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Funktionale und molekulare Charakterisierung der CRISPR/Cas9-vermittelten CCM3-Inaktivierung in humanen Endothelzellen

  • Zerebrale kavernöse Malformationen (CCMs) sind vaskuläre Fehlbildungen des zentralen Nervensystems, welche sich klinisch durch epileptische Anfälle, fokale neurologische Ausfälle und Kopfschmerzen äußern. Sie treten sowohl sporadisch als auch im Rahmen einer autosomal-dominant erblichen Form auf. Krankheitsassoziierte Varianten wurden in drei Genen beschrieben: CCM1, CCM2 und CCM3. Patienten mit pathogenen Varianten im CCM3-Gen fallen häufig durch einen schwereren Phänotyp und ein früheres Manifestationsalter auf. Der genaue Verlauf der molekularen CCM-Pathogenese ist jedoch bisher nicht ausreichend verstanden. In dieser Arbeit wurde deshalb die Entwicklung eines humanen in vitro Modells in den Fokus gestellt. Im Gegensatz zu bisher publizierten Studien, die auf einer transienten Herunterregulation von CCM3 beruhen, wurden hier die Folgen eines Langzeit-CCM3-Verlustes untersucht. Unter Verwendung der Komponenten des CRISPR/Cas9-Systems wurde ein Modell etabliert, welches die komplette Inaktivierung von CCM3 in kavernösen Endothelzellen von Trägern heterozygoter pathogener Keimbahnvarianten nachahmt. In humanen Endothelzellen führte die CRISPR/Cas9-vermittelte CCM3-Inaktivierung zu veränderten endothelialen Eigenschaften, welche die Morphologie, die Apoptoseinduktion, die Stabilität kapillarähnlicher Strukturen sowie die Sphäroidorganisation umfassen. Zudem kam es zu einer vermehrten Aktin-Stressfaserbildung. Auf molekularer Ebene war eine veränderte Expression von Genen zu beobachten, deren Produkte eine Rolle in der Regulation von Zellverbindungen, der Zellmembran oder der extrazellulären Matrix spielen. Insbesondere das unter Basalbedingungen stark in Endothelzellen exprimierte Fibronektin war signifikant herunterreguliert. Die Zugabe exogenen Fibronektins konnte die Zellmorphologie, die Sphäroidorganisation und die kortikale Anordnung des Aktin-Zytoskelettes normalisieren. Da auch nach CRISPR/Cas9-induzierter Inaktivierung von CCM1 und CCM2 diese Effekte beobachtet werden konnten, deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass der Aufbau einer intakten fibronektinhaltigen endothelialen Matrix von der Funktionalität der CCM-Proteine abhängt. Künftige Studien werden die Modulation der gestörten endothelialen Apoptoseinduktion als neuen Ansatz zur Identifizierung medikamentöser Therapieoptionen adressieren.
  • Cerebral cavernous malformations (CCMs) are vascular lesions which can cause seizures, focal neurological deficits, and headaches. They occur in a sporadic or autosomal-dominant form. Pathogenic variants have been described in three genes: CCM1, CCM2, and CCM3. A more severe phenotype and an earlier age of onset have often been observed in patients with pathogenic CCM3 variants. Our knowledge about the molecular pathomechanism of CCM is still incomplete. In contrast to previous studies that used transient knockdown strategies, the present work focuses on the long-term effects of CCM3 knockout. Using CRISPR/Cas9-mediated genome editing, a human in vitro model was established which mimics the situation in the lining endothelium of CCMs. In human endothelial cells, CRISPR/Cas9-mediated CCM3 inactivation led to changes in cell morphology, apoptosis induction, organisation of the actin cytoskeleton, and spheroid formation. Furthermore, the expression of genes coding for extracellular matrix components and cell-cell-contacts was altered. Notably, a significant downregulation of the important extracellular matrix protein fibronectin was observed. The addition of exogenous fibronectin normalised cell morphology, spheroid organisation, and cortical arrangement of the actin cytoskeleton. Since the same effects were observed after CRISPR/Cas9-induced inactivation of CCM1 and CCM2, these results indicate that the formation of an intact fibronectin-containing endothelial matrix depends on the functionality of the CCM proteins. Future studies will focus on the modulation of impaired endothelial apoptosis induction as a promising therapeutic approach.

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Metadaten
Author: Konrad Schwefel
URN:urn:nbn:de:gbv:9-opus-38603
Title Additional (English):Functional and molecular characterisation of CRISPR/Cas9-mediated CCM3 inactivation in human endothelial cells
Referee:Prof. Dr. Ute Felbor, Prof. Dr. Ingo Kurth
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2020
Date of first Publication:2020/07/16
Granting Institution:Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Date of final exam:2020/03/26
Release Date:2020/07/16
Tag:Endothelzellen, Nervensystem
Faculties:Universitätsmedizin / Institut für Humangenetik
Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Interfakultäres Institut für Genetik und Funktionelle Genomforschung
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie