings von klinischer Bedeutung sein und es sollten sich klinische Studien mit GLN anschließen.
We present classical and hybrid modeling approaches for genetic regulatory networks focusing on promoter analysis for negatively and positively autoregulated networks. The main aim of this thesis is to introduce an alternative mathematical approach to model gene regulatory networks based on piecewise deterministic Markov processes (PDMP). During somitogenesis, a process describing the early segmentation in vertebrates, molecular oscillators play a crucial role as part of a segmentation clock. In mice, these oscillators are called Hes1 and Hes7 and are commonly modeled by a system of two delay differential equations including a Hill function, which describes gene repression by their own gene products. The Hill coefficient, which is a measure of nonlinearity of the binding processes in the promoter, is assumed to be equal to two, based on the fact that Hes1 and Hes7 form dimers.However, by standard arguments applied to binding analysis, we show that a higher Hill coefficient is reasonable. This leads to results different from those in literature which requires a more sophisticated model. For the Hes7 oscillator we present a system of ordinary differential equations including a Michaelis-Menten term describing a nonlinear degradation of the proteins by the ubiquitinpathway. As demonstrated by the Hes1 and Hes7 oscillator, promoter behavior can have strong influence on the dynamical behavior of genetic networks. Since purely deterministic systems cannot reveal phenomenons caused by the inherent random fluctuations, we propose a novel approach based on PDMPs. Such models allow to model binding processes of transcription factors to binding sites in a promoter as random processes, where all other processes like synthesis, degradation or dimerization of the gene products are modeled in deterministic manner. We present and discuss a simulation algorithm for PDMPs and apply it to three types of genetic networks: an unregulated gene, a toggle switch, and a positively autoregulated network. The different regulation characteristics are analyzed and compared by numerical means. Furthermore, we determine analytical solutions of the stationary distributions of one negatively, and three positively autoregulated networks. Based on these results, we analyze attenuation of noise in a negative feedback loop, and the question of graded or binary response in autocatalytic networks.