Open Access

Robin Alexander Pilz

• Zerebrale kavernöse Malformationen (CCMs) sind Gefäßfehlbildungen im Gehirn oder Rückenmark und können sich klinisch aufgrund einer erhöhten Blutungsbereitschaft mit Kopfschmerzen, Gefühls- und Sprachstörungen bis hin zu Krampfanfällen äußern. Sie treten sporadisch oder im Rahmen einer autosomal-dominant erblichen Form auf. Kausale Sequenzveränderungen sind dabei in den drei Genen CCM1, CCM2 und CCM3 bekannt. Die Detektionsrate für pathogene Varianten ist mit bis zu 60 % für sporadische Fälle und mit weit über 90 % für familiäre Fälle sehr hoch. Während Genpanel-Analysen sehr verlässlich Einzelnukleotidveränderungen, kleine Insertions- und Deletionsvarianten sowie Kopienzahlveränderungen detektieren können, werden komplexe Strukturvarianten oder Veränderungen in nicht-kodierenden Regionen kaum erfasst. Diese rücken jedoch für die bisher genetisch unaufgeklärten Fälle immer mehr in den Fokus des Interesses. Diese Arbeit adressiert daher zum einen die Identifizierung neuer Strukturvarianten und deren funktionale Interpretation im Kontext der CCM-Erkrankung. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist der erstmalige Nachweis einer interchromosomalen Insertion bei einem CCM-Patienten gelungen. Die unbalancierte Insertion genomischen Materials von Chromosom 1 in die kodierende Region des CCM2-Gens konnte durch die Verbindung von bioinformatischen Auswertestrategien der Next Generation Sequencing-Genpanel-Daten, molekularzytogenetischen Analysen und einer molekularen Bruchpunktkartierung genau charakterisiert werden. Die Identifikation einer weiteren Strukturvariante, einer Deletion des Transkriptionsstarts von CCM1, verdeutlichte die Herausforderungen bei der Bewertung von Veränderungen in nicht-kodierenden Genbereichen. Für eine eindeutige Klassifikation der Variante wurden daher funktionale Analysen durchgeführt, die auf einer CRISPR/Cas9-vermittelten Nachbildung der Deletion in iPSCs und der anschließenden Differenzierung in Endothelzellen beruhte. Damit konnte gezeigt werden, dass die Deletion zu einem Verlust der CCM1 mRNA- und Proteinexpression führt. Zudem wurde in den differenzierten Endothelzellen eine für die CCM-Pathogenese charakteristische Deregulation von KLF2, THBS1, NOS3 und HEY2 beobachtet. Schließlich war es auf Basis dieser in vitro-Analysen möglich, die Variante entsprechend den ACMG-Richtlinien als wahrscheinlich pathogen zu bewerten und somit die molekulare CCM-Diagnose zu sichern. Die Verbindung des CRISPR/Cas9-Systems mit iPSCs ist nicht nur für die Variantenbewertung von großem Nutzen, sondern bietet auch das Potential zum besseren Verständnis von Krankheitsmechanismen. Ein weiterer Fokus der vorliegenden Arbeit lag daher auf der Etablierung und Verwendung iPSC-basierter Zellkulturmodelle für die CCM-Modellierung. Zunächst ist es gelungen, mehrere iPSC-Linien mit einer kompletten CRISPR/Cas9-vermittelten CCM1-, CCM2- oder CCM3-Inaktivierung zu generieren. Diese wurden anschließend für die Differenzierung in hBMEC-ähnliche Zellen und innovative dreidimensionale vaskuläre Organoide verwendet. In diesen Systemen konnte beispielsweise eindrücklich eine tumorähnliche Proliferation CCM3-defizienter Endothelzellen nachvollzogen werden, die nur in Kontakt mit Wildtyp-Zellen auftrat. RNA-Sequenzierungen in einem CCM1-basierten Knockout-Modell konnten darüber hinaus die Rolle von CCM1 als Endothel-spezifisches Suppressorgen stärken. Die im Rahmen der Arbeit etablierten Systeme werden zukünftig für weitere Fragestellungen der CCM-Pathogenese wie der endothelialen Barrierestörung eingesetzt und stellen darüber hinaus sehr gut geeignete Plattformen für die effektive Entwicklung dringend benötigter therapeutischer Ansätze dar.
• Cerebral cavernous malformations (CCMs) are vascular lesions in the brain or spinal cord. Due to an increased tendency to bleed, they can lead to headaches, sensory and speech disturbances, and even seizures. They occur sporadically or as an autosomal dominant inherited form. Causative sequence changes can be found in the three genes CCM1, CCM2, and CCM3. The detection rate for pathogenic variants is very high, up to 60 % for sporadic cases and over 90 % for familial cases. While gene panel analyses can reliably detect single nucleotide variants, small insertions or deletions, and copy number variation, complex structural variants or alterations in non-coding regions are hardly detected. However, they may explain a part of the missing heritability in CCM disease. This work, therefore, addresses the identification of new structural variants and their functional interpretation in the context of CCM disease. In this work, the first interchromosomal insertion in a CCM patient could be identified. The unbalanced insertion of genomic material from chromosome 1 into the coding region of the CCM2 gene could be precisely characterized by combining bioinformatic analyses of the next-generation sequencing gene panel data with molecular cytogenetics and molecular breakpoint mapping. The identification of another structural variant, a CCM1 transcription start site deletion, highlighted the challenges of classifying variants in non-coding gene regions. Functional analyses based on CRISPR/Cas9-mediated mimicking of the deletion in iPSCs and their differentiation into endothelial cells were therefore performed to unambiguously classify the variant. It was demonstrated that the deletion led to the loss of CCM1 mRNA and protein expression. Furthermore, the differentiated endothelial cells showed characteristic deregulation of KLF2, THBS1, NOS3, and HEY2. Finally, based on these in vitro analyses, it was possible to classify the variant as likely pathogenic according to the ACMG guidelines and thus to confirm the molecular CCM diagnosis. The combination of the CRISPR/Cas9 system with iPSCs is not only of great benefit for variant classification but also holds the potential for a better understanding of disease mechanisms. Therefore, another focus of this work was to establish and use iPSC-based cell culture systems for CCM modeling. First, several iPSC lines with complete CRISPR/Cas9-mediated inactivation of CCM1, CCM2, or CCM3 could be generated. They were used for differentiation into hBMEC-like cells and innovative three-dimensional vascular organoids. In these systems, for example, a tumor-like proliferation of CCM3-deficient endothelial cells could be impressively recapitulated, which only occurred in contact with wild-type cells. RNA sequencing analyses in a CCM1-based knockout model further supported the role of CCM1 as an endothelium-specific suppressor gene. The systems established in this work will be used to address further aspects of CCM pathogenesis, such as endothelial barrier dysfunction, and are also highly suitable platforms for the effective development of urgently needed therapeutic approaches.