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Ulrike Meyer

• Das kolorektale Karzinom stellt mit ca. 63.000 Neuerkrankungen pro Jahr die zweithäufigste Tumorerkrankung in Deutschland dar.1 Weltweit wird bis 2030 mit einem Anstieg der Inzidenz und Mortalität um 60 % gerechnet..264 Dabei steigt die Zahl der Kolonkarzinome in Schwellenländern bereits deutlich an und betrifft immer jüngere Menschen.2 Aufgrund dieser gesundheitlichen Herausforderungen ist die Entwicklung neuer Therapieverfahren von besonderem Interesse. Mit der Entdeckung einer möglichen Beteiligung von Gerinnungsproteasen an der Progression verschiedener Karzinome, darunter auch kolorektaler Erkrankungen, wurde ein neuer therapeutischer Angriffspunkt geschaffen, der im Rahmen der vorliegenden Dissertation untersucht werden sollte. Im Mittelpunkt der Arbeit steht die Wirkung des aktivierten Gerinnungsfaktors FXa und der PAR2-Aktivierung auf das Kolonkarzinom in vitro und in vivo. In vitro wurden drei verschiedene Kolonkarzinomzelllinien (murine MC38 Zellen, humane HCT116 Zellen und humane CaCo2 Zellen) vergleichend auf den Einfluss von FXa untersucht. Es konnte beobachtet werden, dass die Proliferation und Migration von MC38 Zellen durch FXa, nicht aber durch Thrombin signifikant erhöht wird. Der gleiche Effekt wird im Wound Scratch Assay nach selektiver PAR2-Aktivierung (Protease Activated Receptor 2) beobachtet, was auf einen PAR2-gesteuerten Migrationseffekt in MC38 Zellen hindeutet, da FXa seine zellulären Effekte über PAR2 vermitteln kann. Darüber hinaus kann eine Beteiligung des EGFR an dieser FXa-induzierten Migration bestätigt werden. Im Western Blot zeigt sich eine verstärkte Aktivierung der Signalmoleküle p38 MAPK, p44/42 MAPK und AKT nach FXa-Stimulation als mögliche Ursache der migratorischen und proliferativen Effekte des Gerinnungsfaktors. Der Einsatz des EGFR-Inhibitors Erlotinib zeigte eine Beteiligung des EGFR an der Aktivierung von p38 MAPK und AKT in MC38 Zellen. Die Stimulation von Kolonkarzinomzellen der Maus mit FXa führt zudem zu einer signifikant erhöhten Expression von PAR2. Die aktivierten Gerinnungsfaktoren FXa und Thrombin haben dagegen keinen Einfluss auf die Proliferationsrate von humanen HCT116 und CaCo2 Zellen in vitro. Während die Motilität von CaCo2-Zellen durch FXa und Thrombin reduziert wird, erhöhen diese die Migrationsfähigkeit von HCT116-Zellen signifikant. Die selektive PAR2-Aktivierung führt ebenso wie FXa zu einer reduzierten Motilität der CaCo2-Zellen. Dies deutet auf einen PAR2-vermittelten Effekt hin. In HCT116 Zellen löst sowohl eine PAR1- als auch eine PAR2-Aktivierung eine signifikant erhöhte Zellmigration aus. Das zugrundeliegende promigratorische Signal nach FXa-Stimulation konnte mittels Western Blot in der gesteigerten Phosphorylierung von p38 MAPK und p44/42 MAPK in CaCo2 Zellen gefunden werden. In HCT116 Zellen hatte FXa keinen Einfluss auf die Aktivierung dieser Signalmoleküle. In vivo wurde erfolgreich ein Tiermodell für die subkutane Injektion von murinen Kolonkarzinomzellen etabliert. Dabei werden eine Million MC38 Zellen in die Flanke von C57Bl/6J Wildtyp und PAR2-KO Mäusen mit C57Bl/6J Hintergrund injiziert und das Tumorwachstum über 21 Tage beobachtet. Die Ergebnisse zeigen einen entscheidenden Einfluss von PAR2 auf die Tumorentstehung. PAR2-KO Mäuse weisen nach 21 Tagen signifikant kleinere Tumore auf als ihre Wildtyp Artgenossen. PAR2-KO Tiere müssen zudem seltener aufgrund ihres Gesundheitszustandes vorzeitig aus dem Versuch genommen werden. Auffällig ist auch das größere Milzgewicht im Verhältnis zum Körpergewicht bei PAR2-KO Tieren, was auf gesteigerte Inflammationsreaktionen hindeuten könnte. Der Einsatz eines direkten FXa-Hemmers (Apixaban) in klinisch relevanten Dosierungen hat in vivo keinen signifikanten Einfluss auf die Progression des Kolonkarzinoms. Die in dieser Arbeit generierten Daten belegen vor allem die Bedeutung von PAR2 für die Progression des Kolonkarzinoms: In vitro können zum Teil starke, aber sehr unterschiedliche Effekte des aktivierten Gerinnungsfaktors FXa bzw. des aktivierten PAR2 auf kolorektale Karzinomzellen beobachtet werden. In vivo hingegen zeigt sich, dass weniger FXa als vielmehr die Aktivierung von PAR2 direkt an der Progression des kolorektalen Karzinoms beteiligt ist. Durch molekularbiologische Untersuchungen mittels PCR konnte zudem eine Beteiligung des S1P-Signalweges nachgewiesen werden. Bereits seit dem Ende des 20. Jahrhunderts ist bekannt, dass PAR1 in verschiedenen Krebsarten überexprimiert wird und direkt mit der Malignität von Tumorerkrankungen assoziiert werden kann. Auch eine steigende PAR2-Expression kann mit einem schlechteren Outcome bei Patienten mit Magen- oder Prostatakrebs in Verbindung gebracht werden.186 In der vorliegenden Arbeit konnte der Zusammenhang zwischen PAR2-Signaling und einer schlechteren Prognose im Darmkrebs-Tiermodell bestätigt werden. Die Expression des Rezeptors im Endothel oder im Gastrointestinaltrakt, in direkter Umgebung des Tumors, kann einen starken Einfluss auf das Tumorgeschehen ausüben. Die Inhibition von PAR2 oder des nachgeschalteten PAR2-Signalings könnte daher einen vielversprechenden neuen Therapieansatz beim kolorektalen Karzinom darstellen.