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Im klinischen Alltag werden im Rahmen der Übergabe zwischen Notarzt und Klinik nach Verkehrsunfällen immer wieder technische Parameter vom Unfallort genannt. Ob diese Informationen zur verbesserten Einschätzung der Verletzungsschwere nützen, ist bisher nicht ausreichend untersucht worden. Um dieser Frage nachzugehen, wurden Daten von 100 realen Fällen aus der Datenbank der Unfallforschung Greifswald in einem mehrstufigen Experiment erfahrenen Notärzten in Fragebogenform präsentiert. Dabei wurden zunächst einfache Routineparameter, dann erweiterte Parameter und schließlich Fotos der Unfälle dargeboten. Gefordert war eine Einschätzung der Verletzungsschwere eines beteiligten PKW-Fahrers in den vier am ISS-Wert orientierten Kategorien „leicht verletzt“, „schwer verletzt“, „lebensgefährlich verletzt“ und „tot“. Zur Auswertung erfolgte eine Dichotomisierung in „leicht und schwer verletzt“ (ISS≤15) versus „lebensgefährlich verletzt und tot“ (ISS 16-75). Berechnet wurden die Übereinstimmung der Teilnehmer im Hinblick auf die Verletzungsschwere jenseits des Zufalls (kappa-Statistik) sowie die diagnostische Testgüte (Sensitivität, Spezifität, Fläche unter der ROC-Kurve, Likelihood Ratios) technischer Unfallparameter. Die Beobachter-Übereinstimmung der Verletzungsschwere unter Kenntnis einfacher oder erweiterter technischer Parameter sowie Bildparameter lag bei kappa-Werten von 0,42, 0,65 und 0,61. Die Sensitivität schwankte zwischen den Beobachtern und je nach unterschiedlicher Informationsmenge zwischen 18 und 80%, die Spezifität zwischen 41 und 89%. Durch die Präsentation von Fotos vom Unfallort ließ sich eine Steigerung der Sensitivität erzielen. Die Verschiebung der Vortest-Wahrscheinlichkeit von 50% für eine lebensbedrohliche Verletzung betrug im Falle negativer technischer Befunde maximal 40%, im positiven Fall 67%. Im Rahmen dieser umfangreichen Untersuchung unter Nutzung realer Unfälle und erfahrener Notärzte konnte erstmals gezeigt werden, dass technische Unfallparameter isoliert keine sichere Vorhersage der Verletzungsschwere zulassen. Ob technische Parameter zusammen mit medizinischen Parametern eine verbesserte erste Einschätzung ermöglichen, muss Ziel weiterer Untersuchungen sein.
LASP-1 (LIM und SH3 Protein 1) ist ein aktinbindendes Struktur- und Signalprotein. Es spielt eine Rolle bei der Migration, Proliferation und Differenzierung von Zellen. Im Mamma-, Ovarial- und Urothelkarzinom sowie im kolorektalen und hepatozellulären Karzinom werden Überexpressionen beschrieben, die mit klinischen Parametern korrelieren. In dieser Arbeit wurde die Lokalisation des Proteins im benignen Prostatagewebe, in der prostatischen intraepithelialen Neoplasie (PIN) und im Prostatakarzinom analysiert. Hierzu wurden Gewebeschnitte von Prostatakarzinomen von insgesamt 50 Patienten mittels Immunhistochemie und Prostatakarzinomzelllinien (DU-145, PC-3, LNCaP) mittels Immunfluoreszenz und Transfektion von LASP-GFP-Plasmiden untersucht. LASP-1 wurde im Zytoplasma und im Zellkern von Zellen nicht-neoplastischer Drüsen und Zellen der prostatischen intraepithelialen Neoplasie (PIN) exprimiert. Im Prostatakarzinom war eine heterogene LASP-1-Expression auffällig. In den Zellkernen des Prostatakarzinoms kam eine starke Immunreaktivität signifikant häufiger vor als in denen nicht-neoplastischer Zellen. Die Intensität der Immunfärbung für LASP-1 nahm mit fortschreitender Entartung der Gewebe zu, d. h. Zellen der Perineuralscheideninvasionen wiesen die stärkste Anfärbung auf. Des Weiteren war mit steigendem Gleason-Muster eine vermehrte Expression von LASP-1 in den Zellkernen der Tumorzellen zu finden. Je höher die T-Kategorie des Karzinoms war, desto mehr LASP-1 kam in den Zellkernen der Tumorzellen vor. Bei positivem Lymphknotenstatus zeigte sich vermehrt eine starke Immunreaktivität in den Zellkernen der Tumorzellen im Primärtumor. In den Prostatakarzinomzelllinien DU-145, PC-3 und LNCaP wurde LASP-1 immunzytochemisch nachgewiesen und eine Kolokalisation mit Aktin in der Zellperipherie an Zell-Zell-Kontakten, Zell-Substrat-Kontakten und Zellmembranausläufern bestätigt. Außerdem zeigte sich eine Kolokalisation von LASP-1 und Vinculin in Fokaladhäsionen und Zell-Zell-Kontakten. Die Transfektion der Zellen mit LASP-GFP-Plasmiden führte zu einer Hemmung der Zellmigration in den Prostatakarzinomzelllinien DU-145 und LNCaP, während bei PC-3-Zellen die Migration nicht durch die Transfektion beeinflusst wurde. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen folgern, dass LASP-1 eine Rolle für die Adhärenz und Motilität von Prostatakarzinomzellen spielt und ein Zusammenhang zwischen der LASP-1-Expression und der Malignität sowie klinischen Parametern des Prostatakarzinoms besteht.
Nachweis der Expression von Adrenorezeptoren auf murinen und humanen Pankreaskarzinomzelllinien
(2013)
Das Pankreaskarzinom ist eine der bösartigsten Krebserkrankungen des Menschen und gehört zu den häufigsten Krebstodesursachen. Die heute zur Verfügung stehenden Therapiemöglichkeiten sind begrenzt und nicht zufriedenstellend. Es ist umso wichtiger neue und alternative Therapieansätze zu erforschen, um in Zukunft den Patienten eine bessere Prognose und Präventionsmaßnahmen zu ermöglichen. Generell scheint Stress und die dadurch bedingte Ausschüttung von Stresshormonen eine wichtige Rolle in der Tumorpathogenese zu haben. Es konnte bereits bei einigen anderen Tumorentitäten gezeigt werden, dass Stress, vermittelt über Katecholamine und die konsekutive Aktivierung von Adrenorezeptoren zu einer Proliferation, Invasion und Migration von Tumorzellen führen kann. Ebenso konnte ein inhibitorischer Effekt auf das Tumorwachstum nach der Behandlung mit entsprechenden Antagonisten, also Adrenorezeptor-blockierenden Substanzen, beobachtet werden. Obwohl es diese Erkenntnisse bereits gibt, sind die zu Grunde liegenden Pathomechanismen auf molekularer und zellulärer Ebene nur unzureichend erforscht. Ein Verständnis gerade dieser Pathomechanismen bildet jedoch die Grundlage für die Entwicklung neuer Therapieoptionen. Die vorliegende Arbeit charakterisiert murine und humane Pankreaskarzinomzellen auf zellulärer Ebene bezüglich des Vorhandenseins von Adrenorezeptoren. Die verschiedenen Pankreaskarzinomzelllinien wurden mit drei unterschiedlichen wissenschaftlich etablierten Methoden auf die Genexpression und das Vorhandensein der Rezeptoren untersucht. Zunächst wurde mittels des Real-Time-PCR-Verfahrens die Genexpression der Rezeptoren auf den Zellen ermittelt und quantifiziert. Im folgenden Schritt wurden die Adrenorezeptoren außerdem auf Proteinebene mit Hilfe der Western Blot-Methode auf den Tumorzellen dargestellt. Abschließend konnten die Rezeptorproteine in der Immunfluoreszenzfärbung nachgewiesen und so veranschaulicht werden. Die Arbeit konnte zeigen, dass sowohl alpha- als auch beta-Rezeptoren bei den murinen und den humanen Karzinomzelllinien exprimiert werden. Zum Teil konnten Unterschiede bezüglich des Vorhandenseins der Subtypen der Adrenorezeptoren ausgemacht werden. Der beta1-Adrenorezeptor wurde nur bei den humanen Karzinomzelllinien MiaPaCa-2 und BXPC-3 nachgewiesen, wohingegen der beta2-Rezeptor bei allen untersuchten Zelllinien nachgewiesen werden konnte. Die Expression des alpha1b-Adrenorezeptor wurde bei den murinen Zelllinien 6606PDA, 6606liver und DT7265 und der humanen Zelllinie BXPC-3 nachgewiesen. Der alpha1d-Rezeptor wurde nur bei murinen Zelllinien, d.h. bei 6606PDA, 6606liver, TD1, TD2, DT7265 gefunden. Die Expression des alpha2a-Adrenorezeptors wurde mit Ausnahme der humanen Zelllinie BXPC-3 bei allen anderen untersuchten Pankreaskarzinomzelllinien nachgewiesen werden, wohingegen der alpha2b-Adrenorezeptor nur bei den humanen Zelllinien nachgewiesen werden konnte. Welche Bedeutung diesen Unterschieden in Qualität und Quantität zukommt, bleibt weiterhin offen. Sicher ist, dass jede der Pankreaskarzinomzelllinien mit Stressrezeptoren ausgestattet ist. Welche Funktion sie haben und wie groß ihre Bedeutung für die Tumorpathogenese ist, muss in weiteren Studien untersucht werden. Möglicherweise könnten die Adrenorezeptoren der Pankreastumorzellen als Angriffspunkt neuer Therapien dienen.
Das Verständnis der zellulären Funktion und der Beteiligung der Phosphatasen an der malignen Transformation hat in den letzten Jahren stark zugenommen. So konnte die regulatorische Untereinheit B56γ der PP2A als Interaktionspartner von p53 und potentieller Tumorsuppressor identifiziert werden. Weitere Studien haben den Nachweis von Mutationen der Gene PPP2R1A und PPP2R1B, die für die Untereinheit A der PP2A codieren, in verschiedenen malignen Erkrankungen erbracht. In dieser Arbeit wurde zunächst das PPP2R5C-Gen auf Mutationen in malignen T-Zell Erkrankungen untersucht. Weiter wurde der Einfluss der Expression des PPP2R5C-Wildtyps im Vergleich mit einer Fusions-mRNA aus PPP2R5C und der konstanten Region des T-Zell Rezeptors α in Jurkat- und huT-78 – Zellen auf die Apoptoserate bestimmt. Entgegen der Annahme wurde keine Mutation des Gens PPP2R5C festgestellt. Es gelang jedoch im Rahmen der Mutationsanalyse die Beschreibung einer neuen PPP2R5C-Isoform. Die Expression dieser Isoform korreliert jedoch nicht mit einem malignen Phänotyp. Die Transfektion des PPP2R5C-TRAC-Fusionstranskripts ergab im Vergleich mit dem Wildtyp eine höhere Apoptoserate, die auch in einem retroviralem Überexpressionssystem bestätigt werden konnte. Eine direkte Beteiligung des PPP2R5C-TRAC-Fusionstranskripts an der malignen Transformation wurde damit nicht gezeigt. Wahrscheinlicher ist das Entstehen eines Selektionsdrucks, wodurch apoptoseresistente Zellen einen Wachstumsvorteil erhielten. Diese Arbeit belegt, dass direkte Mutationen des PPP2R5C-Gens in malignen T-Zell- Erkrankungen nicht in hoher Frequenz vorkommen. Die tumorsuppressive Funktion der PP2A-B56γ vermittelt über p53 bedarf noch weiterer Forschung.
Die Magnetresonanztomografie (MRT) gilt als etabliertes Verfahren zur Darstellung anatomischer Strukturen und Pathologien des Auges und der Orbita. Durch eine stetige Erhöhung der Feldstärke von zunächst 1 Tesla (T) auf 1,5T und 3T und die Verwendung kleiner Oberflächenspulen war es möglich die Untersuchungszeiten zu reduzieren und die räumliche Auflösung deutlich zu verbessern. Mit der Einführung von Ultra-Hochfeld-Geräten mit einer Feldstärke von 7T ergeben sich neue Möglichkeiten der Bildgebung, insbesondere kleiner Strukturen des menschlichen Körpers wie dem Auge. Die Darstellung im Submillimeterbereich wird auch als MR-Mikroskopie bezeichnet. Alle Untersuchungen sind an einem 7.1T Kleintier-MRT der Firma Bruker (Clinscan, Bruker Biospin GmbH, Ettlingen, Deutschland) unter Verwendung kleiner Oberflächenspulen durchgeführt worden. Um die MR-Mikroskopie für das Auge zu nutzen wurden zunächst ex vivo Untersuchungen an Schweineaugen durchgeführt um die einzelnen Sequenzparameter Echozeit (TE), Relaxationszeit (TR), Bandbreite (Bw) und Matrix systematisch zu optimieren. Als Ziel wurde ein möglichst hohes Signal-zu-Rausch-Verhältnis (SNR) der einzelnen Strukturen des Bulbus verwendet. Es zeigte sich, dass eine optimale Untersuchungssequenz immer ein Kompromiss aus maximal zu erreichender Auflösung und Messzeit ist. Als optimale Parameter für eine T2-gewichtete Sequenz ergaben sich eine TE-Zeit von ca. 25 ms und eine TR-Zeit von 4500 ms, bei möglichst kleinem FOV und großer Matrix. Im Anschluss wurde die Methode zur Untersuchung verschiedener intraokularer Implantate wie eines Glaukomstents und verschiedener Linsenersatzverfahren im Rahmen der experimentellen ophthalmologischen Chirurgie zunächst ex vivo und dann in vivo im Kaninchenmodell etabliert. Es konnte gezeigt werden, dass eine Darstellung eines Glaukomstents sowohl ex als auch in vivo im Submillimeterbereich verzerrungsfrei möglich ist. Der Fluss über den Stent konnte indirekt nachgewiesen werden, eine Quantifizierung gelang nicht. Auch die Darstellung verschiedener Linsenersatzverfahren wie die Einbringung eines künstlichen Polymers in den Kapselsack oder die Implantation unterschiedlicher künstlicher Intraokularlinsen war möglich. Der ausgeprägte Chemical Shift Artefakt konnte durch eine Variation der Bandbreite verringert werden. Die verzerrungsfreie und hochauflösende Darstellung der Linse gelingt sowohl vor als auch nach chirurgischer Intervention und ermöglicht somit eine exakte OP-Planung sowie eine hervorragende Kontrolle des Ergebnisses. Es wurden verschiedene humane Augen ex vivo mit unterschiedlichen pathologischen Raumforderungen nach klinisch indizierter Enukleation im Ultra-Hochfeld untersucht. Die Raumforderungen konnten so hochauflösend dargestellt werden, dass eine Beurteilung der Binnenstruktur, der exakten Ausdehnung und auf Grund des unterschiedlichen Signalverhaltens auch die Infiltration der umgebenden Strukturen möglich war. Es zeigte sich eine hervorragende Korrelation mit den anschließend angefertigten histologischen Präparaten. Die gewonnen Ergebnisse konnten auf ein humanes in vivo-Modell übertragen werden. Erste Ergebnisse wurden bereits als Poster auf dem ISMRM 2013 veröffentlicht.
Hintergrund: Interspinöse Implantate werden in der Behandlung lumbaler Spinalkanalstenosen und segmentaler Instabilität im Bereich der Lendenwirbelsäule eingesetzt. Ein Vertreter ist der 1986 von Jaques Sénégas entwickelte Wallis®-Spacer (Abbott, Bordeaux, Frankreich). Durch Einschränkung des Bewegungsumfanges des betroffenen Bewegungssegmentes wird eine dynamische Stabilisierung erreicht. In Studien sind für verschiedene interspinöse Implantate kurzfristig gute Ergebnisse in der Schmerzreduktion und Funktionalität belegt. Neben Studien der Entwickler selbst, mangelt es an längerfristigen Ergebnissen nach Implantation interspinöser Implantate. Zielsetzung: Ziel der Arbeit war es, klinische und radiologische Ergebnisse nach einem Mindestbeobachtungszeitraum von 24 Monaten nach Implantation des Wallis®-Spacers zu evaluieren. Studiendesign: In einer retrospektiven Kohortenstudie wurden klinische und radiologische Daten von 64 Patienten der Klinik für Orthopädie und Unfallchirurgie des Asklepios Klinikum Uckermark in Schwedt/ Oder erhoben, bei denen im Zeitraum zwischen 01/2005 und 12/2007 ein Wallis®-Spacer implantiert wurde. Material/ Methodik: Zur Beurteilung der funktionellen Beeinträchtigung sowie von Rücken- und Beinschmerzen wurden der Oswestry Disability Index (ODI) und die visuelle Analogskala (VAS) verwendet. In konventionellen Röntgenaufnahmen wurden Gesamt- und segmentaler Lordosewinkel (nach Cobb), vordere (vBSH) und hintere Bandscheibenhöhe (hBSH) sowie Olisthesebildungen bestimmt. Außerdem erfolgte die Beurteilung der Grenzflächen zwischen Implantat und Knochen. Ausschlusskriterien waren Revisionseingriffe innerhalb von 24 Monaten und fehlende radiologische Daten. Vollständige Datensätze von 21 Patienten (8 weiblich, 13 männlich, mittleres Alter 59,8 Jahre [Min. 35, Max. 79]) mit einem durchschnittlichen Beobachtungszeitraum von 44,7 Monaten (Min. 24,3; Max. 64,7) wurden ausgewertet. Ergebnisse: Die Implantation erfolgte bei der Mehrzahl der Patienten in Höhe L4/5 (n=11). Es zeigte sich keine klinisch bedeutsame Verbesserung zum Zeitpunkt der Nachuntersuchung (NU) gegenüber der präoperativen Ausgangssituation (ODI präoperativ 40,9%; NU 31,1%; VAS-Besserung: Rückenschmerz 8% [präoperativ 6,6; NU 5,8], Beinschmerz 17% [präoperativ 6,5; NU 4,8]). Ein entlordosierender Effekt auf das operierte Bewegungssegment wurde nicht nachgewiesen (präoperativ 6,1°; postoperativ 6,1°; nach Mindestbeobachtungszeitraum 5,8°). Die Bandscheibenhöhen vergrößerten sich postoperativ und verringerten sich bis zur NU (vBSH/ hBSH: präoperativ 9,4 mm/ 6,0 mm; postoperativ 10,3 mm/ 6,8 mm; NU 8,3 mm/ 4,7 mm). Radiologisch wurden im Verlauf bei 18 Patienten (85,7%) deutliche Resorptionssäume um das Implantat nachgewiesen. Bei fünf Patienten (23,8%) bildeten sich radiologisch nachweisbare Ossifikationen um das Implantat. Angrenzend an das Implantat ereigneten sich bei zwei Patienten (9,5%) Dornfortsatzfrakturen. Bei 6 Patienten (28,6%) wurde zum Zeitpunkt der Nachuntersuchung die Indikation für eine Revisionsoperation gestellt. Diskussion: Die vorliegende Arbeit ist als retrospektive Studie mit fehlender Kontrollgruppe, kleiner Patientenkohorte, breitem Nachuntersuchungsintervall und Einschluss verschiedener Operationsverfahren in ihrer Aussagekraft limitiert. Es ließ sich im Nachuntersuchungszeitraum von mehr als 24 Monaten röntgenologisch kaum ein Einfluss auf das Bewegungssegment nachweisen. Die klinische Verbesserung blieb gering. Im Verlauf kam es zur Ausbildung von Resorptionssäumen und eine bedeutsame Anzahl an Revisionsoperationen wurde notwendig. Durch die vorliegende Arbeit bleibt ungeklärt, welche Beeinflussung von dem interspinösen Spacer ausgeht. Fazit: Für eine längerfristige Verwendung des Wallis®-Spacers sollte die Indikation unter Berücksichtigung der zeitlich limitierten Wirkung im Einzelfall kritisch diskutiert werden.
Ergebnisse untersuchter Laborwerte von Patienten werden mit Referenzwerten von Gesunden abgeglichen und anhand vordefinierter Referenzbereiche ausgewertet. Mit Hilfe der damit gegebenen Information, ob sich ein gemessener Wert innerhalb der Norm – dem Referenzbereich – oder außerhalb dessen befindet, werden von Medizinern Diagnosen gestellt, Therapieentscheidungen getroffen oder der Krankheitsverlauf beurteilt. Wie aber entstehen Referenzbereiche? Wer legt sie wie fest und aufgrund welcher Daten? Was ist normal? Diese Fragen werden seit Jahrzehnten kontrovers diskutiert. Das über 25 Jahre alte, bisher größtenteils weltweit als Standard anerkannte Konzept zur Gewinnung von gesunden Referenzindividuen und der Ermittlung von Referenzgrenzen von der Internationalen Föderation für klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin (IFCC) wird aus Gründen der schlechten Praktikabilität, eines zu hohen und von kleinen Laboreinrichtungen nicht tragbaren Kosten- und Zeitaufwandes oftmals nicht angewendet. Statt eigene, laborinterne Referenzbereiche zu bestimmen werden externe Referenzgrenzen aus der Literatur oder von anderen Laboratorien übernommen – welche aber nicht die regionale Bevölkerung, wie beispielsweise in ihrer Altersstruktur, repräsentieren. Die von der IFCC befürwortete prospektive Selektion der Referenzpopulation birgt neben diesem bestehenden Um-setzungsdefizit auch das Risiko, dass für in dem Probandenkollektiv unterrepräsen-tierte Subgruppen wie Frauen, Alte und Kinder wegen zu kleiner Stichprobenumfänge gar keine beziehungsweise keine aussagekräftigen Referenzgrenzen bestimmt werden können. Vermutungen wurden geäußert – zum Beispiel seitens der Internationalen Vereinigung für theoretische und angewandte Chemie (IUPAC), dass die von der IFCC anempfohlene statistische Methode der Ermittlung der Referenzbereiche aus den Konfidenzgrenzen der Quantilschätzer speziell für kleine Stichprobengrößen keine sehr zuverlässigen und präzisen Referenzbereiche liefert. Basierend auf diesem Verständnis bestand das Untersuchungsziel darin, den effek-tivsten Ansatz und die zuverlässigste Methode zur Bestimmung von medizinischen Referenzbereichen für labordiagnostische Parameter für alle Subpopulationen – explizit die der Frauen, Kinder und alten Menschen – zu finden, die insbesondere auch auf der Grundlage von kleinen Stichprobenmengen vertrauenswürdige Referenzgrenzen liefern. Zur Erreichung des Untersuchungszieles wurden Vergleiche von ausgewählten, aus der Fachliteratur entnommenen, vorangehend im Detail erläuterten Methoden und Verfahren zur Bestimmung von Referenzbereichen an konkreten Beispielen – an Labordaten von Nieren-gesunden Patienten aus dem Universitätsklinikum Greifswald, die im Jahr 2005 aufgenommen wurden – vorgenommen. Die drei Methoden der Quantilschätzung mit Konfidenzgrenzen laut der IFCC-Richtlinien, der Toleranzschätzung gemäß der IUPAC-Empfehlung sowie der Quantilregression, in Verbindung mit dem retrospektiven Selektionsverfahren für die Gewinnung der Referenzpopulation, wurden bei den drei verschieden großen Stichprobenumfängen N = 40, N = 120 und N = 2.000 angewendet und für 29 nach den biologischen Faktoren Alter und Geschlecht stratifizierten Subgruppen sowie allgemeinen Bezugsgruppen für die drei Nierenparameter Kreatinin, Harnstoff und Natrium berechnet. Die Güte der errungenen Referenzbereiche aus den drei verschiedenen Methoden wurde hinsichtlich der zwei Kriterien Zuverlässigkeit und Präzision bewertet und mit Referenzbereichen aus dem Laborkatalog des Instituts für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin der Universitätsmedizin Greifswald abgeglichen – auch unter Berücksichtigung der ermittelten Alters- und/ oder Geschlechtseinflüsse auf die Referenzgrenzen. Anhand der gewonnenen Forschungsergebnisse konnte die Forschungsfrage wie folgt beantwortet werden: Zur Bestimmung von Referenzbereichen für alters- und geschlechtsunspezifische Laborparameter wie Natrium ist die Methode der parame-terfreien Toleranzschätzung, in Bezug auf eine Kombination mit dem retrospektiven Ansatz zur Gewinnung der Referenzpopulation, als beste Methode zu empfehlen. Zur Bestimmung von Referenzbereichen für alters- und/ oder geschlechtsspezifische Laborparameter wie Kreatinin oder Harnstoff ist die Methode der Quantilregression, in Bezug auf eine Kombination mit dem retrospektiven Ansatz zur Gewinnung der Referenzpopulation, als geeignetste Methode zu empfehlen. Die Methode der Quantilschätzung mit Konfidenzgrenzen nach dem IFCC-Konzept kann aufgrund der erarbeiteten Forschungsergebnisse zur Bestimmung von Referenzbereichen, in Bezug auf eine Kombination mit dem retrospektiven Ansatz zur Gewinnung der Referenzpopulation, nicht empfohlen werden. Beide als empfehlenswert herausgestellten Methoden sind auch für kleine Stichproben ab N = 40 anwendbar.
Im Rahmen einer Beobachtungsstudie wurden in der Kiefergelenksprechstunde 34 Patienten, die Symptome einer craniomandibulären Dysfunktion (CMD) aufwiesen, untersucht und einen Monat lang entweder nur mit der konventionellen Therapie oder mit zusätzlicher Gabe von Oxaceprol (3 x AHP 200®) behandelt. Nach einem Monat zeigte sich, dass sowohl die subjektive, als auch die objektive Symptomatik durch Oxaceprol positiv beeinflusst wurde. Es trat eine Linderung der CMD-Symtomatik in den beiden Kontrollgruppen ein, jedoch überwiegend schneller und stärker bei der Oxaceprolgruppe.
Massebilanzdefizite
(2013)
Kapitel 1 beschreibt Untersuchungen zu der Fragestellung, ob Matrixalterung eine Ursache für Massebilanzdefizite sein kann. Diese Vermutung blieb bislang in der Literatur unberücksichtigt und wurde nun anhand einer breit angelegten Studie überprüft. Verschiedene Fertigarzneimittel und für die Studie entwickelte Formulierungen mit PCA und E2 wurden in Klimakammern und Trockenschränken gelagert, um unterschiedliche Alterungszustände der Formulierungsmatrices zu simulieren. In definierten Zeitabständen wurden Proben hinsichtlich der PCA- und E2-Wiederfindung analysiert. Ausgewählt wurden Formulierungen mit geringen Konzentrationen der Modellsubstanzen, da dies als worst-case angesehen wurde und auch die Anforderungen für die Aufklärung von Massebilanzdefiziten bei sehr gering dosierten Arzneimitteln stetig steigen. Im vorliegenden Fall konnte bei 67 % aller untersuchten Proben eine signifikante Änderung der Wiederfindung und somit eine potentielle Ursache für Massebilanzdefizite festgestellt werden. Tritt in der Praxis ein Massebilanzdefizit auf, das mithilfe der etablierten Lösungsansätze nicht aufzuklären ist, so ist die Überprüfung der Wiederfindung der betreffenden Substanz aus der gealterten Matrixstruktur sinnvoll und kann unter Umständen eine Optimierung und ggf. Revalidierung der analytischen Methode erforderlich machen. Ausgangsgedanke für Kapitel 2 war die Tatsache, dass die chromatographische Trennung eines Arzneistoffes und aller seiner Abbauprodukte für die Aufstellung einer lückenlosen Massebilanz entscheidend ist. Die E2-Abbauprodukte delta6- und delta9,11-E2 konnten bislang im Rahmen von Stabilitätsstudien mit E2-Formulierungen nicht separat quantifiziert werden. Zum Teil wird in der Literatur delta6-E2 als Abbauprodukt, delta9,11-E2 jedoch mit dem Verweis auf sehr ähnliche Retentionszeiten lediglich als Syntheseverunreinigung angesehen, was im Gegensatz zu praktischen Erfahrungen und Untersuchungen von Vertretern der pharmazeutischen Industrie steht. Das Kapitel 2 beschreibt die Entwicklung einer chromatographischen Trennmethode für E2 und die Abbauprodukte 6alpha-E2, 6beta-E2, 6-Keto-E2, delta6-E2, beta-Equilenol und delta9,11-E2. Die Trennung aller Komponenten wurde mittels einer Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) unter der Verwendung einer pentafluorphenylierten Kieselgelphase realisiert. Praktische Anwendung konnte anhand des Marktproduktes Vagifem® gezeigt werden, für welches aufgrund der niedrigen Arzneistoffkonzentration und sehr komplexen Tablettenmatrix zunächst die Entwicklung einer geeigneten Probenvorbereitung durchgeführt wurde. Abschließend wurde die Methode hinsichtlich Selektivität, Sensitivität, Linearität, Präzision und Richtigkeit validiert. Kapitel 3 nimmt Bezug auf die Arzneimittelsicherheit von Fertigarzneimitteln unter analytischen Gesichtspunkten. Die Identität und der Verbleib eines Arzneistoffes und aller seiner Abbauprodukte sind bei der Lagerung von Arzneimitteln nicht nur unter dem Aspekt der Massebilanz von Bedeutung. Entstehen während der Lagerung genotoxische Abbauprodukte, müssen diese in engen Grenzen überwacht werden. Diese Aspekte wurden anhand des Fertigarzneimittels Paludrine® (Arzneistoff Proguanil) verdeutlicht. Zunächst wurde der Übergang des genotoxischen Abbauproduktes PCA in die Gasphase während der Lagerung bei erhöhten Temperaturen überprüft. Simultan wurde der Anstieg von PCA sowie der Proguanilgehalt in den Tabletten bestimmt, um Rückschlüsse auf die Massebilanz zu erhalten. Es konnte gezeigt werden, dass PCA unter den gewählten Bedingungen in der Gasphase über den Tabletten nachweisbar war. Der entsprechende Gehalt war jedoch in Relation zum PCA-Gehalt und Proguanilgehalt in den Tabletten vernachlässigbar gering. Ein Einfluss auf die Massebilanz konnte folglich ausgeschlossen werden. Für eine Massebilanz entscheidend sind weiterhin Kenntnisse über alle Abbauprodukte. Im Fall von Proguanil lieferte die Literatur Hinweise auf bislang unidentifizierte Abbauprodukte, für welche Strukturvorschläge erarbeitet wurden. Im Hinblick auf die Genotoxizität des Hauptabbauproduktes PCA, wurden auch für die neu vorgeschlagenen Strukturen erste toxikologische Bewertungen mittels DEREK, MCASE und Vitic erstellt. Abschließend wurde die Anwesenheit von allen Abbauprodukten in künstlich gealterten Tabletten überprüft.
Lyssavirus Matrixproteine (M) sind essentielle Komponenten im Virus-Assembly. Zusätzliche Virus RNA-Synthese regulierende und wirtszellmanipulierende Funktionen machen das M Protein zu einem zentralen Faktor der wirtszellabhängigen Virusreplikation und Pathogenese im infizierten Organismus. Damit könnte das M Protein einen wesentlichen Faktor bei der Anpassung von Lyssaviren an bestimmte Wirtsspezies darstellen und als Pathogenitätsdeterminante die spezifische Virulenz unterschiedlicher Lyssavirus Isolate begründen. Inwieweit Lyssavirus M Proteine sich tatsächlich in grundlegenden Funktionen der Virusreplikation und Wirtszellmanipulation unterscheiden, ist bisher nur unzureichend geklärt. Hier wurden M Proteine aus einem attenuierten Rabies Virus Stamm (RABV M) und aus einem fledermausassoziierten Lyssavirus (Europäische Fledermaus Lyssavirus Typ 1; EBLV 1 M) hinsichtlich funktioneller Unterschiede im Virus-Assembly und ihrer intrazellulären Lokalisation in virusinfizierten Zellen verglichen. Zusätzlich wurde durch die gezielte Insertion von Mutationen in das RABV M Protein ein stark attenuiertes RABV generiert, das eine wichtige Grundlage für die weitere Erforschung M abhängiger Mechanismen der Pathogenese und Viruseliminierung aus dem zentralen Nervensystem (ZNS) darstellt. Tatsächlich wurden mit chimären RABV M und EBLV 1 M exprimierenden Viren M abhängige Unterschiede in der Virusmorphogenese bestätigt. Eine RABV M abhängige Akkumulierung von Viruspartikel-ähnlichen Strukturen im rauen Endoplasmatischen Retikulum (rER) wurde mit der Kombination unterschiedlicher RABV und EBLV 1 M Sequenzen auf fünf C terminale Aminosäuren an den Positionen 187, 190, 192, 196 und 197 eingegrenzt. Mit der Identifizierung dieser Positionen konnte postulierte werden, dass es sich bei den beobachteten ultrastrukturellen Unterschieden nicht um Virusspezies sondern um Isolat-spezifische Unterschiede handelt, die möglicherweise einen Einfluss auf in vivo Virusreplikation und Pathogenese haben. Die vergleichende fluoreszenzmikroskopische Analyse infizierter Zellen zeigte, dass EBLV 1 M Protein im Gegensatz zum RABV M Protein an Membranen des Golgi-Apparates akkumulierte. Im Gegensatz zur Akkumulierung von Viruspartikel-ähnlichen Strukturen im rER konnte die EBLV 1 M spezifische Golgi-Apparat Lokalisation nicht auf einzelne Bereiche des M Proteins eingegrenzt werden, weshalb davon ausgegangen werden muss, dass hier die Integrität des gesamten EBLV 1 M Proteins notwendig ist. Erstmals wurden Lyssavirus M Proteine in viralen Einschlusskörpern und Zellkernen infizierter Zellen nachgewiesen. Während die Präsenz in den Einschlusskörpern ein wichtiges Element bei der Erforschung RNA-Synthese regulativer M Funktionen darstellt, können mit dem Nachweis von Lyssavirus M Proteinen im Zellkern wirtszellmanipulierende Funktionen auf nukleärer Ebene postuliert werden. Neben dem Nachweis der Proteine im Nukleus wurde mit fluoreszenzmarkiertem M Protein gezeigt, dass die Kernmembran eine Diffusionsbarriere für das M Protein darstellt und dass ein aktiver Transport in den Zellkern stattfinden muss. Zusammenfassend werden mit dieser Arbeit wichtige Erkenntnisse zu Unterschieden und Gemeinsamkeiten von Lyssavirus M Proteinen bezüglich Virusmorphogenese und wirtszellmanipulierender M Funktionen vorgelegt, die das aktuelle Verständnis der Lyssavirus Replikation vertiefen und weiterführende Arbeiten zu molekularen Mechanismen der Virusreplikation und Pathogenese ermöglichen.